Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Είναι γνωστό ότι ο καρκίνος του πνεύμονα είναι διαδικασία πολλαπλών σταδίων, στην οποία ενέχονται γενετικοί και επιγενετικοί μηχανισμοί. Ενεργοποίηση ογκογονιδίων συμβαίνει σε όλους τους βρογχοπνευμονικούς καρκίνους με αποτέλεσμα την αύξηση των μιτογόνων σημάτων. Στον καρκίνο του πνεύμονα τα πιο συχνά ενεργοποιημένα ογκογονίδια είναι τα EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET, CCND1, CDK4, EML4-ALK fusion, και BCL2. Επίσης, η απώλεια ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι ιδιαίτερα σημαντική στην πνευμονική καρκινογένεση και είναι συνήθως αποτέλεσμα απενεργοποίησης και των δυο αλληλόμορφων. Συχνά απενεργοποιημένα ογκοκατασταλτικά γονίδια στον καρκίνο του πνεύμονα είναι TP53, RB1, STK11, CDKN2A, FHIT και PTEN. Οι επιγενετικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν την μεθυλίωση του DNA, την τροποποίηση των ιστονών και τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω των microRNAs. Τα microRNAs είναι μικρά, μη κωδικοποιούντα μόρια RNA που εμπλέκονται στην αρνητική μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Μελέτες έχουν αποδείξει το ρόλο των miRNAs στην φυσιολογική πνευμονική ανάπτυξη και ομοιόσταση αλλά και τον ενεργό ρολό τους στην παθογένεια πνευμονικών νοσημάτων όπως είναι ο καρκίνος του πνεύμονα. Η δημιουργία ωρίμων, λειτουργικών microRNAs απαιτεί τη συντονισμένη δράση μιας ομάδας πρωτεϊνών που στο σύνολο τους απαρτίζουν το μηχανισμό ρύθμισης των microRNA (microRNA machinery). Ο μηχανισμός ελέγχου των microRNA ρυθμίζει μέσω των παραγομένων microRNAs την έκφραση πολλών ογκοκατασταλτικών γονιδίων και ογκογονιδίων. Κύρια συστατικά του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA είναι οι ριβονουκλεάσες Drosha, Dicer και AGO2. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της κυτταρικής εντόπισης και έκφρασης των συστατικών του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA, Drosha, Dicer και AGO2, στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκε η κυτταρική εντόπιση των Drosha, Dicer και AGO2 στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα A549, H23, H358, H661, HCC827 με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Στις ίδιες κυτταρικές σειρές, μελετήθηκαν τα κυτταρικά επίπεδα των πρωτεϊνών Drosha, Dicer και AGO2 με την μέθοδο της SDS-PAGE και του ανοσοαποτυπώματος. H έκφραση των πρωτεϊνών αυτών μελετήθηκε σε ιστολογικές τομές παραφίνης μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα NSCLC με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Επιπλέον συσχετίσαμε τα επίπεδα της ανοσοϊστοχημικής χρώσης αυτών των ριβονουκλεασών με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Drosha in vitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα επίπεδα ανοσοέκφρασης της Drosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα νεοπλασματικά κύτταρα NSCLC, σε σχέση με τα φυσιολογικά. Επίσης, τα κυτταρικά επίπεδα της Drosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Όμως, στατιστικά σημαντική διαφορά δεν προέκυψε από την σύγκριση καρκινικών ιστών μεταξύ τους κατά ιστολογικό τύπο, στάδιο νόσου και βαθμό κακοήθειας. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν συμμετοχή της ριβονουκλεάσης Drosha στην πνευμονική κακοήθη εξαλλαγή και στην παθογένεια του NSCLC αλλά όχι στην εξέλιξη της νόσου. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Dicer in vitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα πειράματα ανοσοϊστοχημείας, ανέδειξαν ότι τα επίπεδα ανοσοέκφρασης της Dicer ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό (p=0,040). Μάλιστα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην ανοσοέκφραση της Dicer στην σύγκριση των τριών σταδίων μεταξύ τους (p=0,049) και αυτό το εύρημα παρουσιάζεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία από την παρούσα μελέτη. Όμως, τα κυτταρικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν σχετίζονται με τον ιστολογικό τύπο αλλά και το βαθμό της κακοήθειας. Τα ευρήματα μας αυτά εισηγούνται τη συμμετοχή της ριβονουκλεάσης Dicer στην πνευμονική καρκινογένεση και στην εξέλιξη της νόσου. Τέλος, τα κυτταρικά επίπεδα της ενδονουκλεάσης AGO2 είναι στατιστικά χαμηλότερα στα πνευμονικά νεοπλασματικά κύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά. Η πρωτεϊνική έκφραση των κυτταρικών σειρών NSCLC παρουσίασε σχεδόν ομοιόμορφη κατανομή. Μάλιστα, και για την πρωτεΐνη AGO2 τα επίπεδα ανοσοέκφρασης είναι στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό (p=0,000). Όμως, παρατηρήθηκε ότι τα κυτταρικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν σχετίζονται με τον ιστολογικό τύπο, το στάδιο της νόσου αλλά και το βαθμό της κακοήθειας. Το γεγονός αυτό ενισχύει την άποψη ότι η AGO2 συμμετέχει στην παθοβιολογία του NSCLC αλλά πιθανά όχι στην εξέλιξη της νόσου. Εάν αποδειχθεί σημαντική η συμμετοχή του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA στην παθογένεια της πνευμονικής κακοήθειας, θα υπάρξει η δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν για την δημιουργία υποομάδων («μοριακά πορτραίτα») του καρκίνου του πνεύμονα, οι οποίες να έχουν προγνωστική αλλά και θεραπευτική αξία (στοχευμένες θεραπείες). / Lung cancer is the leading cause of cancer related death worldwide. Decades of research have contributed to our understanding that lung cancer is a multistep process involving genetic and epigenetic alterations. Oncogene activation occurs in all lung cancers, resulting in persistent upregulation of mitogenic signals. In lung cancer commonly activated oncogenes are EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET, CCND1, CDK4, EML4-ALK fusion, and BCL2. Loss of tumor suppressor gene (TSG) function is also important in lung carcinogenesis and usually results from silencing of both alleles. Commonly unactivated TSGs in lung cancer are TP53, RB1, STK11, CDKN2A, FHIT and PTEN. Epigenetic alterations include DNA methylation, histone modification and microRNA regulation of gene expression. MicroRNAs are small non-protein encoding RNAs, responsible for the negative post transcriptional regulation of gene expression. Studies have shown the role of microRNAs in normal pulmonary development and homeostasis but also in the pathogenesis of multiple lung diseases including lung cancer. The biogenesis of mature and functional microRNAs requires the orchestrated action of a group of proteins, collectively refered to as miRNA machinery. The miRNA machinery regulates the expression of many TSGs and oncogenes in a miRNA guided fashion. Drosha, Dicer and AGO2 are main components of the miRNA machinery. Our study adressed the cellular localization and protein levels of Drosha, Dicer and AGO2, components of the miRNA machinery, in NSCLC cell lines, and in NSCLC FFPE tissue sections. We employed immunofluorescence and Western blot analysis in five NSCLC cell lines and immunohistochemistry on FFPE NSCLC tissue sections. Staining intensity of the FFPE tissues was correlated with clinicopathological parameters. Altered Drosha cellular distribution was evident in neoplasia. The staining intensity of Drosha (p=0,03) was significantly lower in neoplastic tissues compared to normal tissues. When we compared neoplastic tissue stage I with normal tissues, Drosha’s staining intensity (p=0,002) was significantly lower. Drosha, protein levels were not significantly associated with age, tumor histology, grade or stage. Altered Dicer nuclear distribution was evident in lung neoplasia. The staining intensity of Dicer was significantly lower in neoplastic tissues stage I compared to normal tissues (p=0,04). Dicer’s protein levels in FFPE tissues were significantly associated with tumor stage (p=0,049). AGO2 excibited physiological cytoplasmic distribution in lung neoplasia. The staining intensity of AGO2 was significantly lower in neoplastic tissues compared to normal tissues (p=0,000). When we compared neoplastic tissue stage I with normal tissues, AGO2 staining intensity (p=0,000) was significantly lower. AGO2 protein levels were not significantly associated with age, tumor histology, grade or stage. Our findings provide evidence that the miRNA machinery components Drosha, Dicer and AGO2 are involved in lung carcinogenesis but only Dicer is implicated in cancer progression. The expression levels of the miRNA processing components might contribute to improved cancerous molecular portraits for achieving personalized medicine, the selection of patient-tailored treatment regimens.

Είναι ευρέως αποδεκτό και καλά τεκμηριωμένο ότι ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor receptor, EGFR) ελέγχει σημαντικές λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων, όπως τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, αλλά και διαδικασίες όπου συμμετέχουν περισσότεροι του ενός τύποι κυττάρων, όπως τη διήθηση και την αγγειογένεση. Μεταξύ των τύπων καρκίνου, στην ανάπτυξη των οποίων συμμετέχει ο EGFR, είναι και ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (ΜΜΚΠ). Πολύ πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι ένα άλλο μόριο που εμπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα είναι το Notch. Ο ρόλος του είναι περίπλοκος και διττός: Έχει προταθεί ότι το Notch επάγει την ανάπτυξη του ΜΜΚΠ και αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (ΜΚΠ). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του Notch επηρεάζει, αλλά και επηρεάζεται από άλλα μόρια. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία διερευνήθηκε ο ρόλος του EGFR και του Notch στην ανάπτυξη κυττάρων ΜΜΚΠ χρησιμοποιώντας τον προσδέτη του EGFR, EGF και τον αναστολέα της γ-σεκρετάσης DAPT. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές ΜΜΚΠ Η23, Α549, Η661 και ΗCC827. Οι κυτταρικές σειρές Η23, Α549 και Η661 εκφράζουν τον αγρίου τύπου (wild type, wt) EGFR και η κυτταρική σειρά HCC827 εκφράζει EGFR που φέρει τη μετάλλαξη (mutation) (DE746- A750). Αρχικά με ανάλυση κατά western μελετήθηκε το προφίλ των κυττάρων ως προς τα επίπεδα έκφρασης του ενδοκυττάριου τμήματος του Notch (Notch Intracellular Domain, NICD). Βρέθηκε ότι τα κύτταρα Η23 εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα Notch ICD, τα κύτταρα Η661 και HCC827 μέτρια επίπεδα και τα κύτταρα Α549 τα χαμηλότερα. Στη συνέχεια με τη μέθοδο του ΜΤΤ έγινε έλεγχος του DAPT στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και βρέθηκε ότι τα κύτταρα Η661 είχαν τη μεγαλύτερη αναστολή, παρόμοια συμπεριφορά έδειξαν και τα Α549. Τα κύτταρα Η23 εμφάνισαν μικρότερη ανταπόκριση σε σχέση με τα Η661 ενώ τα κύτταρα HCC827 εμφανίστηκαν ανθεκτικά στο DAPT. Η ανασταλτική δράση του DAPT στα κύτταρα Η661 συνοδεύτηκε με επαγωγή της απόπτωσης η οποία προσδιορίστηκε με τη μέθοδο αννεξίνης V καθώς και με επαγωγή της αυτοφαγίας η οποία ανιχνεύτηκε κάνοντας ανάλυση κατά western για τα πρωτεϊνικά επίπεδα της beclin-1. Περαιτέρω τα κύτταρα ενεργοποιήθηκαν με EGF και εν συνεχεία προστέθηκε DAPT. Παρατηρήθηκε ότι στα κύτταρα Η23 η προσθήκη του EGF δεν επέτρεψε να δράσει ανασταλτικά το DAPT ενώ στα Η661 εν μέρει ο EGF αντέστρεψε την ανασταλτική δράση του DAPT. Επιλέγοντας τις κυτταρικές σειρές Η23 και Η661, μελετήθηκε η δράση του DAPT και του EGF στα επίπεδα του Notch ICD. Παρατηρήθηκε ότι στα κύτταρα Η23, το DAPT μείωσε με χρονοεξαρτώμενο τρόπο τα πρωτεϊνικά επίπεδα του Notch ICD μέχρι και 6 ώρες μετά την προσθήκη του στα κύτταρα ενώ 24 ώρες μετά το φαινόμενο αντιστράφηκε. Η προσθήκη του EGF δεν επηρέασε τα επίπεδα του Notch ICD σε καμία από τις χρονικές στιγμές που μελετήθηκαν. Στα Η661 κύτταρα το DAPT προκάλεσε χρονοεξαρτώμενη μείωση των επιπέδων Notch ICD η οποία διήρκησε μέχρι και 24 ώρες μετά τη προσθήκη του DAPT. Ο EGF όπως και προηγουμένως δεν επηρέασε τα επίπεδα του Notch ICD. Παρατηρώντας ότι στα Η661 το DAPT ασκεί δράση με μεγαλύτερη διάρκεια σε σχέση με τα κύτταρα Η23, τα κύτταρα Η661 ενεργοποιήθηκαν με EGF και στη συνέχεια προστέθηκε το DAPT προκειμένου να δούμε τη δράση του συνδυασμού στα επίπεδα του Notch ICD. Βρέθηκε ότι ο EGF αντέστρεψε την μείωση των Notch ICD επιπέδων που προκαλεί μόνο του το DAPT. Τα αποτελέσματα αναδεικνύουν ότι τα μονοπάτια του EGFR και του Notch, συνηγορούν προς την ίδια κατεύθυνση για τη μείωση του όγκου και αυτό υποδηλώνει έναν ελκυστικό δρόμο συνδυαστικών προσεγγίσεων για τη θεραπεία του ΜΜΚΠ, που μπορεί να ενισχύσει τη δράση των ανασταλτικών παραγόντων του EGFR σε όγκους. Συμπερασματικά, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι στο ΜΜΚΠ: α) τα δύο μονοπάτια EGFR και Notch συνεπικουρούν για την ανάπτυξη του όγκου, β) η αναστολή του Notch είναι πιο αποτελεσματική σε κύτταρα με ενδιάμεσα επίπεδα ενεργού Notch 1, προκαλώντας τόσο απόπτωση όσο και αυτοφαγία, και γ) η μετάλλαξη του EGFR προσφέρει αντίσταση στη δράση αναστολέα της γ-σεκρετάσης. / It is widely accepted and well established that the epidermal growth factor receptor (EGFR) controls important processes of tumor cells, such as proliferation and apoptosis, but also processes involving more than one type of cells such as invasion and angiogenesis. It has been found that the EGFR has an important role in the development of several types of cancer including non-small cell lung cancer (NSCLC). Very recent data indicate that another molecule, which is involved in the development of lung cancer, is Notch. Its role is complicated and is under investigation. It is suspected that Notch has a growth promoting function in NSCLC, whereas exerts an inhibitory effect in small cell lung cancer (SCLC). Furthermore it has been found that the signaling pathway of Notch can affect/ can be affected by other molecules. This thesis investigated the role of EGFR and Notch in cell growth of NSCLC cells using the ligand of EGFR, EGF and gamma-secretase inhibitor, DAPT. To conduct the experiments the human NSCLC cell lines H23, A549, H661 and HCC827 were used. The cell lines H23, A549 and H661 express the wild type (wt) EGFR and the cell line HCC827 expresses EGFR bearing the mutation (mt) DE746-A750. Initially, we studied the profile of NSCLC cells regarding the protein levels of Notch intracellular domain (Notch ICD) using western blot analysis. It was found that H23 cells express the higher levels Notch ICD, H661 and HCC827 cells express intermediate levels and A549 cells express the lowest levels of Notch ICD. The next step was the evaluation of DAPT effect in cell proliferation using the MTT assay. We found that DAPT caused the greatest inhibition to H661 and A549 cells. DAPT was less effective to H23 cells while had no effect to HCC827 cells. The inhibitory effect of DAPT in H661 cells was in line with the induction of apoptosis and autophagy, as was detected using annexin V assay and western blot analysis for beclin-1, respectively. Furthermore, cells were stimulated with EGF and subsequently DAPT was added. We found that the stimulatory effect of EGF was not reversed by DAPT in H23 cells. However a partial reverse of EGF stimulation was observed in H661 cells. The next step was to study the effect of DAPT and EGF at Notch ICD protein levels, in H23 and H661 cells. We found that DAPT reduced the protein levels of Notch ICD in H23 cells, with a time-dependent manner, up to 6 hours after DAPT addition and this effect reversed 24 hour later. The addition of EGF did not affect the levels of Notch ICD at any time point tested. In H661 cells, DAPT caused a time-dependent reduction of Notch ICD protein levels up to 24 hours after DAPT addition to cells. EGF as previously, did not affect the levels of Notch ICD in these cells. Since DAPT was more effective to H661 cells, these cells stimulated with EGF and then DAPT was added in order to study the effect of the combination at the levels of Notch ICD. We found that EGF reversed the decrease of Notch ICD protein levels caused by DAPT alone. These results indicate that the pathways of EGFR and Notch might act with a synergistic fashion and this could be an attractive approach for the treatment of NSCLC. Summarizing our results, we might assume that in NSCLC: a) both pathways of EGFR and Notch exert a significant role in tumor growth, b) the inhibition of Notch is more effective in cells with intermediate levels of activated Notch 1, causing both apoptosis and autophagy, and c) the EGFR mutation confers resistance to the effect of γ- secretase inhibitor.

Use of multi-detector CT in lung cancer screening has the potential to detect smaller lung nodules with improved sensitivity. In this study the development of a Computer Aided Detection (CAD) system for lung nodules is reported. A combination of two segmentation approaches is used, to segment lung regions. Following segmentation, a selective enhancement filter is applied for ''initial'' identification of nodule seed points in lung regions. Candidate lung nodule regions were delineated with the use of a region growing algorithm, with thresholds provided by minimum error thresholding. False positive regions were subsequently removed using two Support Vector Machines (SVM) classifiers in cascade, utilizing a set of 6 morphological features extracted from corresponding nodule candidate regions of the enhanced and the original images. The proposed automated scheme was tested on a reference dataset of 21 cases provided by the Lung Imaging Database Consortium. System performance on a case and slice basis provided sensitivities of 91% and 81% respectively, both with an average of 5 FPs per slice. Further analysis of the slice dataset with respect to size, contrast and location of nodules provided sensitivities of 81%, 83% and 85% for nodules of small size, low contrast and near pleura. This CAD scheme may be a useful tool in assisting radiologists in lung nodule detection. / Χρήση υπολογιστικής αξονικής τομογραφίας με πολλαπλών ανιχνευτών στον πληθυσμιακό έλεγχο καρκίνου το πνεύμονα αναμένεται να συμβάλει θετικά λόγω της ικανότητας της να ανιχνεύει οζίδια του πνεύμονα μικρού μεγέθους με αυξημένη ευαισθησία. Σε αυτή την μελέτη περιγράφεται η ανάπτυξη συστήματος αυτόματης ανίχνευσης οζιδίων του πνεύμονα, με στόχο την αύξηση της ευαισθησίας σε πολυτομική αξονική τομογραφία. Το σύστημα ανίχνευσης οζιδίων αποτελείται από τρία στάδια, το στάδιο της τμηματοποίησης των πνευμονικών πεδίων, την αναγνώριση των αρχικών υποψηφίων περιοχών και τέλος την μείωση των ψευδώς θετικών ενδείξεων. Η τμηματοποίηση των πνευμονικών πεδίων πραγματοποιήθηκε με τον συνδυασμό δύο αυτόματων τεχνικών τμηματοποίησης. Στην συνέχεια ένα επιλεκτικό ενισχυτικό φίλτρο εφαρμόζεται στην περιοχή των πνευμονικών πεδίων, για την ανίχνευση τον αρχικών υποψηφίων οζιδίων και τον συντεταγμένων τους. Τα όρια των υποψήφιων οζιδίων καθορίστηκαν με την βοήθεια ενός αλγορίθμου οριοθέτησης περιοχής με τις σταθερές κατωφλιού να υπολογίζονται αυτόματα βάση τις τεχνικής που προτάθηκε από τον Kittler et al. Η μείωση των ψευδώς θετικών ενδείξεων πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή δύο ταξινομητών Support Vector Machines (SVM) σε σειρά, οι οποίοι χρησιμοποίησαν 6 μορφολογικά χαρακτηριστικά τα οποία υπολογίστηκαν από τις περιοχές των υποψηφίων οζιδίων στην ενισχυμένη αλλά και στην αρχική εικόνα. Το σύστημα το οποίο παρουσιάζεται σε αυτή την εργασία εφαρμόστηκε και δοκιμάστηκε σε βάση δεδομένων αναφοράς η οποία περιλαμβάνει 21 εξετάσεις, την οποία τις παρέχει το Lung Imaging Database Consortium ((LIDC). Η απόδοση του συστήματος σε επίπεδο εξέτασης και επίπεδο τομής ήταν αντίστοιχα 91% και 81% με 5 ψευδώς θετικές ενδείξεις αντίστοιχα. Περαιτέρω ανάλυση βάση του μεγέθους, αντίθεσης και θέσης των οζιδίων απέδωσε ευαισθησίες 81%, 83% και 85% για οζίδια μικρού μεγέθους, χαμηλής αντίθεσης και οζίδια που βρίσκονται στον υπεζοκότα. Το προτεινόμενο σύστημα μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο υποβοήθησης ανάγνωσης οζιδίων σε πολυτομική αξονική τομογραφία για τους ακτινολόγους.

Η διατριβή αφορά την ανάπτυξη και υλοποίηση ενός τετραδιάστατου, διακριτού μοντέλου προσομοίωσης της συμπεριφοράς καρκινικών κυτταρικών συστημάτων σε ελεύθερη ανάπτυξη και της απόκρισής τους σε χημειοθεραπευτική ή και ακτινοθεραπευτική αγωγή. Υλοποιήθηκαν δύο εκδοχές του μοντέλου: η χωρική και η μη χωρική προσέγγιση. Η χωρική προσέγγιση αναφέρεται στην τετραδιάστατη προσομοίωση συμπαγών όγκων. Η μη χωρική προσέγγιση βρίσκει εφαρμογή στην περίπτωση μη συμπαγών όγκων, καθώς και συμπαγών όγκων, όταν δεν δίνεται έμφαση στη χωρική εξέλιξή τους. Η ερευνητική εργασία έχει επικεντρωθεί σε τρεις τύπους καρκινικών όγκων: καρκίνος του μαστού, καρκίνος του πνεύμονα και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα και σε θεραπευτικά σχήματα χορήγησης των σκευασμάτων: επιρουβικίνη (epirubicin), τεμοζολομίδη (temozolomide), σισπλατίνη (cisplatin), γεμσιταμπίνη (gemcitabine), βινορελμπίνη (vinorelbine) και δοσεταξέλη (docetaxel). Σκοπός της εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός εργαλείου για την αξιόπιστη υποστήριξη ιατρών στη λήψη αποφάσεων σχετικά με την επιλογή θεραπευτικών σχημάτων και την εξατομικευμένη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής αγωγής. Η αφετηρία είναι η μοντελοποίηση του κυτταρικού κύκλου και των πιθανών μεταβάσεων μεταξύ των καταστάσεων που μπορεί να βρεθεί ένα κύτταρο. Το μοντέλο βασίζεται στην υπόθεση ότι ο καρκινικός όγκος διατηρείται από μια συγκεκριμένη κατηγορία κυττάρων, τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (cancer stem cells), και έχει επεκταθεί ώστε να περιλαμβάνει σε μεγαλύτερη λεπτομέρεια διάφορους βιολογικούς μηχανισμούς σε μοριακό (πχ. εκφράσεις γονιδίων) και κυτταρικό επίπεδο. Ο μηχανισμός δράσης, η φαρμακοκινητική και η φαρμακοδυναμική των θεωρούμενων σκευασμάτων έχουν μελετηθεί βιβλιογραφικά και έχουν ενσωματωθεί στο μοντέλο. Επίσης, το μοντέλο έχει αναπτυχθεί ώστε να λαμβάνει υπόψη του την κλινική εικόνα του ασθενούς με χρήση εξατομικευμένων κλινικών δεδομένων, όπως απεικονιστικά δεδομένα (π.χ. CT, MRI, PET), ιστοπαθολογικά δεδομένα (π.χ. τύπος όγκου, βαθμός διαφοροποίησης) και μοριακά δεδομένα (π.χ. έκφραση γονιδίων). Στα πλαίσια της διατριβής πραγματοποιούνται έλεγχοι αξιοπιστίας και εκτενείς παραμετρικές μελέτες για την αποσαφήνιση της ευαισθησίας του μοντέλου στη διακύμανση των παραμέτρων του τόσο κατά την προσομοίωση της ελεύθερης ανάπτυξης όσο και κατά την εφαρμογή της χημειοθεραπευτικής αγωγής. Η ποσοτική αξιολόγηση, προσαρμογή και βελτιστοποίηση του μοντέλου πραγματοποιείται στα πλαίσια των ευρωπαϊκών ερευνητικών προγραμμάτων ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) και P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) μέσω της αξιοποίησης πραγματικών κλινικών δεδομένων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της προσαρμογής του μοντέλου σε κλινικά δεδομένα του καρκίνου του μαστού, του καρκίνου του πνεύμονα και του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Επιπλέον, διάφορες εκδόσεις του μοντέλου έχουν αξιοποιηθεί για ‘την επάνδρωση’ μιας ευρωπαϊκής βάσης μοντέλων για τον καρκίνο, που υλοποιείται στα πλαίσια του ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754). Το μοντέλο υλοποιείται σε γλώσσα προγραμματισμού C++. / In the present thesis, a clinically oriented, multiscale, discrete simulation model of cancer free growth and response to chemotherapy and/or radiotherapy is presented and investigated. Two versions of the model have been implemented: the spatial and the non spatial approach. The spatial model concerns the spatiotemporal evolution of solid tumours, whereas the non spatial model can be applied in the case of non solid cancers, as well as solid tumours, when no emphasis is put on the spatial features of a tumour evolution. The research work has been focused on the paradigms of early breast cancer treated with the single agent epirubicin, primary lung cancer treated with various combinations of cisplatin, gemcitabine, vinorelbin and docetaxel and glioblastoma multiforme treated with combined modality treatment using radiation and chemotherapy with temozolomide. The goal is to end up with a reliable simulation system able to assist clinicians in selecting the most appropriate therapeutic pattern, extracted from several candidate therapeutic schemes in the context of patient individualized treatment optimization. The model incorporates the biological mechanisms of cell cycling, quiescence, recruitment (reentry into the cell cycle), differentiation and death. It is based on the well documented assumption that tumour sustenance is due to the existence of cancer stem cells, i.e. cells which have the ability to preserve their own population, as well as give birth to cells that follow the path towards terminal differentiation. Furthermore, the mechanism of action, pharmacokinetics and pharmacodynamics of all considered agents have been bibliographically studied and incorporated into the model. Finally, the model has been developed to support and incorporate individualized clinical data such as imaging data (e.g. CT, MRI, PET slices, possibly fused), including the definition of the tumour contour and internal tumour regions (proliferating, necrotic), histopathologic (e.g., type of tumour) and genetic data (e.g., gene expression). An exhaustive and in-depth examination of the model behaviour with respect to the variation of its input parameters has been performed, in order to determine the impact of its parameters, guarantee a biologically relevant virtual tumour behaviour and enlighten aspects of the interplay and possible interdependencies of the biological mechanisms modeled. Finally, the model has been quantitativily validated and adaptated in the framework of the ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) and P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) European Commission-funded projects by exploiting real clinical data. In the present thesis, the clinical adaptation of the model focuses on breast cancer, lung cancer and glioblastoma multiforme clinical cases. Moreover, various versions of the model have been uploaded to the EU cancer model repository developed by the TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754) European Commission-funded project. The model has been developed in the C++ programming language.

Απο τις απαρχές της μελέτης του PAR1, είχε βρεθεί οτι βρίσκεται σε στενή συνάφεια με τον καρκίνο, με ποικιλία πειραμάτων που έγιναν σε καρκινικές σειρές και σε διάφορα πειραματικά μοντέλα ζώων. Οι σκοποί της παρούσας εργασίας μπορούν να συνοψιστούν ως εξης: Η διερεύνηση της έκφρασης του υποδοχέα 1 της θρομβίνης (PAR1) σε καρκινικές σειρές προερχόμενες από ανθρώπινους όγκους και συγκεκριμένα: Στις σειρές από καρκίνο του προστάτη PC3 και LNCaP και στις σειρές από καρκίνο του μαστού MDA-231 και MCF-7. Η διερεύνηση της λειτουργικότητας του παραπάνω υποδοχέα στις προαναφερθείσες σειρές και το αποτέλεσμα της αναστολής του υποδοχέα στην επιβίωση και στον πολλαπλασιασμό των μελετώμενων κυττάρων. Η διερεύνηση της ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης μέσω του PAR1. Και τελικά, η διερεύνηση της έκφρασης του PAR-1 σε ασθενείς που χειρουργήθηκαν για καρκίνο του πνεύμονα στην Παν/μιακη Καρδιοθωρακοχειρουργική κλινική της Πάτρας, απο τον Καθηγητή Κο Δ. Δουγένη και την ομάδα του. Ο ανταγωνιστής του PAR-1, SCH 79797, προκάλεσε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των προαναφερθέντων καρκινικών σειρών, όπως μελετήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ και την ενσωμάτωση ραδιενεργού θυμιδίνης. Αυτή η μη ειδική ανταπόκριση όλων των μελετώμενων σειρών στον SCH, αποδόθηκε κατόπιν στο γεγονός ότι αυτοί οι ανταγωνιστές δεν ήταν απολύτως εκλεκτικοί για τον PAR-1 όπως πιστευόταν, όταν σχεδιάστηκαν. Ο συγκεκριμένος ανταγωνιστής επιλέχθηκε μεταξύ των λίγων, της μοναδικής κατηγορίας που υπήρχε, όταν ξεκίνησαν τα πειράματα. Η θρομβίνη υπερδιπλασίασε τον πολλαπλασιασμό της σειράς PC3 και δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στον πολλαπλασιασμό της σειράς MDA-231. Το τελευταίο συμφωνεί και με προηγούμενη έρευνα όπου καταδείχθηκε ότι η θρομβίνη δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, αλλά μειώνει τη μεταστατικότητα της σειράς MDA-231 (Kamath et al., 2001). Η αύξηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη PC3, από τη θρομβίνη γίνεται μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα της PAR-1, και μέσω ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης, όπως φάνηκε από τα πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε ο ειδικός αγωνιστής του PAR1, το εξαπεπτίδιο SFLLRN. Από κάποια πρώτα ενδεικτικά πειράματα φαίνεται ότι η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ λαμβάνει χώρα μέσω διενεργοποίησης του EGFR, κάτι που έχει αποδειχθεί για άλλους GPCRs. Η έκφραση του PAR1 όπως μελετήθηκε με RT-PCR, σε δείγματα ασθενών που χειρουργήθηκαν για κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα καρκινικού ιστού. Η υψηλότερη έκφραση του PAR1 ανιχνεύθηκε στον ασθενή με μελάνωμα και στον ασθενή του υψηλότερου σταδίου. Φυσικά ο αριθμός των ασθενών που μελετήθηκαν δεν αρκεί για εξαγωγή συμπερασμάτων, αλλά τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν με τα γνωστά ως σήμερα ευρήματα για τον PAR1. Παραμένει να διευκρινιστεί η σημασία της αυξημένης έκφρασης του PAR1 σε ασθενείς με κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, αφού πρώτα επιβεβαιωθεί αυτή η αυξημένη έκφραση σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών. / From the onset of studies of PAR1, it has been concluded that this receptor is closely related to cancer. This relationship has been established after various experiments in cancer cell lines and in experimental animal models. The purposes of the present study can be summarized as follows: To explore the expression of PAR1 in cell lines established from human solid tumors and specifically PC3 and LNCaP from prostate cancer and MDA-231 and MCF-7 from breast cancer. To explore the suppression of PAR1 to the above cell lines in cell division. To determine if the activation of PAR1 to the above cell lines leads to MAPK phosphorylation. And ultimatilly, to explore the expression of PAR1 in patients that have been operated for tumor in lungs in Patras University Hospitall by Dr. D. Dougenis and colleagues. It was found that PAR1 is strongly expressed in highly metastatic cell lines PC3 and MDA-231, opposite to the cells LNCaP and MCF-7 that have lower metastatic capacity. The finding for the breast cancer cells MDA-231 and MCF-7 was according to published results (Kamath et al., 2001). PAR1 selective antagonist SCH 79797, reduced cell survival and DNA synthesis to all the above mentioned cell lines, independently of PAR1 expression. These non-specific results contributed to the recent fact that these antagonists were not PAR1 selective finally. Thrombin caused more than 100% induction of DNA synthesis in PC3 cells and had no effect in MDA-231 cells in accordance with published results that thrombin reduces the metastatic capacity of MDA-231 cells (Kamath et al., 2001). This effect of thrombin in PC3 cells, is mediated by activation of PAR1 as it was shown with the use of the selective agonist peptide SFLLRN. The activation of PAR1 by thrombin in PC3 cells leads to MAPK activation as it was shown by Western analysis. Furthrmore, preliminary experiments indicate that MAPK phosphorylation after PAR1 activation may be result of EGFR transactivation. In the sample tissues from patients, PAR1 expression was detected in all cancers with different ODs. The number of the samples is not enough to lead to conclusions, but there are some important observations. The highest level of PAR1 expression as was detected by RT-PCR were found to the sample tissues of the patient diagnosed for melanoma and of the patient with the most advanced stage of lung cancer. More patients shoulde be examined and more experiments to be done in order to proceed to conclusions for the significance of PAR1 in lung cancer.