Nicht-codierende RNAs sind ein bedeutender Bestandteil genregulatorischer Prozesse. Ihre Fehlregulierung wird mit zellulärer Dysfunktion und der Entstehung von Krankheiten in Zusammenhang gebracht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung verschiedener Testsysteme zur Untersuchung nicht codierender RNAs mit dem Schwerpunkt microRNA (miRNA), precursor miRNA (pre-miRNA) und circular RNA (circRNA). Für eine Zyklisierung und Funktionalisierung von circRNA mittels Cu-katalysierter Click-Chemie zur Identifizierung zellulärer Interaktionspartner und zugehöriger Wirkmechanismen wurden die Termini linearer RNA-Template modifiziert. Mit Hilfe enzymatischer Techniken wie Transkription und Ligation konnte in vitro die Inkorporation Azid- und Alkin-funktionalisierter Nukleotid-Bausteine am 5‘- und 3‘-Terminus gezeigt werden. Zur Untersuchung der miRNA-Reifung in cellulo wurde die pre-miRNA-134 unter Verwendung chemo-enzymatischer Methoden mit einem Fluorophor/Quencher-Paar an den Termini ausgestattet. Durch intrazelluläre Reifung der gelabelten pre-miRNA mit einhergehender Fluoreszenzfreisetzung sollte die Visualisierung und damit die Lokalisierung des miRNA-Reifungsortes innerhalb von Neuronen realisiert werden. Zudem gelang die Entwicklung eines auf branched rolling-circle amplification (BRCA) basierenden Argonaute2(Ago2)-vermittelten Spaltungsassays. Ein Enzymkomplex aus rekombinantem, humanem Ago2 und der miRNA miR 122, genannt minimal RISC, wurde dabei zur Substrat-Spaltung eingesetzt. Zur Etablierung des BRCA-basierenden Ago2-vermittelten Spaltungsassays als Screening-Tool für die Identifizierung potentieller Inhibitoren der mRNA-Spaltung wurden exemplarisch sechs Testsubstanzen aus der Gruppe der Aminoglykoside untersucht. Der BRCA-basierende Ago2-vermittelte Spaltungsassay stellte eine einfache und zuverlässige Detektionsmethode dar, der die Untersuchung einer größeren Probenzahl mit geringem Aufwand und ohne Verwendung von fluorogen gelabeltem Substrat ermöglichte. / Non-coding RNAs are an important factor in gene regulation in which their deregulation is associated with cellular dysfunction and disease. Here, the development of different test systems for the investigation of non-coding RNAs, namely microRNA (miRNA), precursor miRNA (pre-miRNA), and circular RNA (circRNA), was on focus. In order to circularize and functionalize circRNA with the purpose of identifying cellular interaction partners and possible mechanisms of action, 5‘- and 3‘-terminal modifications were added to a linear RNA template. This was accomplished by using azide- and alkyne-functionalized nucleotides which were incorporated by enzymatic approaches like transcription and ligation to be followed by Cu-catalyzed click chemistry for circularization. For investigating miRNA maturation in neuronal cells, pre-miR-134 was modified by chemo-enzymatic approach with fluorophore and quencher at its 5‘ and 3‘ ends, respectively. Intracellular maturation of labeled pre-miRNA would produce a fluorescent signal upon cleavage, thus enabling visualization and localization of miRNA maturation in neuronal cells. Furthermore, the development of Ago2-mediated mRNA cleavage assay based on branched rolling-circle amplification (BRCA) was accomplished. A complex of recombinant human Ago2 and miRNA miR-122, called minimal RISC, was used for substrate cleavage. To establish this assay as adequate screening method for identifying potential inhibitors of mRNA cleavage, a group of six aminoglycosides was tested. The BRCA-based Ago2-mediated cleavage assay showed to be a simple and reliable detection method and screening tool for small molecule binders with little effort and without fluorescent labeling of substrate.

Micro RNA sind nicht-kodierende dsRNA ~22 Nukleotiden lang, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Regulation in beinahe allen Eukaryoten spielen. MiRNAs binden target mRNA, was zu einer Blockierung der Proteintranslation führt. Viele Krankheiten sind bekannt, die durch veränderte miRNA Expressionsmuster entweder beeinflusst oder verursacht werden. Demnach könnte eine Manipulation der miRNA-Bildung einen therapeutischen Ansatz darstellen. MiRNA werden im Zytoplasma von längeren haarnadelförmigen prekursor RNA (pre-miRNA) durch das Enzym Dicer freigsetzt. Inhibition dieser Spaltung könnte durch spezifische pre-miRNA-bindende Moleküle erfolgen. Selektive Binder der pre-miRNA als Inhibitoren der miRNA-Reifung können durch testen von Substanzbibliotheken mit Hochdurchsatzscreening (HTS) gefunden werden. Diese Arbeit beschreibt den ersten homogenen Assay der miRNA-Reifung. Eine Fluoreszenzsonde in Form einer pre-miRNA wurde benutzt, die einen 5´-Fluorophor (FAM, Cy3, oder TMR) und einen 3´-Quencher (DABCYL) aufweist. Durch die nahe Nachbarschaft von Fluorophor und Quencher in der nativen Haarnadelstruktur erfolgt Fluoreszenzlöschung. Dicer spaltet diese Struktur effizient, was zur Dissoziation von Fluorophor und Quencher und somit zu einem Fluoreszenzanstieg führt. Der Assay wurde für HTS optimiert. Die ersten Verbindungen wurden auf deren Inhibition der miRNA-Reifung getestet. Mit einem Duplexassay, wobei zwei unterschiedliche pre-miRNA Sonden mit verschiedenen Fluorophoren eingesetzt wurden, konnte etwas spezifische Inhibition gezeigt werden. Der Assay wurde in Zellen durchgeführt und der Fluoreszenzanstieg mit Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Somit ist ein Zell-basiertes Screening von Inhibitoren möglich. Eine einfachere Synthese der Sonde mittels in vitro Transkription und anschließender enzymatischen Ligation wurde entwickelt. Verwendung des Assays um hoch selective Inhibitoren der miRNA-Reifung zu entdecken könnte zu therapeutischen Ansätzen führen. / Micro RNAs (miRNAs) are non-coding dsRNAs of ~22 nucleotides that play a vital role in development and regulation in nearly all eukaryotes. MiRNAs bind target mRNA, thus blocking protein translation. Many diseases have been found to be influenced or caused by aberrant expression of miRNAs. A manipulation of miRNA formation may have therapeutic potential. MiRNAs are cleaved from longer hairpin precursor RNA (pre-miRNA) in the cytoplasm by the enzyme Dicer. It might be possible to inhibit this cleavage through specific pre-miRNA binding molecules. Selective binders of pre-miRNA as inhibitors of miRNA maturation can be found by testing large libraries of substances through high throughput screening (HTS) using an appropriate assay. This work describes the first homogenous assay of miRNA maturation. A fluorescent probe in the form of a pre-miRNA containing a 5´-fluorophore (FAM, Cy3, or TMR) and a 3´-quencher (DABCYL) was used. This ‘beacon’ in its native hairpin formation brings the fluorophore and quencher moieties into close proximity, resulting in fluorescence quenching. Dicer efficiently cleaves this structure, leading to dissociation of fluorophore and quencher and thus a fluorescence increase. In the presence of an RNA ligand that blocks cleavage, a lower fluorescence increase is seen. The assay was optimized for HTS. The first compounds were tested for their inhibition of miRNA maturation. Using a duplex assay, with two different pre-miRNA probes each containing a different fluorogenic group, some specific inhibition was shown. The assay was performed in cells using fluorescence microscopy to measure the fluorescence. This would allow for a cell-based screening of inhibitors. A simpler approach of beacon synthesis using in vitro transcription followed by enzymatic ligation was also established. Use of this assay to discover highly selective inhibitors of miRNA maturation may lead to disease therapeutics.

miRNA sind kurze 21 – 23 nukleotidlange nicht kodierende RNAs endogenen Ursprungs und regulieren auf post-transkriptionaler Ebene die Genexpression. Da aberrante Expressionsmuster der miRNAs im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten stehen, ist das Interesse groß, Kontrolle über die miRNA-vermittelte Genexpression zu erhalten. Bei Krankheitsbildern, die eine Überexpression der miRNA aufweisen, kann die Inhibition der miRNA Reifung als Therapieansatz dienen. Inhibition kann z. B. durch peptidische Strukturen und durch small molecules, wie Aminoglykoside erfolgen. Ziel dieser Arbeit war die nahezu vollständig festphasenbasierte Synthese von zyklischen Peptiden und Peptid-Aminoglykosid-Konjugaten als potentielle Inhibitoren der miRNA Reifung. Ferner sollte die Guanidinylierung an fester Phase mit verschiedenen Testsubstraten gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden im ersten Teilprojekt zehn zyklische Peptide mit Hilfe eines bisfunktionalen Linkermoleküls in den Seitenketten zweier im Peptid enthaltener Cysteine synthetisiert und isoliert. Basierend darauf wurden neun weitere zyklische Peptide an fester Phase synthetisiert, mit ausgewählten Aminoglykosiden in einer CuAAC gebunden und erfolgreich isoliert. Im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde die Guanidinylierung an fester Phase mittels des Goodman’s Reagent gezeigt. In ersten Studien wurden vier Testpeptide an fester Phase guanidinyliert. Im Anschluss wurde die Limitierung dieser Methode geprüft. Dazu wurden Aminoglykoside mittels CuAAC an verschiedene Peptid- und Peptid PNA-Rückgrate geknüpft und guanidinyliert. Nicht für alle Substrate konnte die vollständige Guanidinylierung an fester Phase gezeigt werden. Ein weiteres Teilprojekt zeigte die Funktionalisierung von kommerziell erhältlichen Polymeren für die SPPS in Hinsicht auf fluorophorbasierte „Hochdurchsatz Screening-Methoden“. Dazu wurde ein peptidischer Spacer entworfen, der eine Knüpfungsstelle für Fluorophore mittels CuAAC enthielt. / miRNA are short long non-coding RNAs endogenous origin with a length of 21 – 23 nucleotides. MicroRNAs regulate the gene expression on post-transcriptionally level. Starting in the nucleus, primary transcripts are processed into precursor-miRNAs. Accordingly, the miRNA matures after export into cytosol. Since aberrant expression patterns are related to different diseases, it’s from interest to gain control about miRNA mediated gene expression. Some diseases are related to over expression of miRNA. For that reason, the inhibition of the miRNA maturing is object of research. The inhibition can be resulted from peptide structures or with small molecules like aminoglycosides. Aim of this work was the solid phase synthesis of cyclic peptides derivatives and peptide aminoglycoside conjugates as potential inhibitors of the miRNA maturing. In addition, the guanidinylation on solid phase should be evidenced with different substrates. In the first part of the project ten cyclic peptides were synthesized on solid phase. The cyclization was carried out with a bifunctional linking molecule in the side chains of two cysteines. Based on that nine cyclic peptides were synthesized and elected aminoglycosides were bound with help of CuAAC. The second part of this work showed the guanidinylation on solid phase by using Goodman’s reagent under mild conditions. Four peptides were used for initial studies. Due to the success of this method the limit was evaluated. Therefore, aminoglycosides were bound via CuAAC to different peptide and peptide-PNA backbones. By mischance, not all the chosen substrates were fully guanidinylated on solid phase. A further short project showed the functionalization of commercially available resins for solid phase peptide synthesis in relation to fluorophore based high throughput screening methods. For this purpose, a peptide spacer was devised with a binding site for fluorophores via CuAAC.