Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires, qui détournent la quasi-totalité des voies cellulaires. La voie des miRNA et du RNAi ne font pas exception. D'abord, les miRNA peuvent reconnaître les ARN viraux, permettant le recrutement de la machinerie du RNAi, en particulier AGO2, sur les messagers viraux, ce qui peut moduler la réplication du virus. Pendant ma thèse, nous avons identifié un nouveau moyen de recruter AGO2, sur les messagers viraux, qui n'impliquent pas les miRNA, ni sa capacité à induire l'extinction des gènes. Nous avons montré qu'AGO2 interagit avec GAG et se fixe aux ARN viraux par les séquences d'encapsidation. Ensuite, les virus peuvent moduler le répertoire de miRNA cellulaires, de sorte à créer un contexte favorable à sa propre réplication. Ainsi, nous avions pour objectif, d'identifier de nouveaux partenaires cellulaires de VIH. Nous avons alors analysé des données transcriptomiques, obtenues à partir de cellules infectées par VIH-1 ou VIH-2, et reconstitué des réseaux de régulations impliquant les facteurs de transcription et les miRNA. Nous avons montré que les modulations de miRNA dépendent du mode d'entrée du virus, en particulier de l'utilisation des co-récepteurs. De plus, l'approche de Biologie Intégrative que nous avons suivie, nous a permis de caractériser une nouvelle protéine cellulaire, capable de réguler l'expression du VIH et de restreindre sa réplication. / Viruses are obligatory intracellular parasites that hijack many, if not all, cellular pathways. The RNA interference (RNAi) and the micro(mi)RNA pathways are no exceptions. First, cellular micro(mi)RNAs are able to recognize viral RNAs through imperfect micro-homologies. Similar to the miRNA-mediated repression of cellular translation, this recognition is thought to tether the RNAi machinery, in particular Argonaute(AGO)2, on viral messengers and eventually to modulate virus replication. During my PhD, we have unveiled another pathway by which AGO2 can interact with retroviral mRNAs without involving host miRNAs and translation repression. We have shown that AGO2 interacts with the retroviral GAG core proteins and preferentially binds unspliced retroviral RNAs through the RNA packaging sequences. The interaction between AGO2 and GAG, observed with both the Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) and the Primate Foamy Virus 1 (PFV-1), facilitates GAG multimerization and retroviral particle formation. Second, viruses modulate the miRNA repertoire presumably to create favorable conditions for viral replication. Hence, in order to identify novel cellular partners of HIV, we have analyzed transcriptomics data obtained from HIV1 and HIV-2-infected cells and reconstituted Transcription Factor- and miRNA-based regulation networks. Strikingly, we have noticed that the modulations of the transcriptome (coding and non-coding RNAs) depend on the mode of entry of the virus (i.e. co-receptor usage). Our in silico approach also helped us characterize a novel cellular protein able to regulate virus gene expression and

"When cells are exposed to environmental stress, they respond by compartmentalizing mRNA and translation proteins in stress granulates to protect mRNA. However, the mechanism through which external stress is communicated into the cell to form stress granules is unknown. Phospholipase Cβ (PLCβ) is activated by Gq on the plasma membrane in response to sensory stimuli to initiate calcium signals resulting in a variety of cellular responses. Here, we show that PLCβ binds to major proteins that organize stress granules as well as the main component of the RNA-induced silencing machinery, Argonaute-2 (Ago2). Under stress, PLCβ moves from the plasma membrane to the cytosol to escort Ago2 into stress granules and potentially inhibit mRNA degradation by regulating microRNAs (miRs) expression. Using a model muscle cell line functionally adapted to handle stress, we find that upon osmotic stress, the movement of PLCβ into the cytosol to move Ago2 into stress granules changes the population and distribution of miRs, and in particular, members of the let family. The impact of changes in let is to acutely affect glucose metabolism allowing cells to adapt to stress conditions. Our studies present a model in which PLCβ relays information about external stress to promote stress granule formation and protect mRNAs."

Chez la plupart des eucaryotes, la présence d’ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l’expression de gènes sur la base d’une complémentarité de séquence. L’exemple le mieux connu est le cas de l’interférence par l’ARN telle qu’elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l’existence de mécanismes apparentés à l’interférence par l’ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n’existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d’un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n’a été observée jusqu’à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l’étude de l’induction de l’expression par des petits ARN. Ils reposent tout d’abord sur le développement d’une approche expérimentale qui permet de suivre l’activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j’ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d’un promoteur bidirectionnel qui contrôle l’expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l’on cible le messager de l’une de ces protéines, l’expression de l’autre est augmentée et j’ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d’ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l’utilisation d’un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l’expression détectée de manière « controlatérale » n’est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l’un des transcrits de la construction indicatrice. L’induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s’ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j’ai développées sont donc biaisées en faveur d’une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L’utilisation d’un promoteur bidirectionnel est probablement à l’origine de ce biais à travers la possibilité d’induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu’ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l’induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l’induction, j’ai pu montrer que dans le deuxième cas c’était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l’induction sans toucher au silencing s’il procède en mode siRNA. De plus l’ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d’ancrage m’a permis d’identifier les domaines nécessaires au silencing et à l’induction et de montrer qu’ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l’induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu’elle relève d’une activité spécifique du complexe RISC. / In the majority of the eucaryote, the presence of double-strands RNA induce the inhibition of gene expression base on the complementary of sequence. The best known example is the case of RNA interference in C. elegans which is the first model described, in which the double-strands RNA generate an specific endonuclease who degrade all RNA complementary perfectly to the small RNA guide included in the complex RISC. In addition to this post-transcriptional activity, it has been observed in many eukaryotes the existence of mechanisms related to RNA interference and it inhibit transcription by acting at the chromatin. If these mechanisms have been clearly demonstrated in plants, fungi, there are only several examples of this type of regulation in mammals. Unexpectedly, the targeting the promoter of a gene with small double-stranded RNA can lead to increased expression. This paradoxical response has not been observed so far in mammalian cells, but it raises interest particularly to stimulate the expression of tumor suppressor genes, unfortunely the mechanism is still unknown.My work has focused on studying the induction of expression by small RNAs. They are based first on the development of an experimental approach that allows to monitor the promoter activity of the targeted gene. To do this I used indicator constructions organized around a bidirectional promoter that controls the expression of two fluorescent proteins. When targeting the messenger of one of these proteins, the expression of the other is increased and I was able to show that thisincrease correlates with the amount of RNA messenger polymerase II presented on the bidirectional promoter. Thus, the use of a bidirectional promoter can effectively monitor the level of transcription of the gene targeted by the small RNA. This induction of expression detected in a "contralateral" is not due to an off-target effect of siRNA because it requires the presence of the target sequence on one of the transcripts of the construction indicator. The induction can be observed with many different small RNAs, including the interact as micro RNA. Thus the construction indicator that I developed are biased in an induction response transcriptionally in response to a silencing. The use of a bidirectional promoter is probably the origin of this bias through the possibility of inducing a convergent transcription when the plasmids are circular. In fact, the linearization of the construction indicator removes the induction, at least for the simplest constructions. If the heart of the complex RISC is the protein Ago2, is necessary for the silencing and the induction, I was able to show that in the second case Ago2 was in fact to guide the RISC complex on the transcripts but not to cut it. Indeed, the silencing of proteins TNRC6A and B reduces induction significantly without affecting the silencing if it processe in the siRNA model. Also anchoring the transcript EGFP induces a response similar to the small RNA (silencing and induction). This anchor approach allowed me to identify domaines necessary for silencing and induction and show that they are distinct. This work makes it possible to demonstrate that the transcriptional induction observed in our constructions indicator is due to a activity partner ofArgonaute proteins, the GW182/TNRC6 family. This observation open the way for characterization of the mechanism of this induction by showing that it belongs to a specific activity of the RISC complex.

Le tissu adipeux brun (TABr) est devenu ces dix dernières années le centre d’intérêt de nombreux laboratoires en raison de sa capacité à dissiper l’énergie apportée par les substrats sous forme de chaleur. Chez les mammifères, le développement du TABr intervient à la fin de la gestation et devient fonctionnel à la naissance. Sa capacité thermogénique permet aux nouveau-nés de s’adapter face à l'environnement extra-utérin, puis son activité régresse avec l’âge. Ceci suggère que l’environnement intra-utérin joue un rôle important dans la programmation de la physiologie et du métabolisme du TABr. Dans un modèle bien décrit de retard de croissance intra-utérin, qu’est la carence protéique maternelle (CP), la jeune progéniture CP est normoglycémique malgré un défaut de sécrétion de l'insuline mais développe avec l'âge une résistance à l'insuline et une hyperglycémie. Lors de mon arrivée au laboratoire, des résultats suggéraient un rôle du TABr dans les changements dynamiques du profil métabolique de la progéniture CP en fonction de l'âge. En effet, le TABr des rats CP est hyperactif à 3 mois par rapport aux animaux contrôles alors qu’il revient au niveau des contrôles chez la progéniture CP âgée de 18 mois, ce qui corrèle avec l’apparition des troubles métaboliques caractéristiques du diabète de type 2. Durant ma thèse, mon premier objectif a été de démontrer le rôle causal du TABr dans le maintien de l’homéostasie glucidique chez les jeunes animaux CP. Pour ce faire, nous avons exposé au froid de jeunes rats CP pour solliciter leur TABr et nous avons procédé à l’ablation chirurgicale de ce tissu. Nos résultats montrent que la jeune progéniture CP est mieux protégée que les contrôles à une exposition au froid grâce à l’activité thermogénique accrue de leur TABr. / Brown adipose tissue (BAT) has grown over the last ten years into the center of interest for many laboratories due to its capacity to burn energy derived from metabolic substrates into heat. Indeed, in mammals, the development of BAT occurs at the end of gestation to become fully functional at birth. Its thermogenic capacity allows newborns to face extrauterine environment, and thereafter its activity declines with age. This suggests that the intrauterine environment plays an important role in the programming of BAT physiology and metabolism. In a well-known model of intrauterine growth retardation (IUGR), the maternal protein restriction model (called LP for low protein), the young LP progeny is normoglycemic despite an insulin secretion defect but develops insulin resistance and hyperglycemia with age. When I started my thesis work, available results in the laboratory suggested a role of BAT in the dynamic changes of the LP progeny metabolic profile according to the age. Indeed, BAT of young LP rats is hyperactive at 3 months compared to controls while this activity drops back to control levels in old 18-months LP progeny, consistent with the appearance of a type 2 diabetic phenotype. During my thesis, the first objective was to search for the causal role of BAT in the maintenance of glucose homeostasis in young LP progeny. Using a first strategy, we exposed young LP progeny to a cold challenge to activate their BAT. In a second approach, we performed surgical ablation of their BAT. Our results show that young LP progeny is more protected against a cold challenge than controls, due to the high thermogenic capacity of their BAT. However, BAT ablation induces hyperglycemia in young LP animals showing that this tissue is required to maintain their normoglycemia. This work, published in Diabetes in March 2017, suggests that a deleterious fetal environment could reprogram BAT metabolism. The second objective of my thesis was to identify the molecular mechanisms allowing the maintenance of active BAT in young LP progeny. To do so, we compared two models of BAT activation, ie our LP model and a well-known model of BAT activation with an agonist of β-3 adrenergic receptors. In both cases, when BAT is active, we observed a global increase in microRNA (miRNA) expression associated to augmented miRNA machinery expression, and in particular AGO2 expression. Interestingly, when BAT is inactive in old LP animals, miRNA expression and miRNA machinery expression return to control levels. While activation of mature brown adipocytes in vitro leads to an increase in AGO2 protein expression, partial deletion of this protein is sufficient to decrease the thermogenic activity of these cells. Collectively our data suggest that AGO2 and increased miRNA expression contribute to BAT activation. The manuscript concerning this research is in the review process at Molecular Metabolism. In the third part of my PhD research efforts, I have found that in the BAT of young LP progeny several miRNAs are robustly downregulated. We have focused on let-7cp and miR-22-3p, which have the most severe decrease in expression. Our key finding is that these two miRNAs act synergistically to hinder mature brown adipocyte thermogenic activity. This work is in the process of being finalized for publication. In conclusion, during my PhD training I have revealed several novel findings, which lead to a better understanding of BAT physiology and its dysregulation in situations eventuating in perturbed glucose homeostasis. While additional efforts are certainly needed, these contributions advance our vision to leverage BAT as a promising target for the prevention and/or treatment of metabolic perturbations associated to obesity and type 2 diabetes.

Nicht-codierende RNAs sind ein bedeutender Bestandteil genregulatorischer Prozesse. Ihre Fehlregulierung wird mit zellulärer Dysfunktion und der Entstehung von Krankheiten in Zusammenhang gebracht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung verschiedener Testsysteme zur Untersuchung nicht codierender RNAs mit dem Schwerpunkt microRNA (miRNA), precursor miRNA (pre-miRNA) und circular RNA (circRNA). Für eine Zyklisierung und Funktionalisierung von circRNA mittels Cu-katalysierter Click-Chemie zur Identifizierung zellulärer Interaktionspartner und zugehöriger Wirkmechanismen wurden die Termini linearer RNA-Template modifiziert. Mit Hilfe enzymatischer Techniken wie Transkription und Ligation konnte in vitro die Inkorporation Azid- und Alkin-funktionalisierter Nukleotid-Bausteine am 5‘- und 3‘-Terminus gezeigt werden. Zur Untersuchung der miRNA-Reifung in cellulo wurde die pre-miRNA-134 unter Verwendung chemo-enzymatischer Methoden mit einem Fluorophor/Quencher-Paar an den Termini ausgestattet. Durch intrazelluläre Reifung der gelabelten pre-miRNA mit einhergehender Fluoreszenzfreisetzung sollte die Visualisierung und damit die Lokalisierung des miRNA-Reifungsortes innerhalb von Neuronen realisiert werden. Zudem gelang die Entwicklung eines auf branched rolling-circle amplification (BRCA) basierenden Argonaute2(Ago2)-vermittelten Spaltungsassays. Ein Enzymkomplex aus rekombinantem, humanem Ago2 und der miRNA miR 122, genannt minimal RISC, wurde dabei zur Substrat-Spaltung eingesetzt. Zur Etablierung des BRCA-basierenden Ago2-vermittelten Spaltungsassays als Screening-Tool für die Identifizierung potentieller Inhibitoren der mRNA-Spaltung wurden exemplarisch sechs Testsubstanzen aus der Gruppe der Aminoglykoside untersucht. Der BRCA-basierende Ago2-vermittelte Spaltungsassay stellte eine einfache und zuverlässige Detektionsmethode dar, der die Untersuchung einer größeren Probenzahl mit geringem Aufwand und ohne Verwendung von fluorogen gelabeltem Substrat ermöglichte. / Non-coding RNAs are an important factor in gene regulation in which their deregulation is associated with cellular dysfunction and disease. Here, the development of different test systems for the investigation of non-coding RNAs, namely microRNA (miRNA), precursor miRNA (pre-miRNA), and circular RNA (circRNA), was on focus. In order to circularize and functionalize circRNA with the purpose of identifying cellular interaction partners and possible mechanisms of action, 5‘- and 3‘-terminal modifications were added to a linear RNA template. This was accomplished by using azide- and alkyne-functionalized nucleotides which were incorporated by enzymatic approaches like transcription and ligation to be followed by Cu-catalyzed click chemistry for circularization. For investigating miRNA maturation in neuronal cells, pre-miR-134 was modified by chemo-enzymatic approach with fluorophore and quencher at its 5‘ and 3‘ ends, respectively. Intracellular maturation of labeled pre-miRNA would produce a fluorescent signal upon cleavage, thus enabling visualization and localization of miRNA maturation in neuronal cells. Furthermore, the development of Ago2-mediated mRNA cleavage assay based on branched rolling-circle amplification (BRCA) was accomplished. A complex of recombinant human Ago2 and miRNA miR-122, called minimal RISC, was used for substrate cleavage. To establish this assay as adequate screening method for identifying potential inhibitors of mRNA cleavage, a group of six aminoglycosides was tested. The BRCA-based Ago2-mediated cleavage assay showed to be a simple and reliable detection method and screening tool for small molecule binders with little effort and without fluorescent labeling of substrate.

Since their discovery in 1953, adenoviruses have significantly contributed to the understanding of virus-host cell interactions, including mechanistic details of cellular processes such as cell cycle control and alternative RNA splicing. Among the first characterized adenoviral genes were the virus-associated RNAs (VA RNAI/II), which are produced in massive amount during a lytic infection. The VA RNAs perform multiple functions and are required for a successful adenovirus life cycle. More recently, it was shown that the VA RNAs are processed into small viral miRNAs, so-called mivaRNAs, which interfere with the function of the cellular RNAi/miRNA machinery. In papers I and II, we focused on a structural and functional characterization of the mivaRNAs using two approaches. Firstly, we created a model system where the predicted miRNA-like function of mivaRNAI could be investigated, without interfering with other VA RNA functions. This was accomplished by construction of recombinant adenoviruses, in which the seed sequence of mivaRNAI was altered. The results showed that in cell culture experiments the mivaRNAI seed sequence mutants grew as the wild type virus, suggesting that the mivaRNAs are not required during the lytic phase of an adenovirus infection. Secondly, we showed that the VA RNAs from different human adenoviruses (Ad4, Ad5, Ad11 and Ad37) undergo the same type of Dicer-dependent processing into mivaRNAs, which subsequently are loaded onto the RNA induced silencing complex (RISC), albeit with different efficiencies. In paper III, we demonstrated that the promoter proximal region of the adenovirus major late promoter (MLP) produces a novel non-canonical class of small RNAs, which we termed the MLP-TSS-sRNAs. Surprisingly the MLP-TSS-sRNA maintains the m7G-cap structure while bound to Ago2 containing RISC. These complexes are functional suppressing expression of target mRNAs with complementary binding site. Most importantly, the MLP-TSS-sRNA limits the efficiency of viral DNA replication probably through a targeting of the E2B mRNAs, which are transcribed in the antisense orientation. In conclusion, the MLP-TSS-sRNA represents the first viral small RNA, which has been shown to have a function as a regulator of an adenovirus infection.

Yes / Selective gene silencing by RNA interference (RNAi) involves double-stranded small interfering RNA (ds siRNA) composed of single-stranded (ss) guide and passenger RNAs. siRNA is recognized and processed by Ago2 and C3PO, endonucleases of the RNA-induced silencing complex (RISC). RISC cleaves passenger RNA, exposing the guide RNA for base-pairing with its homologous mRNA target. Remarkably, the 3′ end of passenger RNA can accommodate a DNA extension of 19-nucleotides without loss of RNAi function. This construct is termed passenger-3′-DNA/ds siRNA and includes a 3′-nuclease-resistant mini-hairpin structure. To test this novel modification further, we have now compared the following constructs: (I) guide-3′-DNA/ds siRNA, (II) passenger-3′-DNA/ds siRNA, (III) guide-3′-DNA/ss siRNA, and (IV) passenger-3′-DNA/ss siRNA. The RNAi target was SIRT1, a cancer-specific survival factor. Constructs I–III each induced selective knock-down of SIRT1 mRNA and protein in both noncancer and cancer cells, accompanied by apoptotic cell death in the cancer cells. Construct IV, which lacks the SIRT1 guide strand, had no effect. Importantly, the 3′-DNA mini-hairpin conferred nuclease resistance to constructs I and II. Resistance required the double-stranded RNA structure since single-stranded guide-3′-DNA/ss siRNA (construct III) was susceptible to serum nucleases with associated loss of RNAi activity. The potential applications of 3′-DNA/siRNA constructs are discussed.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Είναι γνωστό ότι ο καρκίνος του πνεύμονα είναι διαδικασία πολλαπλών σταδίων, στην οποία ενέχονται γενετικοί και επιγενετικοί μηχανισμοί. Ενεργοποίηση ογκογονιδίων συμβαίνει σε όλους τους βρογχοπνευμονικούς καρκίνους με αποτέλεσμα την αύξηση των μιτογόνων σημάτων. Στον καρκίνο του πνεύμονα τα πιο συχνά ενεργοποιημένα ογκογονίδια είναι τα EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET, CCND1, CDK4, EML4-ALK fusion, και BCL2. Επίσης, η απώλεια ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι ιδιαίτερα σημαντική στην πνευμονική καρκινογένεση και είναι συνήθως αποτέλεσμα απενεργοποίησης και των δυο αλληλόμορφων. Συχνά απενεργοποιημένα ογκοκατασταλτικά γονίδια στον καρκίνο του πνεύμονα είναι TP53, RB1, STK11, CDKN2A, FHIT και PTEN. Οι επιγενετικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν την μεθυλίωση του DNA, την τροποποίηση των ιστονών και τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω των microRNAs. Τα microRNAs είναι μικρά, μη κωδικοποιούντα μόρια RNA που εμπλέκονται στην αρνητική μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Μελέτες έχουν αποδείξει το ρόλο των miRNAs στην φυσιολογική πνευμονική ανάπτυξη και ομοιόσταση αλλά και τον ενεργό ρολό τους στην παθογένεια πνευμονικών νοσημάτων όπως είναι ο καρκίνος του πνεύμονα. Η δημιουργία ωρίμων, λειτουργικών microRNAs απαιτεί τη συντονισμένη δράση μιας ομάδας πρωτεϊνών που στο σύνολο τους απαρτίζουν το μηχανισμό ρύθμισης των microRNA (microRNA machinery). Ο μηχανισμός ελέγχου των microRNA ρυθμίζει μέσω των παραγομένων microRNAs την έκφραση πολλών ογκοκατασταλτικών γονιδίων και ογκογονιδίων. Κύρια συστατικά του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA είναι οι ριβονουκλεάσες Drosha, Dicer και AGO2. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της κυτταρικής εντόπισης και έκφρασης των συστατικών του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA, Drosha, Dicer και AGO2, στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκε η κυτταρική εντόπιση των Drosha, Dicer και AGO2 στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα A549, H23, H358, H661, HCC827 με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Στις ίδιες κυτταρικές σειρές, μελετήθηκαν τα κυτταρικά επίπεδα των πρωτεϊνών Drosha, Dicer και AGO2 με την μέθοδο της SDS-PAGE και του ανοσοαποτυπώματος. H έκφραση των πρωτεϊνών αυτών μελετήθηκε σε ιστολογικές τομές παραφίνης μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα NSCLC με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Επιπλέον συσχετίσαμε τα επίπεδα της ανοσοϊστοχημικής χρώσης αυτών των ριβονουκλεασών με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Drosha in vitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα επίπεδα ανοσοέκφρασης της Drosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα νεοπλασματικά κύτταρα NSCLC, σε σχέση με τα φυσιολογικά. Επίσης, τα κυτταρικά επίπεδα της Drosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Όμως, στατιστικά σημαντική διαφορά δεν προέκυψε από την σύγκριση καρκινικών ιστών μεταξύ τους κατά ιστολογικό τύπο, στάδιο νόσου και βαθμό κακοήθειας. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν συμμετοχή της ριβονουκλεάσης Drosha στην πνευμονική κακοήθη εξαλλαγή και στην παθογένεια του NSCLC αλλά όχι στην εξέλιξη της νόσου. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Dicer in vitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα πειράματα ανοσοϊστοχημείας, ανέδειξαν ότι τα επίπεδα ανοσοέκφρασης της Dicer ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό (p=0,040). Μάλιστα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην ανοσοέκφραση της Dicer στην σύγκριση των τριών σταδίων μεταξύ τους (p=0,049) και αυτό το εύρημα παρουσιάζεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία από την παρούσα μελέτη. Όμως, τα κυτταρικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν σχετίζονται με τον ιστολογικό τύπο αλλά και το βαθμό της κακοήθειας. Τα ευρήματα μας αυτά εισηγούνται τη συμμετοχή της ριβονουκλεάσης Dicer στην πνευμονική καρκινογένεση και στην εξέλιξη της νόσου. Τέλος, τα κυτταρικά επίπεδα της ενδονουκλεάσης AGO2 είναι στατιστικά χαμηλότερα στα πνευμονικά νεοπλασματικά κύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά. Η πρωτεϊνική έκφραση των κυτταρικών σειρών NSCLC παρουσίασε σχεδόν ομοιόμορφη κατανομή. Μάλιστα, και για την πρωτεΐνη AGO2 τα επίπεδα ανοσοέκφρασης είναι στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό (p=0,000). Όμως, παρατηρήθηκε ότι τα κυτταρικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν σχετίζονται με τον ιστολογικό τύπο, το στάδιο της νόσου αλλά και το βαθμό της κακοήθειας. Το γεγονός αυτό ενισχύει την άποψη ότι η AGO2 συμμετέχει στην παθοβιολογία του NSCLC αλλά πιθανά όχι στην εξέλιξη της νόσου. Εάν αποδειχθεί σημαντική η συμμετοχή του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA στην παθογένεια της πνευμονικής κακοήθειας, θα υπάρξει η δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν για την δημιουργία υποομάδων («μοριακά πορτραίτα») του καρκίνου του πνεύμονα, οι οποίες να έχουν προγνωστική αλλά και θεραπευτική αξία (στοχευμένες θεραπείες). / Lung cancer is the leading cause of cancer related death worldwide. Decades of research have contributed to our understanding that lung cancer is a multistep process involving genetic and epigenetic alterations. Oncogene activation occurs in all lung cancers, resulting in persistent upregulation of mitogenic signals. In lung cancer commonly activated oncogenes are EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET, CCND1, CDK4, EML4-ALK fusion, and BCL2. Loss of tumor suppressor gene (TSG) function is also important in lung carcinogenesis and usually results from silencing of both alleles. Commonly unactivated TSGs in lung cancer are TP53, RB1, STK11, CDKN2A, FHIT and PTEN. Epigenetic alterations include DNA methylation, histone modification and microRNA regulation of gene expression. MicroRNAs are small non-protein encoding RNAs, responsible for the negative post transcriptional regulation of gene expression. Studies have shown the role of microRNAs in normal pulmonary development and homeostasis but also in the pathogenesis of multiple lung diseases including lung cancer. The biogenesis of mature and functional microRNAs requires the orchestrated action of a group of proteins, collectively refered to as miRNA machinery. The miRNA machinery regulates the expression of many TSGs and oncogenes in a miRNA guided fashion. Drosha, Dicer and AGO2 are main components of the miRNA machinery. Our study adressed the cellular localization and protein levels of Drosha, Dicer and AGO2, components of the miRNA machinery, in NSCLC cell lines, and in NSCLC FFPE tissue sections. We employed immunofluorescence and Western blot analysis in five NSCLC cell lines and immunohistochemistry on FFPE NSCLC tissue sections. Staining intensity of the FFPE tissues was correlated with clinicopathological parameters. Altered Drosha cellular distribution was evident in neoplasia. The staining intensity of Drosha (p=0,03) was significantly lower in neoplastic tissues compared to normal tissues. When we compared neoplastic tissue stage I with normal tissues, Drosha’s staining intensity (p=0,002) was significantly lower. Drosha, protein levels were not significantly associated with age, tumor histology, grade or stage. Altered Dicer nuclear distribution was evident in lung neoplasia. The staining intensity of Dicer was significantly lower in neoplastic tissues stage I compared to normal tissues (p=0,04). Dicer’s protein levels in FFPE tissues were significantly associated with tumor stage (p=0,049). AGO2 excibited physiological cytoplasmic distribution in lung neoplasia. The staining intensity of AGO2 was significantly lower in neoplastic tissues compared to normal tissues (p=0,000). When we compared neoplastic tissue stage I with normal tissues, AGO2 staining intensity (p=0,000) was significantly lower. AGO2 protein levels were not significantly associated with age, tumor histology, grade or stage. Our findings provide evidence that the miRNA machinery components Drosha, Dicer and AGO2 are involved in lung carcinogenesis but only Dicer is implicated in cancer progression. The expression levels of the miRNA processing components might contribute to improved cancerous molecular portraits for achieving personalized medicine, the selection of patient-tailored treatment regimens.

Chez la plupart des eucaryotes, la présence d'ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l'expression de gènes sur la base d'une complémentarité de séquence. L'exemple le mieux connu est le cas de l'interférence par l'ARN telle qu'elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l'existence de mécanismes apparentés à l'interférence par l'ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n'existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d'un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n'a été observée jusqu'à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l'expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l'étude de l'induction de l'expression par des petits ARN. Ils reposent tout d'abord sur le développement d'une approche expérimentale qui permet de suivre l'activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j'ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d'un promoteur bidirectionnel qui contrôle l'expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l'on cible le messager de l'une de ces protéines, l'expression de l'autre est augmentée et j'ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d'ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l'utilisation d'un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l'expression détectée de manière " controlatérale " n'est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l'un des transcrits de la construction indicatrice. L'induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s'ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j'ai développées sont donc biaisées en faveur d'une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L'utilisation d'un promoteur bidirectionnel est probablement à l'origine de ce biais à travers la possibilité d'induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu'ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l'induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l'induction, j'ai pu montrer que dans le deuxième cas c'était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l'induction sans toucher au silencing s'il procède en mode siRNA. De plus l'ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d'ancrage m'a permis d'identifier les domaines nécessaires au silencing et à l'induction et de montrer qu'ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l'induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu'elle relève d'une activité spécifique du complexe RISC.

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