Λόγω της ιδιότητάς τους να ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο οι CDKs έχουν προταθεί ως μοριακοί στόχοι για την ανάπτυξη αντινεοπλασματικών φαρμάκων. Σε πολλούς τύπους καρκίνου έχει παρατηρηθεί απορρύθμιση της λειτουργίας ή μεταλλάξεις στις CDKs. Μεταξύ των CDKs, η CDK1 διαδραματίζει ιδιαίτερο ρόλο μιας και είναι επαρκής για να οδηγήσει τον κυτταρικό κύκλο. Πρόσφατα η ερευνητική μας ομάδα συνέθεσε την ένωση FM-100 (2-(αιθοξυκαρβονυλο)-9-χλωρο-πυρρολο[2,3-a]καρβαζόλιο) με εκλεκτική δράση στη CDK1 (IC50 15 μΜ για το σύμπλοκο CDK1/κυκλίνη B). Στην παρούσα μελέτη έγινε αποτίμηση της βιολογικής δραστικότητας νέων πυρρολοκαρβαζολικών ενώσεων με δομή παραπλήσια του FM-100 με σκοπό την ανακάλυψη ισχυρότερων αναστολέων και ελέχθηκε η δραστικότητά τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές in vitro. Από τα ανάλογα που ελέγχθηκαν δύο, τα SS-261Β και SS263, εμφάνισαν αυξημένη ικανότητα αναστολής της CDK1 σε σχέση με την αρχική ένωση FM-100. Η ισχυρότερη από αυτές (SS-261Β, IC50 194nΜ) μελετήθηκε σε πέντε καρκινικές σειρές. Η SS-261Β δεν είχε καμία επίδραση στο πολλαπλασιασμό λευχαιμικών κυττάρων (Κ562), ενώ στα MCF-7 (κύτταρα καρκίνου του μαστού) η SS-261Β είχε ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό η οποία ήταν εμφανής μόνο στη μεγαλύτερη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας (10μΜ). Στη σειρά HeLa (καρκινικά κύτταρα τραχήλου μήτρας) και CaCo2 (καρκινικά κύτταρα γαστρενετρικού) η SS-261Β προκάλεσε μικρότερη αναστολή (25-30%). Μεγαλύτερη αντιμιτογόνο δράση παρουσίαση η ένωση στα PC-3 (προστατικά καρκινικά κύτταρα). Αξίζει να σημειωθεί ότι η ένωση SS-261Β είχε περιορισμένη δράση σε φυσιολογικά προστατικά επιθηλιακά κύτταρα. Παράλληλα, στα PC-3 η SS-261Β προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση της ενεργότητας της κασπάσης-3 σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 10μΜ, ενδεικτική της ικανότητάς της να προάγει την απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα. Κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε στα HeLa. Συμπερασματικά, η ένωση SS-261Β έχει βελτιωμένες ιδιότητες σε σχέση με την FM-100, παρουσιάζει ανασταλτική δράση στο πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων, ενώ ταυτόχρονα διεγήρει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη in vitro. / Cyclin-dependent kinases (CDKs) have been proposed as molecular targets for anti-tumour drug development due to their ability to regulate cell cycle. In many types of cancers, deregulated expression of CDKs or mutations in CDKs have been reported. Among CDKs, CDK1 is unique, as activation of this kinase is sufficient to drive cell proliferation. Recently, our research group synthesized FM-100 (ethyl 9-chloro-1H-pyrrolo[2,3-alpha]carbazole-2-carboxylate), a compound with selective inhibitory action on CDK1 (IC50 15 μΜ for the CDK1/cyclin B complex). In the present study we evaluated the biological activity of several new pyrrolocarbazole derivatives with structures similar to that of FM-100, in order to identify more potent CDK1 inhibitors. In addition, we tested the ability of the newly synthesized FM-100 analogues to inhibit cell proliferation and survival in cancer cell lines in vitro. Only two of the tested compounds, SS-261Β and SS263, exhibited a greater inhibitory action on CDK1 activity compared to the parent compound (FM-100). The most potent of the two SS-261Β had an IC50 of 194nΜ and was further studied in cell-based assays. SS-261Β had no effect on the proliferation of leukemic cells (Κ562), while SS-261B inhibited MCF-7 (breast cancer cell line) growth only at the highest concentration used (10μΜ). In HeLa (cervical cancer cell line) and CaCo2 cells (colon cancer cell line) SS-261Β had only a modest effect, reducing proliferation by 25-30%. SS-261B had a more pronounced effect on PC-3 cells (prostate cancer cell line). It should be noted that SS-261Β also exhibited anti-mitogenic effects in normal prostate epithelial cells. In a different series of experiments we observed that SS-261B dose-dependently increased caspace-3 activity in PC-3 cells when used at concentrations over 10μΜ, suggesting that it is capable of promoting apoptosis in this cell line. In summary, SS-261Β exhibits an improved profile for CDK1 inhibition compared to FM-100, exerts anti-proliferative effects in several tumour cell lines while it also inhibits survival of prostate cancer cells in vitro.

Το κακόηθες μελάνωμα του δέρματος είναι το αποτέλεσμα της κακοήθους εξαλλαγής των μελανοκυττάρων της επιδερμίδας και χαρακτηρίζεται απο συνεχώς αυξανόμενη επίπτωση και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η αξιοσημείωτη δε ανθεκτικότητα που επιδεικνύει το προχωρημένο μεταστατικό μελάνωμα στα χημειοθεραπευτικά σχήματα και στην ακτινοθεραπεία κάνει επιτακτική την ανάγκη για νέους, πιο αποτελεσματικούς θεραπευτικούς παράγοντες. Ένας αυξανόμενος όγκος δεδομένων υποστηρίζει τη παρουσία και ενεργό συμμετοχή καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων (cancer stem cells, CSCs) στην ανάπτυξη και μετάσταση του μελανώματος. Οι μεταγραφικοί παράγοντες EZH2, SOX2 και Oct4 αποτελούν μόρια – κλειδιά στον έλεγχο του ρυθμιστικού δικτύου του stemness των εμβρυϊκών stem κυττάρων (ESCs). Είναι πλέον γνωστό ότι η χρωματίνη στα ESCs περιλαμβάνει περιοχές με «αντιμαχόμενες» τροποποιήσεις ιστονών (bivalent domain), οι οποίες φυσιολογικά σχετίζονται είτε με ενεργή (Η3Κ4me3) ή με ανενεργή κατάσταση της χρωματίνης (H3K27me3), ενώ η απορρύθμιση των επιγενετικών μηχανισμών ελέγχου σε συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους έχει συσχετισθεί με τη καρκινογένεση στον άνθρωπο. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των bivalent domain φαίνεται να έχουν οι πρωτεΐνες της οικογένειας Polycomb, και ιδιαίτερα ο EZH2 που δρα σαν μεθυλοτρανσφεράση στην επιγενετική τροποποίηση H3K27. Πρόσφατα, μια σειρά από μελέτες έδειξαν ότι CScs στη διηθητική παρυφή του όγκου ενδέχεται να συμμετέχουν ενεργά στη καρκινογένεση. Επιπλέον, η ανακάλυψη ότι η βιολογική διαδικασία της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) οδηγεί υποπληθυσμούς καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου να αποκτήσουν ιδιότητες stem κυττάρων, φαίνεται να αποτελεί τον σύνδεσμο μεταξύ μετάστασης και κατάστασης πολυδυναμίας (stemness). Σύμφωνα λοιπόν με τη θεώρηση αυτή, είναι πιθανό τα CSCs να εντοπίζονται κυρίως στη διηθητική παρυφή ενός όγκου, ενώ επιπλέον οι ιδιότητες stem κυττάρων που έχουν αποκτήσει είναι το αποτέλεσμα κυρίως της ΕΜΤ. Σε αυτό το πλαίσιο, παρουσιάζει επομένως εξαιρετικό ενδιαφέρον η προσεκτική και στοχευμένη εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης παραγόντων που σχετίζονται με τα stem κύτταρα στην διηθητική παρυφή του μελανώματος, και αυτός ήταν ένας από τους στόχους της παρούσας διαδακτορικής διατριβής. Σκοπός. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, Oct4, SOX2 όπως επίσης και την παρουσία των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 (bivalent domain) στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος. Παράλληλα, μελετήθηκε η πιθανότητα αναγνώρισης και στοχοποίησης καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων, με ιδιαίτερη έμφαση στη διηθητική παρυφή του όγκου. Υλικό και μέθοδος. Το ποσοστό κυττάρων με ανοσοθετικότητα για τα αντισώματα έναντι των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, SOX2 και Oct4 όπως επίσης και των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 εκτιμήθηκε σε 89 δείγματα ιστών από 79 ασθενείς με κακόηθες μελάνωμα 250 του δέρματος, εφαρμόζοντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Για την επιλογή των κατάλληλων δειγμάτων έγινε ανασκόπηση των αρχείων του εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών των ετών 2001 έως 2010. Από αυτό το σύνολο των 89 δειγμάτων τα 70 αφορούν πρωτοπαθές μελάνωμα δέρματος, ενώ τα υπόλοιπα 19 προέρχονται από υλικό που εξαιρέθηκε κατά τη χειρουργική εκτομή του μεταστατικού μελανώματος. Επιπλέον 14 δείγματα περιείχαν εκτός από καρκινικά κύτταρα μελανώματος και κύτταρα σπίλων. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) και H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA). Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση (Labeling Index, LI). Η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 19.0). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Πυρηνική χρώση ανιχνεύθηκε για τα αντισώματα έναντι των EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, ενώ αντίθετα βρέθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση για τους παράγοντες SOX2 και Oct4. Παρατηρήθηκε ανομοιογενές προφίλ ανοσοθετικότητας στα κύτταρα μελανώματος με σημαντικά αυξημένο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με θετική ανοσοχρώση H3K4me2 και H3K27me3 στη διηθητική παρυφή του όγκου. Αντίστοιχη τάση για αυξημένη έκφραση έδειξε και ο μεταγραφικός παράγοντας EZH2, χωρίς όμως η διαφορά να είναι στατιστικά σημαντικά, ενώ παρατηρήθηκε και σε ορισμένες μεμονωμένες περιπτώσεις με τον SOX2. Όσον αφορά τον ΕΖΗ2, βρέθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του παράγοντα στα κύτταρα μελανώματος σε σχεση με τα σπιλοκύτταρα (p=0.02). H πυρηνική έκφραση SOX2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της βασική στιβάδας (p=0.02), όπως επίσης και στα σπιλοκύτταρα συγκριτικά με τα κερατινοκύτταρα της βασικής (p=0.0016) και της υπερβασικής στιβάδας (p=0.027). Η συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης με διάφορες παραμέτρους των ασθενών έδεξε υψηλότερα επίπεδα SOX2 στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα (p=0.045), στα κύτταρα μελανώματος με πάχος όγκου κατά Breslow <1mm (p=0.023), χωρίς εξέλκωση (p=0.009) και με αριθμό μιτώσεων ≤6 μιτ/mm2 (p=0.016). Τα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης Oct4 βρέθηκαν υψηλότερα στα σπιλοκύτταρα σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα (p<0.001) αλλά και με τα κύτταρα μελανώματος (p=0.004). Η μελέτη ωστόσο της κυτταροπλασματικής ανοσοθετικότητας έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων Oct στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της υπερβασικής στιβάδας (p<0.001), όπως επίσης στα μεταστατικά σε σχέση με τα πρωτοπαθή μελανώματα (p=0.025). Αξιοσημείωτο είναι επίσης ότι το προφίλ έκφρασης του Oct4 βρέθηκε σε ορισμένες περιπτώσεις να αυξάνεται τοπικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα αγγείων εντός των μελανωμάτων. Τα μελανώματα με υψηλό επίπεδο διήθησης κατά Clark (IV-V) (p=0.038) ή μεγάλο 251 πάχος όγκου κατά Breslow (>1mm) (p<0.001) εμφάνισαν χαμηλότερο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με ανοσοθετικότητα για το αντίσωμα H3K4me2 σε σχέση με τους όγκους με μικρότερο βαθμό διήθησης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μεταστατικοί όγκοι είχαν χαμηλότερα ποσοστά θετικής ανοσοχρώσης και για τις δύο επιγενετικές τροποποιήσεις, H3K4me2 και H3K27me3, συγκριτικά με τους πρωτοπαθείς όγκους (p=0.0065 και p=0.027 αντίστοιχα). Τέλος, η ανάλυση της παράλληλης ανοσοϊστοχημικής έκφρασης στα κύτταρα μελανώματος έδειξε θετική συσχέτιση των δύο επιγενετικών τροποποιήσεων (p<0.01), όπως επίσης και μεταξύ του EZH2 και της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 (p=0.03). Ισχυρή συσχέτιση βρέθηκε παρομοίως μεταξύ των επιπέδων έκφρασης Oct4 και SOX2, τόσο για την πυρηνική όσο και την κυτταροπλασματική εντόπιση (p<0.001 και p<0.001 αντίστοιχα). Συμπεράσματα. Λαμβάνοντας υπόψη τη λειτουργική σημασία των τριών υπό μελέτη μεταγραφικών παραγόντων και του ρόλου των επιγενετικών μηχανισμών στην καρκινογένεση, τα ευρήματα μας εισηγούνται ότι οι ΕΖΗ2, SOX2, Oct4 όπως επίσης και οι επιγενετικές τροποποιήσεις Η3Κ4me3 και H3K27me3 αποτελούν εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα, και ιδιαίτερα στη διηθητική παρυφή του όγκου. Η υπόθεση αυτή πρέπει να διεριευνηθεί περαιτέρω, καθώς θα μπορούσε να αποτελέσει, σε συνδυασμό και με άλλες μελέτες, ένα μικρό βήμα προς τη κατεύθυνση της στοχευμένης αντικαρκινικής θεραπείας του μελανώματος στα πλαίσια της Ιατρικής του μέλλοντος. / Cutaneous malignant melanoma originates from melanocytes and is characterized by constantly growing incidence and mortality rates world-wide. The substantial unresponsiveness of advanced metastatic melanomas to most forms of chemotherapy and radiation indicates an urgent need for more effective agents to overcome chemoresistance. Accumulating evidence strongly suggests the presence and involvement of cancer cells with properties of stem cells (CSCs) in the initiation, progression and metastasis of malignant melanoma. EZH2, SOX2 and Oct4 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Genome-wide analyses of chromatin states of embryonic stem and progenitor cells suggest a ‘bivalent’ colocalization of the activating H3K4 methylation and the repressive H3K27me3 in development-associated genes, while the misregulation of histone modifications on specific residues actively contributes to human cancer. PcG proteins and mainly EZH2 are responsible for maintaining the balance of the bivalent chromatin domain through the methylation of H3K27. Recently a number of studies have shown that cancer cells with properties of stem cells at the tumor invasion front might be involved in the development of metastasis. The discovery that the epithelial to mesenchymal transition (EMT) generates cells with properties of stem cells and a more invasive and metastatic phenotype, brings a connection between metastasis and stem-cell state. According to this model, cells with stem cell properties are located predominantly at the invasion front of the tumor and can derive through the acquisition of transient EMT phenotype. In this context, a comparative analysis of the expression profile of putative CSC markers between the invasion front and the inner tumor mass could test this hypothesis in the case of cutaneous melanoma as well. Purpose. Taking these data into account, we performed the current study in order to evaluate the immunohistochemical expression of EZH2, SOX2 and Oct4 as well as H3K4me2 and H3K27me3, which constitute stem cell-like "bivalent"domains, in cutaneous malignant melanoma, investigating besides the potential identification of cancer cells with stem cells properties at the invasion front of the tumor. Materials and methods. Expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 was evaluated in 89 malignant melanoma (MM) lesions, deriving from 79 patients, using immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. The analyzed cases were accessioned over the time interval 2001-2010 and retrieved from an electronic database maintained by the Department of Pathology of the University General Hospital of Patras (Rion, Greece). The sample consists of 70 primary and 19 metastatic specimens. 14 specimens contained both melanoma cells and nevus cells. Analysis and comparative studies were carried out on the expression of the proteins tested in nevus cells (where existed), melanoma cells, melanoma cells at the invasion front, basal and suprabasal 253 keratinocytes as well. Polymer based technique (Envision, Dako, USA) or MACH4 Universal HRPPolymer Detection (Biocare Medical, USA) and primary antibodies against EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) and H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 19.0). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. The three markers studied, EZH2, H3K4me2 and H3K27me3, were identified in the cell nuclei of melanoma cells, nevus cells and normal epidermal keratinocytes, while SOX2 και Oct4 showed nuclear as well as cytoplastik expression. A specific distribution pattern of H3K4me2 and H3K27me3 was found, as stronger levels were localized at the invasion front of the tumor (p=0.034 and p<0.01 respectively). A similar trend was also observed for EZH2, whithout achieving however statistical significance (p=0.08), and similarly for SOX2 in a few sporadic cases. Significantly increased EZH2 immunohistochemical expression was observed in melanoma cells with respect to nevus cells (p=0.02). Nuclear SOX2 levels were also higher in melanoma cells than basal keratinocytes (p=0.02) and in nevus cells than basal keratinocytes (p=0.0016) and suprabasal keratinocytes (p=0.027). Furthermore LIs in melanoma cells presented significantly higher values in primary with respect to metastatic malignant melanoma lesions (p=0.045) as well as in melanoma cells with low Breslow’s depth (≤1mm) (p=0.023), under the absence of ulceration (p=0.009) and with low (≤6/mm2) mitotic rate (p=0.016). As well as nuclear expression of Oct4 is concerned, it was found increased in nevus cells with compared to keratinocytes (p<0.001) and melanoma cells (p=0.004). Cytoplastic expression of Oct4 followed an opposite trend, with decreasing levels in melanoma cells with respekt to suprabasal keratinocytes (p<0.001) and in metastic compared to to primary melanoma cases (p=0.025). Remarkably occasionally increased Oct4 expression in endothelial cells of the tumor microvasculature in melanoma tissues was observed. Furthermore, H3K4me2 and H3K27me3 levels were lower in metastatic with respect to primary melanoma cases (p=0.0065 and p=0.027 respectively). Advanced melanoma demonstrated significantly lower H3K4 immunohistochemical expression than cases of lowest Clark’s level (I) (p=0.038) or low Breslow’s depth (≤1 mm) (p<0.001). Moreover, EZH2 expression in melanoma cells was higher compared to nevus cells (p=0.02). Finally statistical analysis further revealed a positive correlation in melanoma cells betwenn EZH2 and H3K27me3 (p=0.03), H3K4me2 and H3K27me3 (p<0.01), as well as between Oct4 and SOX2 for both nuclear and cytoplastik expression (p<0.001 and p<0.001 respektively). Conclusions. Our results suggest the possibility that combined immunohistochemical expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 might identify cancer cells with potential stem cell properties, particularly at the invasion front of this malignancy. This hypothesis should be further investigated, as many of the epigenetic changes are reversible via pharmacologic manipulations and new CSC-directed therapies, overpassing the resistance of advanced melanoma, may be developed.

Τα stem κύτταρα είναι ένας υποπληθυσμός κυττάρων με δύο κύριες ιδιότητες: αυτοανανέωση και διαφοροποίηση. Τα stem κύτταρα διαμένουν σε ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον, την φωλεά, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ της αυτοανανέωσης και της διαφοροποίησης. Τελευταία δεδομένα εισηγούνται ότι ο καρκίνος αναπτύσσεται από ένα υποσύνολο κυττάρων με ιδιότητες ανάλογες αυτών των φυσιολογικών stem κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά αποκαλούνται καρκινικά stem κύτταρα. Η θεωρία των καρκίνικών stem κυττάρων υποστηρίζει ότι τα καρκινικά stem κύτταρα εγκαινιάζουν και συντηρούν την ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου, ευθύνονται για την κυτταρική ετερογένεια των καρκίνικών κυττάρων του όγκου, είναι υπεύθυνα για τις μεταστάσεις και παραμένουν στους ασθενείς παρά τη χρήση των συμβατικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Πρόσφατα δεδομένα πιστοποιούν την ύπαρξη καρκινικών stem κυττάρων στην ωοθήκη. / Stem cells are a subpopulation of cells with two key properties: self-renewal and differentiation. Stem cells reside in a specialized microenvironment, i.e. niche, which plays an important role in the balance between self-renewal and differentiation. Recent data suggest that cancer develops from a subset of cells with properties similar to those of normal stem cells. These cells are called cancer stem cells. Cancer stem cell hypothesis suggest that cancer stem cells initiate and preserve the growth of tumor, they are responsible for cellular heterogeneity and metastasis of tumor and they are, finally, drug-resistant.Latest data suggest the presence of cancer stem cells in the ovary.

Απο τις απαρχές της μελέτης του PAR1, είχε βρεθεί οτι βρίσκεται σε στενή συνάφεια με τον καρκίνο, με ποικιλία πειραμάτων που έγιναν σε καρκινικές σειρές και σε διάφορα πειραματικά μοντέλα ζώων. Οι σκοποί της παρούσας εργασίας μπορούν να συνοψιστούν ως εξης: Η διερεύνηση της έκφρασης του υποδοχέα 1 της θρομβίνης (PAR1) σε καρκινικές σειρές προερχόμενες από ανθρώπινους όγκους και συγκεκριμένα: Στις σειρές από καρκίνο του προστάτη PC3 και LNCaP και στις σειρές από καρκίνο του μαστού MDA-231 και MCF-7. Η διερεύνηση της λειτουργικότητας του παραπάνω υποδοχέα στις προαναφερθείσες σειρές και το αποτέλεσμα της αναστολής του υποδοχέα στην επιβίωση και στον πολλαπλασιασμό των μελετώμενων κυττάρων. Η διερεύνηση της ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης μέσω του PAR1. Και τελικά, η διερεύνηση της έκφρασης του PAR-1 σε ασθενείς που χειρουργήθηκαν για καρκίνο του πνεύμονα στην Παν/μιακη Καρδιοθωρακοχειρουργική κλινική της Πάτρας, απο τον Καθηγητή Κο Δ. Δουγένη και την ομάδα του. Ο ανταγωνιστής του PAR-1, SCH 79797, προκάλεσε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των προαναφερθέντων καρκινικών σειρών, όπως μελετήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ και την ενσωμάτωση ραδιενεργού θυμιδίνης. Αυτή η μη ειδική ανταπόκριση όλων των μελετώμενων σειρών στον SCH, αποδόθηκε κατόπιν στο γεγονός ότι αυτοί οι ανταγωνιστές δεν ήταν απολύτως εκλεκτικοί για τον PAR-1 όπως πιστευόταν, όταν σχεδιάστηκαν. Ο συγκεκριμένος ανταγωνιστής επιλέχθηκε μεταξύ των λίγων, της μοναδικής κατηγορίας που υπήρχε, όταν ξεκίνησαν τα πειράματα. Η θρομβίνη υπερδιπλασίασε τον πολλαπλασιασμό της σειράς PC3 και δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στον πολλαπλασιασμό της σειράς MDA-231. Το τελευταίο συμφωνεί και με προηγούμενη έρευνα όπου καταδείχθηκε ότι η θρομβίνη δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, αλλά μειώνει τη μεταστατικότητα της σειράς MDA-231 (Kamath et al., 2001). Η αύξηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη PC3, από τη θρομβίνη γίνεται μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα της PAR-1, και μέσω ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης, όπως φάνηκε από τα πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε ο ειδικός αγωνιστής του PAR1, το εξαπεπτίδιο SFLLRN. Από κάποια πρώτα ενδεικτικά πειράματα φαίνεται ότι η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ λαμβάνει χώρα μέσω διενεργοποίησης του EGFR, κάτι που έχει αποδειχθεί για άλλους GPCRs. Η έκφραση του PAR1 όπως μελετήθηκε με RT-PCR, σε δείγματα ασθενών που χειρουργήθηκαν για κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα καρκινικού ιστού. Η υψηλότερη έκφραση του PAR1 ανιχνεύθηκε στον ασθενή με μελάνωμα και στον ασθενή του υψηλότερου σταδίου. Φυσικά ο αριθμός των ασθενών που μελετήθηκαν δεν αρκεί για εξαγωγή συμπερασμάτων, αλλά τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν με τα γνωστά ως σήμερα ευρήματα για τον PAR1. Παραμένει να διευκρινιστεί η σημασία της αυξημένης έκφρασης του PAR1 σε ασθενείς με κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, αφού πρώτα επιβεβαιωθεί αυτή η αυξημένη έκφραση σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών. / From the onset of studies of PAR1, it has been concluded that this receptor is closely related to cancer. This relationship has been established after various experiments in cancer cell lines and in experimental animal models. The purposes of the present study can be summarized as follows: To explore the expression of PAR1 in cell lines established from human solid tumors and specifically PC3 and LNCaP from prostate cancer and MDA-231 and MCF-7 from breast cancer. To explore the suppression of PAR1 to the above cell lines in cell division. To determine if the activation of PAR1 to the above cell lines leads to MAPK phosphorylation. And ultimatilly, to explore the expression of PAR1 in patients that have been operated for tumor in lungs in Patras University Hospitall by Dr. D. Dougenis and colleagues. It was found that PAR1 is strongly expressed in highly metastatic cell lines PC3 and MDA-231, opposite to the cells LNCaP and MCF-7 that have lower metastatic capacity. The finding for the breast cancer cells MDA-231 and MCF-7 was according to published results (Kamath et al., 2001). PAR1 selective antagonist SCH 79797, reduced cell survival and DNA synthesis to all the above mentioned cell lines, independently of PAR1 expression. These non-specific results contributed to the recent fact that these antagonists were not PAR1 selective finally. Thrombin caused more than 100% induction of DNA synthesis in PC3 cells and had no effect in MDA-231 cells in accordance with published results that thrombin reduces the metastatic capacity of MDA-231 cells (Kamath et al., 2001). This effect of thrombin in PC3 cells, is mediated by activation of PAR1 as it was shown with the use of the selective agonist peptide SFLLRN. The activation of PAR1 by thrombin in PC3 cells leads to MAPK activation as it was shown by Western analysis. Furthrmore, preliminary experiments indicate that MAPK phosphorylation after PAR1 activation may be result of EGFR transactivation. In the sample tissues from patients, PAR1 expression was detected in all cancers with different ODs. The number of the samples is not enough to lead to conclusions, but there are some important observations. The highest level of PAR1 expression as was detected by RT-PCR were found to the sample tissues of the patient diagnosed for melanoma and of the patient with the most advanced stage of lung cancer. More patients shoulde be examined and more experiments to be done in order to proceed to conclusions for the significance of PAR1 in lung cancer.

Τα αστροκυττώματα αποτελούν το συχνότερο τύπο πρωτοπαθών όγκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και παραδοσιακά θεωρούνται ότι σχετίζονται με ιδιαίτερα δυσμενή πρόγνωση. Η Συστημική προσέγγιση της καρκινογένεσης, εστιάζοντας στην αποκρυπτογράφηση του τρόπου λειτουργίας και δυναμικής αλληλεπίδρασης πολύπλοκων παθοβιολογικών δικτύων, προσφέρει σήμερα καινούριες ερευνητικές προοπτικές και πιθανές εναλλακτικές, περισσότερο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές. Οι οιστρογονικοί υποδοχείς και οι συν – ρυθμιστές της μεταγραφής συνιστούν κομβικά σημεία “συνομιλίας” (cross – talk) πολύπλοκων μοριακών οδών του κυττάρου, διαμεσολαβώντας πλήθος κυτταρικών λειτουργιών φυσιολογικά αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις, ανάμεσα στις οποίες και ο καρκίνος. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2 θεωρούνται μόρια κλειδιά του ρυθμιστικού μεταγραφικού κυκλώματος που χαρακτηρίζει το stemness. Η αποσαφήνιση της συμπεριφοράς του συγκεκριμένου αυτού δικτύου στα διάφορα νεοπλάσματα και ρόλος του σε σχέση με την απόκτηση ιδιότητας καρκινικού stem κυττάρου, θεωρείται καθοριστικής σημασίας στην προσπάθεια ερμηνείας του φαινομένου του καρκίνου ως πολύπλοκο προσαρμόσιμο σύστημα, που θα αναδείξει εναλλακτικούς θεραπευτικούς στόχους και θα επιτρέψει περισσότερο αποτελεσματικές σε σχέση με τις υπάρχουσες παρεμβάσεις. Σκοπός. Υπό το πρίσμα της Συστημικής προσέγγισης της κατανόησης της κακοήθους ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, η παρούσα μελέτη διερεύνησε τα επίπεδα έκφρασης του Οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ), και των συν – ρυθμιστών AIB1, TIF2 and PELP1, όπως και την έκφραση των παραγόντων EZH2 και SOX2 σε αστροκυττώματα grade II ως IV και τη συσχέτιση μεταξύ του προφίλ έκφρασης των συγκεκριμένων παραγόντων, με κλινικοπαθολογικά δεδομένα. Υλικό και μέθοδος. Η έκφραση των πρωτεϊνών ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 και SOX2 εκτιμήθηκε σε 86 περιπτώσεις αστροκυτταρικών όγκων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Είκοσι grade II αστροκυττώματα, 22 grade III αναπλαστικά αστροκυττώματα και 46 grade IV πλειόμορφα γλοιοβλαστώματα (GBM) συμπεριλήφθησαν στη συγκεκριμένη μελέτη. Η μέθοδος με χρήση συστήματος ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, CA, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των ERβ (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) και SOX2 (R&D Systems, Inc.) χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση. Αντιπροσωπευτικές περιοχές επιλέχθηκαν κατόπιν σάρωσης του πλακιδίου σε οπτικό πεδίο μικρής μεγέθυνσης (Χ100), ενώ η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Σημαντική μείωση των επιπέδων του ERβ παρατηρήθηκε παράλληλα με την αύξηση του grade. Επιπλέον, η υψηλή ERβ έκφραση αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος θετικός προγνωστικός παράγοντας της συνολικής επιβίωσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση. Η έκφραση των AIB1, TIF2 και PELP1, δε συσχετίσθηκε με αυτή του ERβ, και ακολούθησε αντιστρόφως ανοδική τάση, παράλληλα με την αύξηση του grade. Η στατιστική ανάλυση περαιτέρω, ανέδειξε μία σημαντική αύξηση τόσο των επιπέδων EZH2 όσο και SOX2 στα grade III και IV σε σχέση με τα grade II αστροκυττώματα. Ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση των δύο δεικτών σε όλες τις κατά grade υποομάδες. Η Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε ότι, η υψηλή EZH2 και SOX2 πρωτεϊνική έκφραση συνιστούν αρνητικό παράγοντα πρόγνωσης τόσο στο σύνολο των ασθενών όσο και κατόπιν διαστρωμάτωσης κατά grade. Τέλος, η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση συνυπολογίζοντας την ηλικία, το φύλο, το grade και την έκφραση των δύο πρωτεϊνών έδειξε ότι μόνο η υψηλή EZH2 έκφραση μαζί με το υψηλό grade, αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες δυσμενούς πρόγνωσης. Συμπεράσματα. Οι παράγοντες ERβ, AIB1, TIF2 και PELP1 ενέχονται στους παθογενετικούς μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, με τον ERβ να διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο και τους AIB1, TIF2 και PELP1 να εμφανίζουν ογκο – προαγωγό δράση. Το ογκογενετικό δυναμικό των παραγόντων AIB1, TIF2 και PELP1 φαίνεται πως διαμεσολαβείται μέσω ανεξάρτητων του οιστρογονικού υποδοχέα μηχανισμών. Η έκφραση του ERβ, διαχωρίζοντας κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς ιδίου grade, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο κατά τη λήψη εξατομικευμένων κλινικών αποφάσεων. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων σε αστροκυτταρικούς όγκους, να βοηθήσουν τη βελτιστοποίηση τόσο διαγνωστικών όσο και προγνωστικών διαδικασιών στην κλινική πράξη, και να κατευθύνουν την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών θεραπείας. / Astrocytic tumors are the most common primary neoplasms of the central nervous system (CNS) and have traditionally been associated with disappointing clinical outcomes. The current challenge is to develop more efficacious and targeted therapeutic paradigms, exploiting the knowledge derived from the systems approach of understanding the complex networks underlying tumor formation and progression. Estrogen receptor beta (ERβ) and co-regulators of transcription AIB1, TIF2 and PELP1, are key components of complex cellular networks and integrate diverse signaling afferents with transcription programs controlling various physiological cellular processes and a variety of disease states including cancer. SOX2 and EZH2 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Elucidating the behavior of this particular network in cancer and its role in the formation of putative cancer stem cells is considered essential for the understanding of cancer as an adaptive complex system and subsequently allowing the discovery of more successful therapeutic designs. Purpose. In the context of the systems approach of comprehending tumorigenesis in astrocytomas, we sought to investigate the expression of ERβ and co – regulatory proteins AIB1, TIF1 and PELP1, as well as parallel expression of SOX2 and EZH2 in astrocytomas of various grades, and correlate the protein expression profiles with clinicopathological parameters and patients’ prognosis. Materials and methods. Expression of ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 and SOX2 was evaluated in 86 cases of astrocytic tumors, using Immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Twenty grade II astrocytomas, 22 grade III anaplastic astrocytomas and 46 grade IV glioblastomas multiforme (GBM) were included in this study. Polymer based technique (Envision, Dako, CA, USA) or MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) and primary antibodies against ERβ1 (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) and SOX2 (R&D Systems, Inc.) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Representative areas were selected at low power (x100) magnification. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. ERβ levels were significantly decreased with the progression of tumors’ grade. High expression of ERβ was an independent favorable prognostic factor on multivariate analysis. Expression of AIB1, TIF2 and PELP1, was not correlated to ERβ expression and followed an opposite trend, with increasing levels in grade III and IV relative to grade II tumors. Univariate survival analysis revealed that high AIB1, TIF2 and PELP1 expression was associated with worse prognosis. Statistical analysis further revealed significantly higher expression of EZH2 and SOX2 in high grade III and IV astrocytomas, compared to low grade II astrocytomas. Strong correlation between EZH2 and SOX2 was also detected within all subgroups according to grade. Kaplan-Meier showed that EZH2 and SOX2 high expression was predictive of worse overall survival in the whole cohort as well as after subgroup analysis by grade. Finally, multivariate Cox analysis that included age, gender, grade, and expression of both proteins, revealed that high EZH2 together with higher grade were strong negative prognostic factors. Conclusions. ERβ, AIB1, TIF2 and PELP1 appear to play an important role in the pathogenesis of astrocytic tumors, with ERβ exhibiting a protective effect, whereas AIB1, TIF2 and PELP1 facilitate malignant progression. AIB1, TIF2 και PELP1 contribution in tumor progression is speculated to be achieved through ERβ independent pathways. Moreover, the expression status of ERβ, by distinguish patient subpopulations with different prognosis within the same grade, could be a useful tool accommodating personalized clinical decision-making. EZH2 and SOX2 may serve as potential cancer stem cell markers in astrocytomas and as such help optimizing diagnostic and prognostic assessments and devising novel individually tailored treatment strategies.

Η υπερθερμία αποτελεί μια επικουρική μέθοδο θεραπείας του καρκίνου και η βιοϊατρική έρευνα τις τελευταίες δεκαετίες, με σκοπό την εκμετάλλευση και την ανάδειξη των ιδιοτήτων της μεθόδου, στοχεύει στην εφαρμογή της στην κλινική πράξη. Μία προσπάθεια με παρόμοιο σκοπό γίνεται τα τελευταία χρόνια στο Εργαστήριο Μικροκυμάτων και Οπτικών Ινών (ΕΜΟΙ) της σχολής Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών (ΗΜΜΥ) του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου, όπου έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί ένα σύστημα υπερθερμίας. Το προτεινόμενο σύστημα ενσωματώθηκε σε ένα τρισδιάστατο σύστημα παθητικής μικροκυματικής ραδιομετρικής απεικόνισης (ΜiRaIS) για διαγνωστικές εφαρμογές εγκεφάλου, το οποίο μελετήθηκε και κατασκευάστηκε στα πλαίσια διδακτορικής διατριβής στο ίδιο εργαστήριο της σχολής ΗΜΜΥ. Στην παρούσα διπλωματική εργασία γίνεται η θεωρητική και πειραματική μελέτη του προτεινόμενου συστήματος της υπερθερμίας. Η αρχή λειτουργίας του είναι όμοια με αυτή του MiRaIS και βασίζεται στη χρήση μια ελλειψοειδούς αγώγιμης κοιλότητας για εστίαση της ακτινοβολίας επιλεκτικά στους ιστούς που χρήζουν θεραπείας. Ο ανακλαστήρας για εστίαση, που κατασκευάστηκε και χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία, βελτιώνει την εργονομία του συστήματος, διατηρώντας παράλληλα της ιδιότητες εστίασης του πρωτότυπου ελλειψοειδούς. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε θεωρητική μελέτη και μοντελοποίηση της διάταξης με σκοπό τη βελτίωση των ιδιοτήτων εστίασής της, καθώς και πειραματικές μετρήσεις του συνολικού συστήματος υπερθερμίας-μικροκυματικής ραδιομετρίας. Στη θεωρητική μελέτη, με χρήση του λογισμικού xFDTD που βασίζεται στη μέθοδο των πεπερασμένων διαφορών στο πεδίο του χρόνου, ερευνώνται δυο μέθοδοι για τη βελτίωση των ιδιοτήτων εστίασης του συστήματος (βάθος διείσδυσης της ακτινοβολίας, χωρική διακριτική ικανότητα) με τη χρήση διηλεκτρικών υλικών. Τα υλικά αυτά τοποθετούνται στο εσωτερικό του ελλειψοειδούς καθώς και γύρω από το μοντέλο κεφαλιού ως στρώματα προσαρμογής για την επίτευξη βηματικής αλλαγής της διηλεκτρικής σταθεράς στη διεπιφάνεια αέρα-μοντέλο ανθρώπινου κεφαλιού. Στην πρώτη προσέγγιση, το εσωτερικό του ελλειψοειδούς ανακλαστήρα γεμίζει με διηλεκτρικό υλικό χαμηλών απωλειών, με τα αποτελέσματα να δείχνουν σημαντική βελτίωση της χωρικής διακριτικής ικανότητας του συστήματος. Στη δεύτερη προσέγγιση του προβλήματος, χρησιμοποιείται ένα ημισφαίριο από διηλεκτρικό γύρω από το μοντέλο κεφαλιού, με τα αποτελέσματα να δείχνουν την αντίστοιχη βελτίωση της χωρικής διακριτικής ικανότητας και παράλληλα σημαντική μείωση των ανεπιθύμητων περιοχών εστίασης της ενέργειας. Η πειραματική διάταξη τοποθετήθηκε σε ανηχοϊκό θάλαμο, όπου και πραγματοποιήθηκαν όλες οι μετρήσεις. Παράλληλα με τα πειράματα υπερθερμίας, μελετήθηκε η δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου της μικροκυματικής ραδιομετρίας με τη γεωμετρία του προτεινόμενου συστήματος. Η μέθοδος της μικροκυματικής ραδιομετρίας θα μπορούσε να παρέχει τον έλεγχο της θερμοκρασίας της ακτινοβολούμενης περιοχής κατά τη διάρκεια των συνεδριών της υπερθερμίας. Στις πειραματικές διαδικασίες που ακολουθήθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν ομοιώματα νερού, τα οποία στη φάση της υπερθερμίας υπέδειξαν τις περιοχές εστίασης της ενέργειας για τη συχνότητα ακτινοβολίας, ενώ στη φάση της μικροκυματικής ραδιομετρίας βοήθησαν στη μελέτη της θερμοκρασιακής διακριτικής ικανότητας του συστήματος. Επίσης, διενεργήθηκαν μετρήσεις με στρώματα προσαρμογής από διηλεκτρικά υλικά, τα οποία τοποθετούνταν γύρω από το αντικείμενο ενδιαφέροντος, για την πληρέστερη κατανόηση της επίδρασης των υλικών αυτών στις ιδιότητες εστίασης του συστήματος και για την επιβεβαίωση των αντίστοιχων θεωρητικών αποτελεσμάτων. / The application of hyperthermia process has been widely used in clinical research and efforts are being made for its implementation in clinical practice, as many researchers have used this method as an adjunct treatment procedure for cancer. During the past two decades, a great deal of research has been carried out, with the aim of developing effective techniques for hyperthermia treatment, primarily using RF, microwave, and ultrasound energy. A similar effort is carried out in the Laboratory of Microwaves and Fiber Optics (MFOL), School of Electrical and Computer Engineering, National Technical University of Athens (NTUA), where a proposed hyperthermia system has been designed and constructed. A system for deep brain hyperthermia treatment, designed to also provide passive measurements of temperature and/or conductivity variations inside the human body, is presented in this paper. The proposed system comprises both therapeutic and diagnostic modules, operating in a totally contactless way, based on the use of an ellipsoidal beamformer to achieve focusing on the areas under treatment and monitoring. The radiometry monitoring module, the Three Dimensional Passive Microwave Radiometry Imaging System (MiRaIS), has been studied, designed and constructed in the framework of a PhD thesis in the same laboratory of MFOL. In the present thesis, the proposed system is theoretically and experimentally studied. The operation principal is based on the use of an ellipsoidal conductive wall cavity for focusing the emitted radiation on the tissues that should accept treatment. The ellipsoidal cavity, which was constructed and used in the experimentation procedure, is newly developed and improves the system’s ergonomy retaining at the same time the focusing properties of the prototype system. In the framework of the present study, theoretical modelling and experimentation of the proposed system was carried out in order to examine and improve its focusing attributes. In the theoretical study, two methods for the improvement of the system’s focusing properties (e.g. penetration depth of the electromagnetic field, spatial sensitivity) using dielectric materials are tested with the use of a commercially available software tool, xFDTD (x-Finite Difference Time Domain). The materials are placed inside the ellipsoidal or used as matching layers around the head model for the achievement of a stepped change of the refraction index on the air-human head model interface. In the first approach, the ellipsoidal volume is filled with a low loss dielectric material in order to improve the system’s spatial sensitivity. In the second approach, a hemi-sphere also filled with a dielectric material is placed around the human head model and the results revealed the improvement of the system’s spatial sensitivity and the reduction of the undesirable auxiliary energy-absorbing areas. The experiments were performed inside an anechoic chamber providing maximum accuracy by avoiding any external interference. Along with the hyperthermia experiments, the implementation of the microwave radiometry process was also tested with the proposed system. Microwave radiometry could provide the temperature monitoring of the radiated area during the hyperthermia sessions. In the experimental procedures water phantoms were used, which during hyperthermia indicated the energy-absorbing areas at the irradiation frequency, and during microwave radiometry revealed the system’s temperature sensitivity. Also, measurements were conducted using dielectric matching layers, placed around the medium of interest, in order to fully understand the effect of those materials on the system’s focusing properties as well as to confirm the respective theoretical results. Taking into consideration the present study and the advantage of the non invasive character of the proposed brain hyperthermia system, it is concluded that further research is required in order to explore its potentials at becoming a part of the standard treatment protocol of brain malignancy in the future.

Η υπερθερμία αποτελεί μια επικουρική μέθοδο θεραπείας του καρκίνου και η βιοϊατρική έρευνα τις τελευταίες δεκαετίες, με σκοπό την εκμετάλλευση και την ανάδειξη των ιδιοτήτων της μεθόδου, στοχεύει στην εφαρμογή της στην κλινική πράξη. Μια προσπάθεια με παρόμοιο σκοπό γίνεται τα τελευταία χρόνια στο Εργαστήριο Μικροκυμάτων και Οπτικών Ινών (ΕΜΟΙ) της σχολής Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών (ΗΜΜΥ) του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου, όπου έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί ένα μικροκυματικό σύστημα υπερθερμίας. Το προτεινόμενο σύστημα ενσωματώθηκε σε ένα τρισδιάστατο σύστημα παθητικής μικροκυματικής ραδιομετρικής απεικόνισης (ΜiRaIS), το οποίο παρέχει τη δυνατότητα παρακολούθησης των μεταβολών της θερμοκρασίας και της αγωγιμότητας της υπό εξέταση περιοχής σε πραγματικό χρόνο και μελετήθηκε και κατασκευάστηκε στα πλαίσια παλαιότερης διδακτορικής διατριβής στο ίδιο εργαστήριο της σχολής ΗΜΜΥ. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή γίνεται η θεωρητική και πειραματική μελέτη του προτεινόμενου συστήματος υπερθερμίας. Η αρχή λειτουργίας του συστήματος είναι όμοια με εκείνη του MiRaIS και βασίζεται στη χρήση μιας ελλειψοειδούς αγώγιμης κοιλότητας για εστίαση της ακτινοβολίας επιλεκτικά στους ιστούς που χρήζουν θεραπείας. Ο ανακλαστήρας για εστίαση που κατασκευάστηκε και χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία, βελτιώνει την εργονομία του συστήματος, διατηρώντας παράλληλα της ιδιότητες εστίασης του πρωτότυπου ελλειψοειδούς. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε αρχικά η θεωρητική μελέτη και μοντελοποίηση της διάταξης με σκοπό την εξακρίβωση των ιδιοτήτων εστίασης του συστήματος και στη συνέχεια επιχειρήθηκε η βελτίωση των ιδιοτήτων αυτών με χρήση διατάξεων διηελκτρικών υλικών, καθώς και πειραματικές μετρήσεις του συνολικού συστήματος υπερθερμίας-μικροκυματικής ραδιομετρίας. Η θεωρητική ηλεκτρομαγνητική μελέτη του συστήματος έγινε με τη χρήση ενός εμπορικά διαθέσιμου υπολογιστικού πακέτου προσομοίωσης (XFdtd, Remcom Inc.), το οποίο χρησιμοποιεί τη μέθοδο των πεπερασμένων διαφορών στο πεδίο του χρόνου για την επίλυση ηλεκτρομαγνητικών προβλημάτων. Ερευνώνται τρεις διατάξεις διηλεκτρικών υλικών με σκοπό τη βελτίωση των ιδιοτήτων εστίασης του συστήματος, οι οποίες επικεντρώνονται στη μελέτη του βάθους διείσδυσης της ακτινοβολίας και της χωρικής διακριτικής ικανότητας. Τα υλικά τοποθετούνται είτε στο εσωτερικό του ελλειψοειδούς είτε γύρω από το μοντέλο κεφαλιού ως στρώματα προσαρμογής, με σκοπό την επίτευξη βηματικής αλλαγής της διηλεκτρικής σταθεράς στη διεπιφάνεια αέρα-μοντέλο ανθρώπινου κεφαλιού. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν τα πλεονεκτήματα από τη χρήση των διηλεκτρικών υλικών, καθώς παρουσιάζεται βελτίωση και στις δυο παραμέτρους των ιδιοτήτων εστίασης, ανάλογα με τη διάταξη που χρησιμοποιείται, τη θέση του μοντέλου κεφαλιού στο εσωτερικό του συστήματος και τη συχνότητα λειτουργίας. Για τη διενέργεια των πειραμάτων, η πειραματική διάταξη τοποθετήθηκε σε ανηχοϊκό θάλαμο, ο οποίος εξασφαλίζει την απομόνωσή της από τον περιβάλλοντα χώρο. Στις πειραματικές διαδικασίες που ακολουθήθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν ομοιώματα, τα οποία στη φάση της υπερθερμίας υπέδειξαν τις περιοχές εστίασης της ενέργειας για την εκάστοτε συχνότητα ακτινοβολίας, ενώ στη φάση της μικροκυματικής ραδιομετρίας βοήθησαν στη μελέτη της θερμοκρασιακής διακριτικής ικανότητας του συστήματος. Η μέθοδος της μικροκυματικής ραδιομετρίας χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση των μεταβολών της θερμοκρασίας της ακτινοβολούμενης περιοχής κατά τη διάρκεια των συνεδριών της υπερθερμίας. Επίσης, κατά τη διάρκεια των πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις με στρώματα προσαρμογής από διηλεκτρικά υλικά, τα οποία τοποθετήθηκαν γύρω από το αντικείμενο ενδιαφέροντος και βοήθησαν στην πληρέστερη κατανόηση της επίδρασης της παρουσίας τους στις ιδιότητες εστίασης του συστήματος και στην επιβεβαίωση των αντίστοιχων θεωρητικών αποτελεσμάτων. / The application of hyperthermia process has been widely used in clinical research and efforts are being made for its implementation in clinical practice, as many researchers have used this method as an adjunct treatment procedure for cancer. During the past two decades, a great deal of research has been carried out, with the aim of developing effective techniques for hyperthermia treatment, primarily using RF, microwave and ultrasound energy. A similar effort is carried out in the Laboratory of Microwaves and Fiber Optics (MFOL), School of Electrical and Computer Engineering, National Technical University of Athens (NTUA), where a proposed hyperthermia system has been designed and constructed. A system for deep brain hyperthermia treatment, designed to also provide passive measurements of temperature and/or conductivity variations inside the human body, is presented in the present PhD thesis. The proposed system comprises both therapeutic and diagnostic modules, operating in a totally contactless way, based on the use of an ellipsoidal beamformer to achieve focusing on the areas under treatment and monitoring. The radiometry monitoring module, the Three Dimensional Passive Microwave Radiometry Imaging System (MiRaIS), has been studied, designed and constructed in the framework of a previous PhD thesis in the same laboratory of MFOL. In the present thesis, the proposed system is theoretically and experimentally studied. The operation principal is based on the use of an ellipsoidal conductive wall cavity for focusing the emitted radiation on the tissues that should accept treatment. The ellipsoidal cavity, which was constructed and used in the experimentation procedure, is newly developed and improves the system’s ergonomics retaining at the same time the focusing properties of the prototype system. In the framework of the present work, theoretical modeling and experimentation of the proposed system is carried out in order to examine and improve its focusing attributes. In the theoretical study, three setups are investigated for the improvement of the system’s focusing properties (e.g. penetration depth of the electromagnetic field, spatial sensitivity) using dielectric materials. The research is carried out with the use of a commercially available software tool, XFdtd (Remcom Inc.). The materials are placed inside the ellipsoidal or used as matching layers around the head model for the achievement of a stepped change of the refraction index on the air-human head model interface. The results revealed the possible advantages of using matching dielectric materials, as improvement on the focusing properties of the system is clearly observed, depending on the setup used, the position of the head model inside the system and the operating frequency. The experiments were performed inside an anechoic chamber providing maximum accuracy by avoiding all possible EMC/EMI issues. Along with the hyperthermia experiments, the implementation of the microwave radiometry process was also tested with the proposed system. Microwave radiometry could provide the temperature monitoring of the radiated area during the hyperthermia sessions. In the experimental procedures water phantoms were used, which during hyperthermia indicated the energy absorbing areas at the irradiation frequency, while during microwave radiometry revealed the system’s temperature sensitivity. Also, measurements were conducted using dielectric matching layers, placed around the medium of interest, in order to fully understand the effect of those materials on the system’s focusing properties as well as to confirm the respective theoretical results. Taking into consideration the present study and the advantage of the non invasive character of the proposed brain hyperthermia system, it is concluded that further research is required in order to explore its potentials at becoming a part of the standard treatment protocol of brain malignancy in the future.