Το ενδογενές σύστημα των κανναβινοειδών αποτελεί ένα πολύπλοκο ενδογενές σύστημα μεταγωγής σήματος το οποίο επηρεάζει ένα σημαντικό αριθμό φυσιολογικών διεργασιών και μεταβολικών μονοπατιών του οργανισμού (Cota and Woods, 2005). Απαρτίζεται από τους διαμεμβρανικούς υποδοχείς των κανναβινοειδών (CBR), τα ενδοκανναβινοειδή και τις πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την βιοσύνθεση και την αποικοδόμηση των δεύτερων. (Petrocellis et al., 2004). Τα κανναβινοειδή παρουσιάζουν ποικιλία επιπτώσεων, όπως δυσλειτουργία στη μάθηση και μνήμη, διαφοροποίηση των συναισθηματικών καταστάσεων, μείωση κινητικού ελέγχου και αναλγησία. Αναστέλλουν τη συναπτική διαβίβαση σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου όπως ο ιππόκαμπος, ο επικλινής πυρήνας και ο προμετωπιαίος φλοιός κυρίως μέσω προσυναπτικών μηχανισμών. Το γλουταμινικό οξύ είναι ο κύριος διεγερτικός νευροδιαβιβαστής στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα των θηλαστικών. Οι γλουταμινεργικοί νευρώνες διανέμονται ευρέως στο κεντρικό νευρικό σύστημα και παίζουν ρόλο σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κωδικοποίησης των πληροφοριών, το σχηματισμό και την ανάκτηση των μνημών, τη χωρική αναγνώριση και τη διατήρηση της προσοχής (McEntee και Crook, 1993). Λόγω του ρόλου του στη συναπτική πλαστικότητα, το γλουταμινικό εμπλέκεται σε γνωσιακές λειτουργίες του εγκεφάλου, όπως η μάθηση και η μνήμη (McEntee και Crook, 1993). Το γλουταμινικό δρα στα μετασυναπτικά κύτταρα σε τρεις οικογένειες ιοντοτροπικών υποδοχέων τους NMDA, τους AMPA και τους καϊνικούς υποδοχείς, ενώ υπάρχουν, επίσης, και γλουταμινικοί μεταβολοτροπικοί υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες. Η αμυγδαλή εκτελεί ένα πρωταρχικό ρόλο στην επεξεργασία των συναισθηματικών αντιδράσεων και τη μνήμη, ενώ ο ιππόκαμπος έχει σημαντικό ρόλο στην εδραίωση των πληροφοριών από βραχυχρόνια μνήμη σε μακροχρόνια μνήμη και στη χωρική πλοήγηση. Οι δύο αυτές περιοχές είναι πλούσιες σε CB1 και NMDA υποδοχείς, ενώ τα τελευταία χρόνια, πληθώρα ερευνών υποδεικνύει ότι η έκθεση πειραματοζώων σε κανναβινοειδή επιφέρει σημαντικές αλλαγές σ’ αυτές τις δύο περιοχές. Στόχος της ερευνητικής εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης των κανναβινοειδών στο γλουταμινεργικό σύστημα, στην αμυγδαλή και τον ιππόκαμπο επίμυων. Η μελέτη επικεντώθηκε στους NMDA υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος με τη χρήση των μεθόδων της in situ υβριδοποίησης για το mRNA των NR1, NR2A και NR2B υπομονάδων του υποδοχέα και της ποσοτικής αυτοραδιογραφίας υποδοχέων, σε επίμυς που τους χορηγήθηκε WIN55212-2, ένας συνθετικός αγωνιστής του CB1 κανναβινοειδικού υποδοχέα, ο οποίος εμφανίζει παρόμοια δράση με την Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (THC), το φυσικό συστατικό του φυτού Cannabis sativa. Μελετήθηκαν τέσσερις ομάδες επίμυων όπου σε δύο από αυτές χορηγήθηκε WIN και στις υπόλοιπες δύο χορηγήθηκε ο διαλύτης του WIN, Vehicle. Στις δύο ομάδες που χορηγήθηκε WIN55212- 2 1mg/kg για 20 ημέρες, οι επίμυς της μίας ομάδας (ομάδα WIN) θανατώθηκαν 2 ώρες μετά από την τελευταία δόση ενώ οι επίμυς της άλλης ομάδας (ομάδα WIN+WITHD) θανατώθηκαν 7 ημέρες μετά την τελευταία δόση. Κατά το διάστημα αυτό δεν έγινε καμία χορήγηση ώστε να μελετηθεί αν οι επιπτώσεις της χρόνιας χορήγησης του WIN ήταν μόνιμες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μετά τη χρόνια χορήγηση του WIN τα επίπεδα έκφρασης των υπομονάδων του NMDA υποδοχέα μειώθηκαν στο ιππόκαμπο και την αμυγδαλή των επίμυων, ενώ μετά την διακοπή της χορήγησης του WIN, τα επίπεδα έκφρασης επανέχρονται. Είναι πιθανό ότι οι αλλαγές στην έκφραση και λειτουργία των υποδοχέων του γλουταμινικού που παρουσιάζονται ως προσαρμοστικές αλλαγές στο νευρικό σύστημα, να είναι ένας κοινός μηχανισμός με τον οποίο τα εθιστικά ναρκωτικά επηρεάζουν την νευρική λειτουργία. / The endocannabinoid system is a complicated endogenous signaling system that affects a variety of physiological processes and metabolic routes in human body (Cota and Woods, 2005). The endocannabinoid system includes the transmembrane cannabinoid receptors (CBR), the endocannabinoids and the enzymes that synthesize and degrade the endocannabinoids (Petrocellis et al., 2004). Cannabinoids have a variety of effects, such as impairment in learning and memory, modulation of emotional states, reduced motor control and analgesia. Cannabinoids inhibit synaptic transmission in several brain regions such as the hippocampus, nucleus accumbens and the prefrontal cortex mainly via presynaptic mechanisms. Glutamate is the most abundant excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system. The glutamatergic neurons are widely distributed in the central nervous system and play a role in many biological processes, including the coding of information, the formation and recovery of memories, the spatial recognition and maintaining the attention (McEntee και Crook, 1993). Because of its role in synaptic plasticity, glutamate is involved in cognitive functions like learning and memory in the brain. (McEntee και Crook, 1993). Glutamate activates three families of ionotropic receptors in postsynaptic cells, those are NMDA, AMPA and kainate receptors, while there are also metabotropic G proteins coupled glutamate receptors. Amygdala has a primary role in the processing of emotional reactions and memory, whereas hippocampus has an important role in the consolidation of informations from short term memory into long term memory and spatial navigation. These two brain regions contain a large number of CB1 and NMDA receptors, while recently, many studies suggest that animals treated with cannabinoids display significant changes in these two areas. The aim of this research was to study the changes in glutamatergic system in the amygdala and hippocampus of rats treated with cannabinoids. We focused on NMDA glutamate receptors, using in situ hybridization for studying the expression of NR1, NR2A and NR2B subunits and quantitative receptor autoradiography, in rats treated with WIN55212-2, a synthetic agonist of the CB1 cannabinoid receptor, which shows similar effects with delta-9-tetrahydrocannabinol (THC), a natural component of the plant Cannabis sativa. Adult rats were injected with WIN55212-2 (1mg/kg) and Vehicle. Animals received repeated administrations of WIN55212-2 1mg/kg once a day for 20 days. Animals in group WIN were sacrificed 2 hours after the last administration whereas in group WIN + WITHD were sacrificed 7 days after the last administration. During this time there was no administration of WIN so we could study whether the effects of chronic exposure were permanent. Our results demonstrate that chronic exposure to WIN55212-2 produced significant decreases in the expression of NMDA receptor's subunits in hippocampus and amygdala. These changes were reversed one week after abstinence. These adaptive synaptic changes may share common mechanisms with addictive drugs in modifying neural circuitry.

Το γλουταμινικό οξύ αποτελεί τον κύριο διεγερτικό νευροδιαβιβαστή στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα των θηλαστικών, παίζοντας σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες μάθησης και μνήμης, αλλά και σε διεργασίες διεγερσιμοτοξικότητας. Το γλουταμινικό οξύ ασκεί τις δράσεις του μέσω δύο ομάδων υποδοχέων, των ιοντοτρόπων και των μεταβοτροπικών υποδοχέων. Οι ιοντοτρόποι υποδοχείς είναι δίαυλοι ιόντων, των οποίων η ενεργοποίηση προκαλεί ταχεία διεγερτική νευροδιαβίβαση και διακρίνονται σε δύο μεγάλες υποομάδες ,τους NMDA και τους μη- NMDA υποδοχείς. Οι μεταβοτροπικοί υποδοχείς, συνδέονται με G-πρωτεΐνες και προκαλούν αργή συναπτική νευροδιαβίβαση μέσω ενεργοποίησης δεύτερων αγγελιοφόρων. Διακρίνονται σε τρεις μεγάλες ομάδες: το Group I που περιλαμβάνει τους mGluR1 και mGluR5, οι οποίοι ενεργοποιούν την Φωσφολιπάση C (PLC), το Group II που περιλαμβάνει τους mGluR 2 και 3 και το Group III που περιλαμβάνει τους mGluRs 4, 6, 7και 8, οι οποίοι ρυθμίζουν αρνητικά την αδενυλική κυκλάση. Οι μεταβοτροπικοί υποδοχείς διαδραματίζουν σημαντικό νευροτροποποιητικό ρόλο σε ολόκληρο τον εγκέφαλο και αποτελούν στόχο για θεραπευτική αγωγή διαφόρων ψυχιατρικών και νευρολογικών διαταραχών όπως το άγχος, η κατάθλιψη, το σύνδρομο του εύθραυστου Χ και η σχιζοφρένεια. Στον ιππόκαμπο, μια δομή όπου διενεργούνται διεργασίες μάθησης και μνήμης, οι mGluR5 υποδοχείς είναι οι πλέον άφθονοι από την οικογένεια των Group I Μεταβοτροπικών υποδοχέων και παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της συναπτικής πλαστικότητας και χωρικής μάθησης. Όπως έχει δειχθεί από ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες, μια από τις πιο αξιοσημείωτες επιδράσεις των mGluR5 υποδοχέων είναι η ενίσχυση των NMDA-εξαρτώμενων ρευμάτων. Η δράση τους αυτή φαίνεται να παίζει ρόλο στη δημιουργία του LTP ( μακροχρόνια συναπτική ενίσχυση), καθώς η χορήγηση του ειδικού ανταγωνιστή των mGluR5 υποδοχέων (ΜΡΕΡ) σε ιππόκαμπειους νευρώνες επίμυος, αναστέλλει την επαγωγή του LTP. Στο ραβδωτό σώμα, οι mGluR5 υποδοχείς βρίσκονται υπό τον έλεγχο των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης, με τους οποίους σχηματίζουν ετεροδιμερή συμπλέγματα Α2Α-mGluR5 υποδοχέων. Στον ιππόκαμπο, οι Α2Α υποδοχείς αδενοσίνης εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα, ενώ είναι ελάχιστα τα βιβλιογραφικά δεδομένα για την πιθανή αλληλεπίδρασή τους με τους mGluR5 υποδοχείς. Προκειμένου να διερευνήσουμε το μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου οι mGluR5 υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος ενισχύουν τα ρεύματα των NMDA υποδοχέων στον ιππόκαμπο επίμυος, εξετάσαμε την in vitro επίδραση της ενεργοποίησης των mGluR5, στο επίπεδο φωσφορυλίωσης της NR2B υπομονάδας του NMDA υποδοχέα, στα κατάλοιπα τυροσίνη-1472 και σερίνη-1303. Εν συνεχεία, διερευνήσαμε in vitro, την ενδεχόμενη αλληλεπίδραση των mGluR5 και Α2Α υποδοχέων στον ιππόκαμπο, μελετώντας την επίδραση της διέγερσης ή της αναστολής τους στην mGluR5-επαγόμενη φωσφορυλίωση των NMDA υποδοχέων. Τέλος, προκειμένου να ανιχνεύσουμε το ενδοκυττάριο μονοπάτι μεταγωγής σήματος των mGluR5 υποδοχέων στον ιππόκαμπο, εξετάσαμε την επίδραση της ενεργοποίησης των mGluR5 υποδοχέων στο επίπεδο φωσφορυλίωσης της ERK ½ κινάσης καθώς και την επίδραση της διέγερσης των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης στην ενεργοποίηση αυτή. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η διέγερση των mGluR5 υποδοχέων του γλουταμινικού οξέος με τον ειδικό αγωνιστή τους, CHPG, επάγει μια ισχυρή φωσφορυλίωση του καταλοίπου τυροσίνη- 1472 της NR2B υπομονάδας, η οποία είναι εξειδικευμένη στη θέση αυτή δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται στο κατάλοιπο σερίνη-1303. Σύμφωνα με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, η φωσφορυλίωση του καταλοίπου τυροσίνη -1472 της NR2B υπομονάδας, παίζει ρόλο στη μετακίνηση του υποδοχέα στη μεμβράνη και στην ορθή τοποθέτηση του στη σύναψη (trafficking). Συγκεκριμένα, η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή καταστέλλει την κλαθρίνη-εξαρτώμενη ενδοκυττάρωση των NMDA υποδοχέων, με αποτέλεσμα τη συσσώρευσή τους στη συναπτική μεμβράνη. Η συσσώρευση των NR2B-NMDA υποδοχέων και η σωστή τοποθέτηση τους στη συναπτική μεμβράνη προάγει τις NMDA εξαρτώμενες αποκρίσεις. Το γεγονός αυτό, συμφωνεί με τα ηλεκτροφυσιολογικά δεδομένα που δείχνουν ότι η διέγερση των mGluR5, ενισχύει τα ρεύματα των NMDA υποδοχέων και προάγει την επαγωγή του LTP στον ιππόκαμπο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, θεωρούμε ότι η φωσφορυλίωση στη τυροσίνη-1472, αποτελεί το μοριακό μηχανισμό ( ή μέρος αυτού), μέσω του οποίου η ενεργοποίηση των mGluR5 υποδοχέων προάγει τα ρεύματα των NMDA διαύλων. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι mGluR5 υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος φαίνεται να βρίσκονται υπό τον έλεγχο των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης και στον ιππόκαμπο, όπως και στο ραβδωτό σώμα, καθώς τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι φαρμακευτική αναστολή των Α2Α υποδοχέων εξασθενεί σημαντικά την 10 ικανότητα των ιπποκάμπειων mGluR5 να ελέγχουν τις NMDA-επαγόμενες απαντήσεις. Άρα στον ιππόκαμπο φαίνεται ότι οι Α2Α υποδοχείς δρουν αδειοδοτικά για τη λειτουργία των mGluR5 υποδοχέων ως προς τη ρύθμιση των NMDA-επαγόμενων απαντήσεων. Τέλος, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση των mGluR5 υποδοχέων, με το ειδικό αγωνιστή τους CHPG, στον ιππόκαμπο, επάγει τη φωσφορυλίωση της ERK 1/2 κινάσης με τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Η επαγωγή αυτή δεν υπόκειται στον έλεγχο των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης, καθώς η φαρμακευτική αναστολή τους δεν είχε επίδραση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK 1/2 κινάσης. Η λειτουργική σημασία της ενεργοποίησης αυτής δεν είναι ακόμα γνωστή και αποτελεί στόχο μελλοντικών πειραμάτων μας. / --

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης των υπομονάδων του GABAΑ υποδοχέα σε τομές από τον διαφραγματικό και τον κροταφικό ιππόκαμπο αμέσως μετά την θανάτωση του ζώου και κατά την διάρκεια της ανάπτυξης των "in vitro" οξέων κυμάτων που έχουν παρατηρηθεί μόνο σε τομές του κροταφικού ιππόκαμπου. Επιπλέον, μελετήθηκε η ποσοτική και τοπογραφική κατανομή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης με την χρήση του ραδιενεργού ιχνηθέτη [3H]-CHA (αγωνιστής των Α1 υποδοχέων) στον κροταφικό και τον διαφραγματικό ιππόκαμπο αμέσως μετά την θανάτωση του επίμυος. Η μελέτη της κατανομής των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης έδειξε ότι η δέσμευση της [3H]-CHA ήταν μικρότερη στον κροταφικό σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο με την μεγαλύτερη διαφορά να εντοπίζεται στην CA1 περιοχή. Το παραπάνω αποτέλεσμα έρχεται σε συμφωνία με την υπόθεση, ότι οι συνάψεις του κροταφικού ιππόκαμπου εμφανίζουν μεγαλύτερη πιθανότητα απελευθέρωσης γλουταμινικού οξέος σε σύγκριση με αυτές του διαφραγματικού ιππόκαμπου, καθώς οι Α1 υποδοχέων αδενοσίνης εντοπίζονται στην CA1 περιοχή κυρίως προσυναπτικά όπου ελέγχουν την απελευθέρωση γλουταμινικού οξέος. Στη συνέχεια της παρούσας μελέτης δείξαμε ότι η έκφραση του mRNA και των πρωτεϊνών για τις κυριότερες υπομονάδες του GABAA υποδοχέα είναι διαφορετική μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού ιπποκάμπου. Ειδικά, στην CA1 περιοχή του ιπποκάμπου η έκφραση των α1, β2 και γ2 υπομονάδων ήταν μικρότερη, ενώ αντίθετα η έκφραση των α2 και β1 υπομονάδων ήταν μεγαλύτερη στον κροταφικό ιπποκάμπο σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες που αφορούν την συνέκφραση των υπομονάδων στο σύμπλοκο του GABAA υποδοχέα τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι ο α1β2 υποτύπος του GABAA υποδοχέα επικρατεί στον διαφραγματικό ιππόκαμπο, ενώ ο α2β1 υπότυπος κυριαρχεί στον κροταφικό ιππόκαμπο. Η διαφορετική κατανομή των υποτύπων στους δυο πόλους του ιπποκάμπου που είναι εντονότερη στην CA1 περιοχή, μπορεί να επηρεάζει τις ιδιότητες του διαύλου (αγωγιμότητα, πλάτος και διάρκεια των IPSCs), δείχνοντας ότι οι υπότυποι του GABAA υποδοχέα που εντοπίζονται στον κροταφικό ιππόκαμπο έχουν μικρότερη ανασταλτική αποτελεσματικότητα, η οποία συμφωνεί με την μικρότερη GABAA-προερχόμενη αναστολή που έχει δειχθεί στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιππόκαμπου. Επιπλέον θα μπορούσε να εξηγήσει την μεγαλύτερη επιρρέπεια του κροταφικού ιππόκαμπου στην επιληψία. Η χαμηλότερη έκφραση του mRNA για τις α4, β3 και δ υπομονάδες του GABAA υποδοχέα στην περιοχή της οδοντωτής έλικας του κροταφικού ιπποκάμπο υποδεικνύει ότι η έκφραση του α4β3δ υποτύπου είναι μικρότερη στον κροταφικό σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Καθώς έχει δειχθεί ότι ο α4β3δ υπότυπος παίζει σημαντικό ρόλο στην τονική αναστολή στα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας, τα παραπάνω αποτέλεσμα μας πιθανώς σημαίνει ότι η τονική αναστολή είναι διαφορετική στους δυο πόλους του ιππόκαμπου. Η αύξηση της έκφρασης του mRNA της α5 υπομονάδας στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιπποκάμπου μπορεί να επηρεάζει την ικανότητα για συναπτική βραχυ- και μακρο-χρόνια πλαστικότητα η οποία έχει βρεθεί να είναι διαφορετική μεταξύ του κροταφικού και του διαφραγματικού ιπποκάμπου καθώς έχει δειχθεί ότι οι α5-υπότυποι παίζουν ρόλο σε διαδικασίες μνήμης και μάθησης. Επίσης, οι α5-υπότυποι του GABAA υποδοχέα στην CA1 περιοχή του ιππόκαμπου συμμετέχουν στην τονική αναστολή. Τα υψηλότερα επίπεδα στην έκφραση του mRNA για την α5 υπομονάδα στον κροταφικό ιππόκαμπο σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο πιθανώς υποδεικνύουν ότι η τονική αναστολή είναι διαφορετική στην CA1 περιοχή των δυο πόλων του ιππόκαμπου. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής μελετήσαμε την πιθανή συσχέτιση του GABAεργικού συστήματος με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων η οποία έχει παρατηρηθεί, σε κανονικές "in vitro" συνθήκες, μόνο σε τομές του κροταφικού ιππόκαμπου. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε αναλυτική μελέτη της έκφρασης του mRNA των υπομονάδων (α1, α2, α5, β1, β2, β3, γ2) του GABAΑ υποδοχέα σε διάφορα χρονικά διαστήματα κατά την κανονική "in vitro" διατήρηση των τομών (15min, 1, 3, 5 και 8h). Αρχικά μελετήσαμε την έκφραση των πρώιμων γονιδίων (c-fos, zif-268), που είναι δείκτες της νευρωνικής ενεργότητας, μετά από 5 ώρες κανονικής "in vitro" διατήρησης των τομών με σκοπό τη πιθανή συχέτιση της έκφρασης τους με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν και στους δυο πόλους του ιπποκάμπου παρόμοια αύξηση της έκφρασης του mRNA τόσο για το c-fos όσο και για zif-268 γεγονός που υποδηλώνει ότι γονιδιακή ενεργότητα είναι παρόμοια και όσο αφορά τα συγκεκριμένα πρώιμα γονίδια ανεξάρτητη της ανάπτυξης των "in vitro" οξέων κυμάτων. Στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιππόκαμπου παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της έκφρασης του mRNA των α1, β2 και γ2 υπομονάδων του GABAΑ υποδοχέα η οποία ξεκινάει την 1η ώρα, δηλαδή πριν την οργανωμένη εμφάνιση της αυθόρμητης δραστηριότητας, γίνεται μέγιστη στις 4 ώρες παραμονής των τομών σε Τεχνητό Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΤΕΝΥ) και συμβαδίζει χρονικά με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές σε τομές που προέρχονται από τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Έχει δειχθεί ότι οι α1-υπότυποι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανασταλτική ικανότητα του υποδοχέα. Επίσης η παρουσία της β2 υπομονάδας στον δίαυλο χαρακτηρίζει μεγαλύτερα σε πλάτος και διάρκεια ανασταλτικά ρεύματα συγκρινόμενη με τις β1 υπομονάδες. Φαίνεται λοιπόν ότι ο υπότυπος α1β2γ2, του οποίου η έκφραση αυξάνει πριν την έναρξη της οργανωμένης ρυθμικής δραστηριότητας, λόγω της συγκρότησης του από τις συγκεκριμένες υπομονάδες, έχει μεγάλη ανασταλτική αποτελεσματικότητα η οποία μπορεί να συμμετέχει στην ανάπτυξη των "in vitro" οξέων κυμάτων. Η δέσμευση της [3H]–muscimol αυξάνει σε τομές που προέρχονται μόνο από τον κροταφικό ιππόκαμπο και έχουν παραμείνει σε κανονικές "in vitro" συνθήκες για 8 ώρες σε σύγκριση με αντίστοιχες τομές που προέρχονται αμέσως μετά την θανάτωση του ζώου. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στην δέσμευση της [3H]–muscimol σε τομές που προέρχονται από τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Η αύξηση της δέσμευσης της [3H]–muscimol μόνο στις τομές που προέρχονται από τον κροταφικό ιππόκαμπο είναι σε συμφωνία με την αύξηση της έκφρασης του α1β2γ2-υποτύπου καθώς έχει δειχθεί ότι η θέση δέσμευσης της muscimol στο δίαυλο του GABAA υποδοχέα είναι μεταξύ των α1 και β2 υπομονάδων. Συμπερασματικά, η εκλεκτική αύξηση της έκφρασης του α1β2γ2-υπότυπου μόνο στην CA1 περιοχή του κροταφικού δηλώνει μεγαλύτερη ανασταλτική αποτελεσματικότητα των GABAA υποδοχέων, δεδομένου ότι ο α1β2γ2-υπότυπος προκαλεί μεγαλύτερα ανασταλτικά μετασυναπτικά ρεύματα. Το παραπάνω μπορεί να σχετίζεται με την "in vitro" εμφάνιση των οξέων κυμάτων καθώς η αυθόρμητη δραστηριότητα προέρχεται από GABAA-επαγόμενες υπερπολώσεις των πυραμιδικών κυττάρων, ενώ και η αύξηση στην έκφραση του α1β2γ2-υποτύπου συμπίπτει χρονικά με την εμφάνιση των "in vitro" οξέων κυμάτων. / The hippocampus in the rat appears grossly as an elongated structure with its long axis bending in a C-shaped manner from the septal nuclei rostrodorsally to the incipient temporal lobe caudoventrally. The long axis of the hippocampal formation is referred as the dorsoventral axis. Although hippocampus has been traditionally thought as a homogeneous structure, several studies have been demonstrated differences at several organization levels (from the behavioural to the cellular) between its dorsal (DH) and ventral (VH) pole. In the present study, we examined whether the recently reported differences in the GABA-mediated somatic inhibition between the DH and VH could be related to variations in the GABAA receptors. We therefore studied the quantitative distribution, the kinetic parameters and the subunit composition of the GABAA receptors in the two parts of hippocampus. We also studied the A1 adenosine receptors in order to examine the involvement of the adenosinergic system in the glutamate release between the two hippocampal poles. The study of [3H]-CHA binding on A1 adenosine receptors by using "in vitro" quantitative autoradiography, revealed a weaker A1 receptor binding in VH compared to DH in all regions we examined. Taken into consideration that the A1 adenosine receptors are localized in the CA1 glutamatergic terminals, these results may to some extend explain our hypothesis that synapses in the VH have greater probability of glutamate release compared to those in the DH counterpart. Recent data have demonstrated a weaker somatic GABAergic inhibition in CA1 region of VH compared to DH. We therefore examined possible differences in the GABAA receptor subunit composition and receptor binding parameters between DH and VH by using "in situ" hybridization, western blotting and the specific binding of the GABAA receptor agonist [3H]-muscimol using quantitative autoradiography and saturation experiments. The experiments demonstrated that the VH compared to DH displayed: 1) lower levels of mRNA expression for α1, β2, γ2 but higher levels for α2 and β1 subunits in CA1, CA2 and CA3, with the differences being more pronounced in CA1 region. Western blot analysis confirmed the mRNA expression data, showing lower levels for α1, β2 and higher levels for α2 subunits’ protein. Only in the CA1 region the mRNA levels of α5 were higher, while those of α4 subunit were slightly lower; in dentate gyrus, the mRNA levels of α4, β3 and δ subunits were significantly lower in VH compared to DH presumably suggesting a lower expression of the α4/β3/δ receptor subtype; 2) lower levels of [3H]-muscimol binding in the VH, with the lowest value observed in CA1, apparently resulting from weaker affinity for GABA and not from a decreased receptor density, since the KD values were higher in VH, while the Bmax values were similar between DH and VH. In conclusion, the differences in the subunit mRNA and protein expression and the lower affinity of GABAA receptor observed predominantly in CA1 region of VH, suggest that the α1 subunit-containing GABAA receptors dominate in the DH, while the α2 subunit-containing receptors prevail in VH. This could underlie the lower GABAA mediated somatic inhibition observed in VH and, to some extent, explain: a) the higher liability of VH for epileptic activity and b) the differential involvement of DH and VH in cognitive and emotional processes. Recent electrophysiological experiments have been shown that slices from the VH of adult rats generate rhythmical activity during their maintenance in the recording chamber. This activity is fully organized during the first 3 hours of in vitro maintenance and resembles the in vivo recorded hippocampal "sharp waves", therefore called "in vitro sharp waves". The field manifestation of this spontaneous activity results from GABAA receptor-mediated hyperpolarizations in pyramidal cells. The aim of the second part of the present thesis focused on the possible relationship between the characteristics of GABAA receptors and the development of "in vitro sharp waves". Using the "in situ hybridisation" technique, we examined the mRNA expression of the alpha1/2/5,beta1/2/3 and gamma2 subunits of GABAA receptor and the binding of GABAA receptor agonist [3H]-muscimol in a time course including periods before and during the development of the "in vitro sharp waves". Six sets of transversely cut DH and VH slices were prepared: slices frozen immediately after killing the animal (naive slices), and slices maintained in vitro and frozen at different time points (15min, 1, 3, 5 and 8h) during the electrophysiological experiment. The results showed: A) Upregulation of alpha1, beta2 and gamma2 subunits mRNA in VH but not in DH slices at 1h of their maintenance, which became significant at 3h as compared to the respective naive slices; B) Increase in [3H]-muscimol binding only in VH slices, obtained at 8h compared to the respective naive ones. The upregulation of the α1β2γ2 GABAA receptor subtype (starting at 1h) in VH but not in DH presumably suggests an increase in GABAergic activity, which could be related with the appearance of "in vitro sharp waves" observed only in VH; C) Τhe similar mRNA expression of the early genes c-fos and zif-268 in the two hippocampal poles showing a comparable general gene activity in DH and VH. In conclusion, the α1β2γ2 subtype dominates in DH while the α2β2-subtype prevails in VH and this could be related to the weaker somatic inhibition observed in the CA1 region of VH, and also to the distinct involvement of DH and VH in cognitive and emotional processes. Moreover, the higher expression of the GABAA receptor subtype α4β4δ in the DG of DH compared to VH may imply a higher tonic inhibition in the former hippocampal pole. The upregulation of the α1β2γ2- subtype only in VH slices during their in vitro maintenance may reflect an increase in the impact of GABAA receptor-mediated transmission, which is required for the organization of "in vitro" sharp waves.

Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Ο ιππόκαμπος στον αρουραίο είναι μια δομή σε C-σχήμα που εκτείνεται από τον διαφραγματικό πυρήνα προσθιοραχιαία έως τον κροταφικό λοβό οπισθιοκοιλιακά. Παρόλο που από παλιά θεωρείτο ως ομοιογενής δομή, έχουν παρατηρηθεί πολλές διαφορές σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού ιππόκαμπου. Οι βενζοδιαζεπίνες δρουν στις θέσεις δέσμευσης των βενζοδιαζεπινών, οι οποίες είναι αλλοστερικά συνδεδεμένες με το σύμπλοκο του GABAA, όπου ενισχύουν την δράση του GABA στους GABAA υποδοχείς, αυξάνοντας τη συχνότητα ανοίγματος του διαύλου των ιόντων χλωρίου (Cl-) και έχοντας μικρή μόνο επίδραση στο χρόνο ανοίγματος ή στην αγωγιμότητα του διαύλου. Προηγούμενη μελέτη υποδεικνύει ότι η έκφραση των α1-, β2- και γ2-υπομονάδων ήταν μικρότερη, ενώ αντίθετα η έκφραση των α2-, α5- και β1-υπομονάδων ήταν μεγαλύτερη στον κροταφικό ιπποκάμπο σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες που αφορούν την συνέκφραση των υπομονάδων στο σύμπλοκο του GABAA υποδοχέα τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι ο α1β2-υποτύπος του GABAA υποδοχέα επικρατεί στον διαφραγματικό ιππόκαμπο (ΔΙ), ενώ ο α2β1-υπότυπος κυριαρχεί στον κροταφικό ιππόκαμπο (ΚΙ). Επιπλέον, φαρμακολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η καταπραϋντική δράση της diazepam πραγματοποιείται μέσω των GABAA υποδοχέων, που περιέχουν την α1-υπομονάδα, ενώ η αγχολυτική δράση της πραγματοποιείται μέσω των υποδοχέων που φέρουν την α2-υπομονάδα. Επομένως, η μελέτη των φαρμακολογικών ιδιοτήτων των υποτύπων του GABAΑ υποδοχέα δίνει την δυνατότητα στο να σχεδιαστούν ειδικά φάρμακα τα οποία θα βελτιώνουν το κλινικό προφίλ ασθενειών, όπως το άγχος, η αϋπνία ή η επιληψία, δρώντας σε εξειδικευμένους υποτύπους του GABAΑ υποδοχέα. Ο στόχος της συγκεκριμένης εργασίας ήταν να μελετηθούν οι φαρμακολογικές ιδιότητες των υποτύπων του συμπλόκου του GABAA υποδοχέα/βενζοδιαζεπινών στον διαφραγματικό σε σύγκριση με τον κροταφικό ιππόκαμπο επίμυος. Έτσι, για τη μελέτη των θέσεων δέσμευσης των βενζοδιαζεπινών μεταξύ του διαφραγματικού και κροταφικού ιπποκάμπου χρησιμοποιήθηκε ο ευρέως φάσματος αγωνιστής των θέσεων δέσμευσης των βενζοδιαζεπινών, [3H]-flunitrazepam, σε μια αυτοραδιογραφική μελέτη. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένα φάρμακα, που δεσμεύονται σε συγκεριμένους υποτύπους του GABAA υποδοχέα, όπως το zolpidem (ειδικός αγωνιστής των GABAA υποδοχέων, που περιέχουν την α1-υπομονάδα), το etomidate (ειδικός θετικός αλλοστερικός ρυθμιστής των GABAA υποδοχέων, που περιέχουν τη β2-υπομονάδα) και το L-655,708 (ειδικός αντίστροφος αγωνιστής των GABAA υποδοχέων, που περιεχούν την α5-υπομονάδα) σε μια αυτοραδιγραφική κινητική μελέτη. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι οι τομές που προέρχονταν από τον ΚΙ συγκρινόμενες με αυτές από τον ΔΙ είχαν: Α) μειωμένη δέσμευση της [3H]-flunitrazepam στις CA1, CA3 και DG περιοχές, Β) μικρότερη χημική συγγένεια της δέσμευση της [3H]-flunitrazepam στη CA1 περιοχή, Γ) καμία διαφορά στον αριθμό των θέσεων δέσμευσης, Δ) μεγαλύτερες τιμές IC50 και EC50 για το zolpidem και το etomidate, αντίστοιχα και Ε) μικρότερες τιμές IC50 για το L-655,708. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν διαφορετικές φαραμκολογικές ιδιότητες των υποτύπων του GABAΑ/ΒΖ υποδοχέα μεταξύ του ΔΙ και ΚΙ, ενώ επιβεβαιώνεται και ενισχύεται προηγούμενη μελέτη που υποδηλώνει ότι ο α1β2-υποτύπος του GABAA υποδοχέα επικρατεί στον διαφραγματικό ιππόκαμπο (ΔΙ), ενώ ο α2β1-υπότυπος κυριαρχεί στον κροταφικό ιππόκαμπο (ΚΙ). Η μελέτη αυτή είναι πιθανό να τυγχάνει ιδιαίτερης κλινικής αξίας, στην κατεύθυνση της ακριβέστερης ρύθμισης των αποτελεσματικών δόσεων των διάφορων μορίων που δρουν στις θέσεις δέσμευσης των βενζοδιαζεπινών των α1- και α2-υποτύπων του GABAA υποδοχέα. / The hippocampus in the rat appears grossly as an elongated structure with its long axis bending in a C-shaped manner from the septal nuclei rostrodorsally to the incipient temporal lobe caudoventrally. The long axis of the hippocampal formation is referred as the dorsoventral axis. Although hippocampus has been traditionally thought as a homogeneous structure, several studies have been demonstrated differences at several organization levels (from the behavioural to the cellular) between its dorsal (DH) and ventral (VH) pole. Pharmacological studies have shown that the α1-GABAA receptor subtype is associated with the sedative and anticonvulsant effects of benzodiazepines (BZs), whereas the α2-subtype is associated with the anxiolytic effects of BZs. Recent data have demonstrated a differential distribution of the GABAA receptor subunits between DH and VH, with the α1/β2 GABAA receptor subtype dominating in the DH and the α2/β1 subtype prevailing in the VH. We therefore study possible differences in the pharmacological properties and receptor binding parameters of the GABAA/BZ receptor subtypes between DH and VH, by examining: 1a) the specific binding of [3H]-flunitrazepam (BZ sites agonist), by using quantitative autoradiography, b) the kinetic parameters of [3H]-flunitrazepam specific binding, by using the “wipe off” technique and 2) the competitive displacement of [3H]-flunitrazepam binding by using zolpidem (a specific agonist of α1-subtype) and L-655,708 (a specific inverse agonist of α5-subtype) and the enhancement of [3H]-flunitrazepam binding by using etomidate (a selective positive modulator of β2- subunit), in an autoradiographical saturation kinetic study. Our results showed in VH compared to the DH: A) lower level of [3H]-flunitrazepam binding in CA1, CA3 and DG regions, B) higher KD value for [3H]-flunitrazepam specific binding in CA1 region and no differences in the Bmax value, C) higher IC50 and EC50 values for zolpidem and etomidate, respectively and D) lower IC50 values for L-655,708. In conclusion, the lower affinity of GABAA receptors for [3H]-flunitrazepam binding, the higher IC50 and EC50 values for zolpidem and etomidate, respectively, as well as the lower IC50 values for L-655,708 observed in VH compared to DH, support the evidence that the α1/β2-GABAA receptor subtype dominates in DH and the α2/β1-subtype prevails in VH and suggest differential pharmacological effects of the benzodiazepines in DH compared to VH, which could be of clinical relevence for the more accuate adjustment of the effective dose of α1- and α2-subtype specific BZ binding sites’ ligands.

Η δραστηριότητα των Οξύαιχμων κυμάτων-Ριπιδισμών (Sharp waves-Ripples, SPWs-R) αποτελεί μια πληθυσμιακή δραστηριότητα του ιπποκάμπου που εμπλέκεται στην παγίωση της μνήμης. Η υψίσυχνη ταλάντωση των ριπιδισμών (100-200Hz) είναι αποτέλεσμα της πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ των πυραμιδικών κυττάρων και ορισμένων τύπων GABAεργικών ενδονευρώνων, μεταξύ των οποίων είναι τα καλαθοειδή κύτταρα που εκφράζουν παρβαλβουμίνη (PV-basket cells). Ο υποδοχέας για τα οπιοειδή τύπου «μ» εντοπίζεται στις απολήξεις των καλαθοειδών κυττάρων που εκφράζουν παρβαλβουμίνη, τα οποία αυξάνουν το βαθμό πυροδότησής τους ταυτόχρονα με την ταλάντωση των ριπιδισμών. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας ένα in-vitro μοντέλο των Οξύαιχμων κυμάτων-Ριπιδισμών, μελετήσαμε την επίδραση δύο εκλεκτικών αγωνιστών του υποδοχέα των οπιοειδών τύπου «μ», της φαιντανύλης (1, 5, 10, 100, 500 και 1000 nM) και της μορφίνης (5, 10, 100, 1000 και 10000 nM). Και τα δύο φάρμακα αύξησαν σημαντικά το πλάτος και μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα των SPWs με τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Επιπλέον, η μείωση της συχνότητας συνέχισε και μετά την πάροδο της μίας ώρας εφαρμογής των φαρμάκων, ενώ η αύξηση του πλάτους είχε νωρίτερα παρουσίασει φαινόμενο plateau (40-50 λεπτά). Τα δύο φάρμακα δεν μετέβαλλαν τις παραμέτρους διάρκειας των απομονομένων επεισοδίων SPWs. Στις υψηλές συγκεντρώσεις των δύο φαρμάκων η ρυθμικότητα των SPWs μειώθηκε. Τα δύο φάρμακα μείωσαν το πλάτος της ισχύος της ταλάντωσης των ριπιδισμών. Η μείωση αυτή ήταν της τάξεως του 70% στις συγκεντρώσεις άνω των 500 nM. Παρόλα αυτά, η μορφίνη σε χαμηλές συγκεντρώσεις (5 και 10 nM) αύξησε σημαντικά το πλάτος της ισχύος της ταλάντωσης των ριπιδισμών κατά 25-30%. Είναι σημαντικό ότι οι επιδράσεις των δύο οπιοειδών παρατηρήθηκαν και στις συγκεντρώσεις οι οποίες εμπίπτουν στα κλινικά θεραπευτικά πλαίσια. Οι επιδράσεις των δύο οπιοειδών ήταν πλήρως αντιστρεπτές μετά την εφαρμογή των ανταγωνιστών του υποδοχέα των οπιοειδών τύπου «μ» ναλοξόνη (20 μΜ) και CTOP (1-5 μM). Οι επιδράσεις των οπιοειδών μετά από εφαρμογή διαδοχικά αυξανόμενων συγκεντρώσεων παρουσίαζαν φαινόμενο plateau, πράγμα το οποίο οφείλεται στην απευαισθητοποίηση του υποδοχέα. Τα παραπάνω ευρήματα αποδεικνύουν τη σημαντική επίδραση της ενεργοποίησης του υποδοχέα των οπιοειδών τύπου «μ» στη δραστηριότητα Οξύαιχμων κυμάτων-Ριπιδισμών, πιθανότατα μέσω τροποποίησης του βαθμού ενεργοποίησης των ενδονευρώνων που εμπλέκονται στη γένεση αυτής της δικτυακής ταλάντωσης. Υποθέτουμε ότι η μεταβολή που προκαλούν τα οπιοειδή στην ισορροπία μεταξύ διέγερσης και αναστολής παρεμβαίνει στη γένεση της δραστηριότητας Οξύαιχμων κυμάτων-Ριπιδισμών και αυτό μπορεί να εμπλέκεται στις αμνησιακές δράσεις των οπιοειδών φαρμάκων. / Sharp wave-ripple complexes (SPW-Rs) are population activity of the hippocamus implicated in memory consolidation. The high-frequency ripple oscillation (100-200 Hz) results from the complicated interaction between pyramidal cells and some types of GABAergic interneurons, including basket PV cells. The μ opioid receptor is located at the terminals of basket PV cells which increase their firing rate in coincidence with ripple oscillation. In this study, using an in vitro model of SPW-Rs we examined the effects of two selective μ opioid receptor agonists, fentanyl (1, 5, 10, 100, 500 and 1000 nM) and morphine (5, 10, 100, 1000 and 10000 nM. All drugs significantly increased the amplitude and slowed down the rate of occurrence of SPWs in a concentration-dependent manner. Furthermore, the drug-induced rate reduction continued up to one hour of application although the effect on the amplitude reached a plateau earlier (40-50 min). None of the dugs induced a change in the duration of individual events. At relatively high concentrations the rhythmicity of SPWs was suppressed. All drugs produced suppression of the amplitude and power of the ripple oscillation. This suppressive effect was as great as 70% at concentrations greater than 500 nM. However, morphine at low concentrations (5 nM) significantly increased the ripple power by 25-30%. Importantly all the drug-induced effects were observed at drug concentrations falling into the range of clinically used values. The effects of all opioids were fully reversed upon application of the μ receptor antagonist naloxone (20 μΜ) or CTOP (1-5 μM). The drug effects following increased drug concentrations in consecutive applications reached a plateau indicating receptor desensitization. These findings show that opioids acting on the μ receptor induce significant changes in SPW-R activity presumably affecting the level of activity of those interneurons implicated in the generation of the network oscillation. We hypothesize that the opioid-induced change of the balance between excitation and inhibition interfere with the generation of SPW-R activity and this effect might be involved in the amnesic actions of the opioid substances.

Τα οξύαιχμα κύματα-ριπιδισμοί αποτελούν μία σημαντική και ενδογενή νευρική δραστηριότητα του ιπποκάμπου που εμφανίζεται κυρίως κατά το στάδιο των βραδέων κυμάτων του ύπνου και σε φάσεις ακινησίας κατά την εγρήγορση και πιστεύεται ότι διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην διαδικασία της παγίωσης της μνήμης, που εμπλέκεται στη μεταφορά της πληροφορίας από τον ιππόκαμπο στον νεοφλοιό. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιώντας καταγραφές των δυναμικών πεδίου από την CA1 περιοχή τομών του κοιλιακού πόλου του ιπποκάμπου, εξετάσαμε την επίδραση της νιφεδιπίνης, ενός ανταγωνιστή των L-τύπου τασεοελεγχόμενων διαύλων ασβεστίου, στην δραστηριότητα των οξύαιχμων κυμάτων-ριπιδισμών. Παρατηρήσαμε ότι η νιφεδιπίνη αύξησε το πλάτος των ριπιδισμών χωρίς να επηρεάζει σημαντικά την διάρκεια και τη συχνότητα της ριπιδικής ταλάντωσης. Επίσης η νιφεδιπίνη αύξησε το πλάτος των οξύαιχμων κυμάτων και προκάλεσε μία μετρημένη αύξηση στην εμφάνιση των επεισοδίων των οξύαιχμων κυμάτων. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ροή ασβεστίου διαμέσου των L-τύπου διαύλων συμμετέχει στην τροποποίηση των οξύαιχμων κυμάτων-ριπιδισμών. / Sharp wave-ripples (SWRs) are a prominent and endogenous network activity in the hippocampus occurring during slow-wave sleep, and awake immobility, and it is thought to play a critical role in process of memory consolidation implicated in the transfer of information from the hippocampal to neocortex. In the present study using recordings of field potentials from the CA1 field of ventral hippocampal slices we examined the effect of nifedipine, a blocker of voltage-dependent calcium channels of L-type, in the activity of SWRs. We observed that nifedipine increased the amplitude of ripples without significantly affecting the duration and frequency of the ripple oscillation. Also, nifedipine increased the amplitude of sharp waves and produced a moderate increase in the incidence of episodes of SWRs. These results indicate that calcium influx through L-type calcium channels participate in the modulation of SWRs.

Οι ιπποκάμπιες συνάψεις επιδεικνύουν σημαντική ικανότητα για μακρόχρονη πλαστικότητα, η οποία θεωρείται ότι είναι η βάση της μνήμης και της μάθησης. Υπάρχουν ολοένα και αυξανόμενες αποδείξεις ότι αυτή η ικανότητα διαφέρει κατά μήκος του ιπποκάμπου, με τις συνάψεις της CA1 περιοχής του κοιλιακού ιπποκάμπου να επιδεικνύουν σημαντικά μικρότερη ικανότητα για μακρόχρονη ενίσχυση (LTP) σε σύγκριση με τις αντίστοιχες συνάψεις του ραχιαίου ιπποκάμπου, όταν ενεργοποιούνται με υψηλόσυχνο ερεθισμό. Στην παρούσα εργασία, δείχνουμε ότι μία μικρή συχνότητα ερεθισμού, των 10 Hz, επάγει μακρόχρονη ενίσχυση πιο αξιόπιστα στην περιοχή CA1 του ραχιαίου απ' ό,τι του κοιλιακού ιπποκάμπου. Προτείνουμε ότι η δραστηριότητα που επάγεται από του υποδοχείς α5GABAA παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση του κατωφλίου επαγωγής του LTP ειδικά στις συνάψεις της περιοχής CA1 του κοιλιακού ιπποκάμπου. Αυτό το γεγονός μπορεί να έχει σημαντικές συνέπειες για την λειτουργική εξειδίκευση κατά μήκος του ιπποκάμπου. / The hippocampal synapses display conspicuous ability for long-term plasticity which is thought to underlie learning and memory. Growing evidence shows that this ability differs along the long axis of the hippocampus, with the ventral CA1 hippocampal synapses displaying remarkably lower ability for long-term potentiation(LTP) compared with their dorsal counterpart when activated with high-frequency stimulation. Here, we show that low frequency, 10Hz stimulation induced LTP more reliably in DH than in VH CA1 field. Blockade of alpha5 subunit-containing GABAA receptors eliminated the difference between DH and VH. We propose that α5GABAA receptor-mediated activity plays a crucial role in regulating the threshold for induction of LTP especially at the ventral CA1 hippocampal synapses. This might have important implications for the functional specialization along the hippocampus.

Η λειτουργική διαφοροποίηση κατά το διαφραγματοκροταφικό άξονα του ιπποκάμπου αφορά και την επιληψία. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο ελεύθερο μαγνησίου και δυναμικά πεδίου παρατηρήσαμε πως οι επιληπτόμορφες εκφορτίσεις παρατηρούνταν πιο συχνά, είχαν μεγαλύτερη συχνότητα, διάρκεια και ένταση στις κοιλιακές τομές. Ο ανταγωνιστής των NMDA υποδοχέων AP5 μείωσε τη διάρκεια μόνο στις κοιλιακές τομές. Η προσθήκη του NMDA προκάλεσε εμμένουσες επιληπτόμορφες εκφορτίσεις στο 51% των κοιλιακών και το 9% των ραχιαίων τομών. Προτείνουμε πως οι υποδοχείς NMDA συμμετέχουν στη μεγαλύτερη ευπάθεια του κοιλιακού ιπποκάμπου τόσο στην έκφραση όσο και στη μακρόχρονη διατήρηση των επιληπτόμορφων εκφορτίσεων. Για να μελετήσουμε την επιληπτογένεση με άρση του αδενοσινεργικού τόνου, χρησιμοποιήσαμε πρωτόκολλα εκλεκτικού ή μη αποκλεισμού των αδενοσινεργικών υποδοχέων σε συνθήκες ελεύθερες μαγνησίου και καταγράψαμε αυθόρμητα ή προκλητά δυναμικά πεδίου στη CA3 σε κοιλιακές και ραχιαίες τομές. O αποκλεισμός του Α1 προκάλεσε επιληπτογένεση στο 31,13% των ραχιαίων και στο 52,76% των κοιλιακών τομών (P<0,05). Ο σύγχρονος αποκλεισμός του NMDA υποδοχέα αύξησε τα ποσοστά επιληπτογένεσης και στους δυο πόλους (76,38% στις ραχιαίες τομές vs 80,68% στις κοιλιακές τομές). Αυτή η NMDA-ανεξάρτητη επιληπτογένεση μειώθηκε σημαντικά με την προσθήκη του ανταγωνιστή των Α2 υποδοχέων κυρίως στις ραχιαίες τομές. O αποκλεισμός του Α1 υποδοχέα σε συνθήκες αποκλεισμού των NMDA υποδοχέων προκάλεσε παρόμοια αύξηση της κλίσης του fEPSP στις ραχιαίες τομές και στις κοιλιακές τομές. Ο επιπλέον αποκλεισμός των Α2 υποδοχέων επανέφερε την κλίση του fEPSP στο αρχικό της μέγεθος μόνο στις ραχιαίες τομές. Ο σύγχρονος αποκλεισμός των Α1 και Α2 υποδοχέων προκάλεσε επιληπτογένεση πρακτικά μόνο στις κοιλιακές τομές. H επιληπτογένεση αυτή ήταν μερικώς NMDA-εξαρτώμενη. Επιπλέον ενώ ο αποκλεισμός του Α1 προκάλεσε αύξηση της επιφάνειας της καμπύλης του fEPSP σε συνθήκες ελεύθερες μαγνησίου μόνο στις ραχιαίες τομές (96,15%), ο σύγχρονος αποκλεισμός των Α1 και Α2 υποδοχέων προκάλεσε αύξηση κατά 196,62% στις ραχιαίες τομές και 105,26% στις κοιλιακές τομές. Συμπεραίνουμε πως ο εκλεκτικός ή μη αποκλεισμός των υποδοχέων της αδενοσίνης προκαλεί διαφορετικά είδη επιληπτογένεσης που οφείλονται στις διαφορετικές δράσεις των υποδοχέων της αδενοσίνης και την ικανότητα του κοιλιακού ιπποκάμπου για ΝMDA-εξαρτώμενη επιληπτογένεση Χρησιμοποιώντας δυναμικά πεδίου σε κοιλιακές τομές και δυο μοντέλα επιληπτογένεσης παρατηρήσαμε πως οι σχετιζόμενες με τις επιληπτόμορφες εκφορτίσεις υψίσυχνες ταλαντώσεις και η διεγερτική νευροδιαβίβαση συμμεταβάλονται κατά τη διάρκεια της επιληπτογένεσης Παθολογικές υψίσυχνες ταλαντώσεις παρατηρήθηκαν πάντα στην NMDA-εξαρτημένη αλλά όχι και την NMDA-ανεξάρτητη επιληπτογένεση. Η διάρκεια των υψίσυχνων ταλαντώσεων συσχετίστηκε με τη διάρκεια των μεσοκριτικών εκφορτίσεων μόνο μετά την επαγωγή της επιληπτογένεσης Χρησιμοποιώντας ερεθισμό 100Hz και αυξημένη συγκέντρωση καλίου επάγαμε LTP με ερεθισμό των παράπλευρων κλάδων στη CA3 σε συνθήκες αποκλεισμού των υποδοχέων NMDA. Ο νέος τύπος του NMDA-ανεξάρτητου αυτού LTP παρουσίασε αργή ανάπτυξη στο χρόνο, δε μετέβαλε τη διευκόλυνση με σύζευξη παλμών και δεν επαγόταν με ταυτόχρονο αποκλεισμό των ευαίσθητων στη νιφεδιπίνη διαύλων ασβεστίου. Το μέγεθος του LTP ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στις ραχιαίες τομές σε σχέση με τις κοιλιακές. / Functional segregation along the dorso-ventral axis of the hippocampus refers to epilepsy too. Using the model of magnesium-free medium and field recordings, single epileptiform discharges displayed higher incidence, rate, duration and intensity in ventral compared with dorsal rat hippocampal slices. The NMDA receptor antagonist AP5 shortened the discharges in ventral slices only. At 5 and 10μΜ of NMDA application 51% of the ventral but only 9% of the dorsal slices displayed persistent epileptiform discharges. We propose that the NMDA receptors contribute to the higher susceptibility of the ventral hippocampus to expression and long-term maintenance of epileptiform discharges. To study epileptogenesis following withdrawal of adenosinergic tone we used models of selective or non-selective blockade of adenosine receptors in magnesium-free medium and we recorded spontaneous or evoked field potentials in CA3 in dorsal as well as ventral slices. Blockade of A1 resulted in epileptogenesis in 31,13% of dorsal and in 52,76% of ventral slices used (P<0,05). NMDAR blockade increased epileptogenesis scores in both poles (76,38% in dorsal slices vs 80,68% in ventral slices). This NMDAR-dependent epileptogenesis was significantly aborted by blockade of A2R more in dorsal slices. Blockade of A1R under conditions of NMDAR blockade resulted to a similar increase of fEPSP slope in dorsal and ventral slices. The additional blockade of A2R decreased fEPSP slope to its original value in dorsal slices only. Simultaneous blockade of A1 and A2 receptors induced epileptogenesis practically in ventral slices only. This epileptogenesis was partially NMDA-dependent. Futrhermore A1R blockade resulted to an increase of fEPSP area under conditions of magnesium-free medium in dorsal slices only, whereas simultaneous blockade of both A1 and A2 receptors to an increase by 196,62% in dorsal slices and by 105,26% in ventral slices. We conclude that the selective or not blockade of adenosine receptors induces different kinds of epileptogenesis and this can be attributed to the different actions of adenosine receptors and the capability of ventral hippocampus to support NMDA-dependent epileptogenesis Employing field recordings from ventral hippocampal slices and two models of epileptogenesis, we found that HFOs associated with epileptiform bursts and excitatory synaptic transmission were co-modulated during epileptogenesis Pathological HFOs>200Hz were unequivocally present in persistent bursts induced by NMDA receptor-dependent but not NMDA receptor-independent mechanisms. The duration of pathological HFOs associated with persistent bursts but not of HFOs associated with bursts before the establishment of epileptogenesis was linearly and strongly correlated with the duration of bursts. Using 100Hz trains and medium with a higher concentration of potassium cations we induced LTP by stimulating associational/commissural fibers in CA3 region under conditions of NMDA receptor blockade. This new type of NMDAR-independent LTP displayed slow kinetics, did not change paired pulse facilitation and was prevented by simultaneous blockade of nifedipine-sensitive calcium channels. The incidence as well as the amplitude of LTP was greater in dorsal slices compared to ventral ones.

Οι in vivo θ και γ ρυθμοί στον ιππόκαμπο συνυπάρχουν και θεωρείται ότι συμμετέχουν στην διαδικασία δημιουργίας και ανάκλησης των μνημονικών αναπαραστάσεων. Σε τομές ιπποκάμπου in vitro, βρήκαμε όμως ότι διαφοροποιείται η ικανότητα επαγωγής αυτών των ρυθμών στο κοιλιακό σε σχέση με το ραχιαίο άκρο του. Συγκεκριμένα, η καρβαχόλη σε συγκεντρώσεις 5-50μΜ προκάλεσε την εμφάνιση κυρίως γ ρυθμού στις κοιλιακές τομές (35/38 τομές), ενώ οι ραχιαίες τομές είτε έμειναν ρυθμικά σιωπηλές (26/48 τομές) είτε εμφάνισαν θ ρυθμική δραστηριότητα (17/48 τομές) ενώ γ δραστηριότητα εμφάνισαν σπάνια (9/48 τομές) και μόνο σε συγκεντρώσεις > 20 μΜ καρβαχόλης. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι οι τομές από κοιλιακό ιππόκαμπο συγκριτικά με αυτές από τον ραχιαίο παράγουν γ ρυθμό, πολύ πιο εύκολα, (με μικρότερη συγκέντρωση αγωνιστή) και με μεγαλύτερη συνέπεια. Αντίθετα οι ραχιαίες τομές οργανώνονται σε ρυθμική δραστηριότητα δυσκολότερα από τις κοιλιακές κι όταν το κάνουν, προτιμούν ρυθμική δραστηριότητα μικρότερης συχνότητας θ ή δ. Επίσης, δείχνουν ότι ο θ-ρυθμός δεν είναι γενικά η προτιμώμενη δραστηριότητα του ιπποκάμπου in vitro αλλά ότι η προτίμηση σε μια ρυθμική δραστηριότητα εξαρτάται από το μέρος του επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου στο οποίο αναφερόμαστε. Η ισχύς των ρυθμικών ταλαντώσεων που οργανώθηκαν μετά τη χορήγηση καρβαχόλης στις κοιλιακές τομές, συσχετίζονταν με το βαθμό ανάπτυξης της αυθόρμητης δραστηριότητας από οξέα κύματα (SPWs) στις τομές αυτές και ήταν ανάλογη. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι κοιλιακές τομές είναι ρυθμογενητικά ικανότερες συγκριτικά με τις ραχιαίες αφού η πλειοψηφία τους εμφάνισε τουλάχιστον μία ρυθμική δραστηριότητα (γ, 34/38 τομές) ενώ 17/34 τομές οργάνωσαν ταυτόχρονα διαφορετικές ρυθμικές ταλαντώσεις σε συχνότητες δ, θ ή/και β. Οι ταλαντώσεις αυτές ήταν παροδικές, ακολουθούσαν ένα ορισμένο χρονικό πρότυπο εμφάνισης και η εμφάνισή τους ήταν συσχετισμένη: η μία αποτελούσε μεταβατικό στάδιο στην εμφάνιση της επόμενης. Επειδή όλες οι ρυθμικές δραστηριότητες που οργανώθηκαν στις κοιλιακές τομές εκτός της γ, δεν συνυπήρχαν μεταξύ τους και η εμφάνισή τους ήταν εξαρτημένη, ενώ αντίθετα η γ δραστηριότητα μπορούσε να συνυπάρχει ταυτόχρονα με κάποια από αυτές, θεωρούμε ότι στις κοιλιακές τομές υπάρχουν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητοι ταλαντωτές: ένας που παράγει ρυθμική δραστηριότητα γ και ακόμα ένας τουλάχιστον που παράγει τις άλλες δραστηριότητες. / Theta and gamma rhythms coexist and are believed they participate in the formation and recall of mnemonic representations. In hippocampal slices in vitro we found different ability of carbachol to induce rhythmic activity in slices from the ventral compared to the dorsal part. Carbachol in concentrations from 5 to 50μM induced mainly gamma oscillations in ventral slices (35/38) and no oscillations (26/48) or theta oscillations in dorsal slices (17/48). Gamma oscillations in dorsal slices where induced only in concentrations grater than 20μM Carbachol and in only 9/48 slices. These data show that ventral slices organize robust gamma oscillations much easier (at a smaller agonist concentration) and with a greater incidence. In contrast dorsal slices organize more rarely oscillatory activity and when they manage to they prefer activity of a lower frequency (at theta or delta band). Our data show that theta activity is not the preferred activity of hippocampus but its preference in a certain rhythmic activity depends on the part of its longitudinal axis that we refer to. The power of oscillations in ventral hippocampus was reciprocally correlated to the degree of spontaneously organized sharp wave activity under control conditions. Ventral slices are capable of organizing a variety of oscillatory activities: they mainly organize gamma oscillations (34/38 slices), but 17/34 slices produced oscillations in delta, theta and/or beta bands. These later oscillations were transient and correlated and followed a specific temporal pattern of appearance. Because all rhythmic activities encountered in ventral slices except for gamma oscillations, were dependent but not coinciding and gamma oscillations were independent from the later but could also coincide with them, we propose that in ventral slices there exist at least two independent oscillators: one capable of producing gamma activity and at least one more capable of producing the remaining ones.

Κύριος στόχος της εργασίας ήταν η συγκριτική μελέτη της παλίνδρομης αναστολής μεταξύ του ραχιαίου και του κοιλιακού πόλου του ιππόκαμπου αρουραίου. Χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία της in vitro διατήρησης τομών ιππόκαμπου και εξωκυττάριων καταγραφών προκλητών δυναμικών πεδίου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η GABAA εξαρτώμενη παλίνδρομη αναστολή είναι ασθενέστερη, έχει μικρότερη διάρκεια και φθίνει πιο γρήγορα στον κοιλιακό σε σχέση με το ραχιαίο ιππόκαμπο. Χρησιμοποιώντας διάφορα φάρμακα που δρουν ενισχυτικά στον GABAA υποδοχέα δείξαμε ότι υπάρχει λειτουργική διαφοροποίηση του GABAA εξαρτώμενου ανασταλτικού μηχανισμού μεταξύ των δύο πόλων του ιππόκαμπου, ενισχύοντας την υπόθεση της λειτουργικής διαφοροποίησης στο επίπεδο του υποδοχέα μεταξύ των δύο πόλων. Στην in vivo μελέτη, χρησιμοποιώντας το μοντέλο επαγωγής επιληπτικών κρίσεων με χορήγηση πεντυλενοτετραζόλης, δείξαμε ότι η ενίσχυση της GABAA εξαρτώμενης αναστολής απο τα κατασταλτικά φάρμακα συσχετίζεται με το μέγεθος της αντιεπιληπτικής τους δράσης. Επιπλέον, η βιταμίνη D δεν παρουσίασε αντιεπιληπτική δράση στους C57BL/6J μύες, ούτε ενίσχυσε την αναστολή, κάτι που δείχνει ότι δεν έχει επίδραση στον GABAA υποδοχέα ή, τουλάχιστον, στους υπότυπούς του στον ιππόκαμπο. / The major aim of this work was the comparative study of recurrent inhibition between the dorsal and ventral pole of the rat hippocampus. We used the methodology of in vitro maintenance of hippocampal slices and recording of evoked field potentials. We showed that the GABAA mediated recurrent inhibition is weaker, lasts less and decays faster in ventral than in dorsal hippocampus. Using various drugs that act as positive allosteric modulators of the GABAA receptor, we showed that there is a functional differentiation of the GABAA inhibitory mechanism between the two hippocampal poles, strengthening the hypothesis of the functional differentiation at the level of the receptor between the two poles. In the in vivo study, using the pentylenetetrazole model for inducing epileptic seizures, we showed that the enhancement of the GABAA mediated recurrent inhibition correlates with the strength of antiepileptic action of the sedative drugs used. In addition vitamin D did not show antiepileptic action in C57BL/6J mice. Moreover it didn’t enhance recurrent inhibition, showing that it doesn’t have any action on the GABAA receptor or, at least, on its subtypes in hippocampus.