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Expressão gênica de citocinas em cobaias resistentes a carrapatos Rhipicephalus sanguineus / IL-12 AND IFN-gamma mRNA EXPRESSION IS ENHANCED ON TICK-RESISTANT GUINEA PIGS

Alessandra Mara Franzin 31 January 2005 (has links)
Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que parasitam vertebrados e transmitem uma grande variedade de agentes infecciosos para o homem e animais domésticos. Cobaias, diferentemente de cães e camundongos, são capazes de desenvolver resistência a carrapatos Rhipicephalus sanguineus após sucessivas infestações. Ao comparar o tipo de resposta imune desenvolvida por cobaias e cães frente a carrapatos observou-se que cobaias re-infestadas desenvolvem uma pequena reação de hipersensibilidade imediata e uma forte reação de hipersensibilidade tardia à inoculação cutânea com antígenos de carrapatos. Já em cães e camundongos, é notada somente uma forte reação de hipersensibilidade imediata. Também foi verificado que células dos linfonodos de cobaias infestadas três vezes com carrapatos (resistentes) proliferam intensamente na presença de saliva de carrapatos, diferentemente do que ocorre com células de cães e camundongos re-infestados (suscetíveis) que não proliferam. Esses achados sugerem o envolvimento de um padrão Th1 de resposta imune na aquisição de resistência, no entanto essa hipótese ainda não foi confirmada. Assim sendo, no atual trabalho procurou-se verificar a expressão de mRNA de citocinas na pele e linfonodos de cobaias infestadas e re-infestadas com carrapatos. Para tal foram delineados primers e padronizadas reações de PCR para detectar a expressão de mensagem das citocinas IL-12p40, IFN-gama e TNF-alfa, pertencentes a um padrão Th1, e IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-beta, pertencentes a um padrão Th2 de resposta imune. Os resultados obtidos demonstraram que cobaias sucessivamente infestadas apresentaram um aumento significativo na intensidade de mensagem para IL-12p40 nos linfonodos, tanto comparado com animais uma vez infestados (aumento de 2,6 vezes), quanto comparado com os controles (aumento de 13 vezes). Embora a análise estatística não tenha apontado uma diferença significativa houve elevação consistente na intensidade de mRNA para IFN-gama nos linfonodos de cobaias re-infestadas comparadas às infestadas apenas uma vez (aumento de 2,4 vezes). Também foi observado um aumento significativo na intensidade da mensagem para IL-5 nos linfonodos de cobaias infestadas uma vez quando comparadas aos controles (aumento de 5 vezes). Não foi detectada expressão de mensagem para IL-4 e IL-10 nas amostras analisadas. Já a expressão de mensagem para TGF-beta foi observada em todos os animais (experimentais ou controles), sugerindo que essa citocina possa ter uma expressão constitutiva em cobaias. Tomados em conjunto, os resultados sugerem o envolvimento predominante de um perfil de citocinas de padrão Th1 na aquisição de resistência em cobaias a carrapatos. Nossos resultados poderão auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens para o controle de carrapatos, como, por exemplo, sugerir adjuvantes mais adequados a serem utilizados em vacinas anti-carrapatos. O conhecimento gerado não se restringe à indução de proteção contra carrapatos como também a possibilidade de aumentar a resistência de hospedeiros a patógenos transmitidos por carrapatos que poderiam ser controlados por uma resposta tipo Th1. / Ticks are hematophagous arthropods of cosmopolitan distribution and are significant vectors of several diseases for humans and animals. Guinea pigs, unlike dogs and mice, develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks after successive infestations. When the immune reaction between tick-infested guinea pigs and dogs/mice are compared, guinea pigs develop both immediate and strong delayed type hypersensitivity reactions while dogs and mice develop only a strong immediate reaction. Additionally was shown that lymph node cells from tick-infested guinea pigs (resistant hosts) proliferate intensely when cultured with tick saliva, differently to what is observed with cells from tick-infested dogs and mice (susceptible hosts). These findings propose the contribution of a Th1 cytokine pattern on the acquired immune response to ticks; however this hypothesis still has to be tested. This being so, in this study we investigated the expression profile of genes coding for selected cytokines on R. sanguineus infested guinea-pigs. Messenger RNA for IL-12-p40, IFN-gamma and TNF-alfa (Th1 cytokine pattern) and IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-beta (Th1 cytokine pattern) was measured in skin and lymph nodes biopsies from tick-infested guinea pigs. Our results demonstrated that repeatedly tick-infested guinea pigs presented a significant increase on the intensity of message for IL-12p40 in the lymph nodes compared to both, one time tick-infested guinea pigs (raise of 2.6 times) or controls (raise of 13 times). Although the statistical analysis did not point out differences, there was a consistent increase on the mRNA intensity for IFN-gamma on the lymph nodes from re-infested guinea pigs compared to one time tick-infested animals (raise of 2.4 times). In addition, a significant enhance on the intensity of message for IL-5 on the lymph nodes from one time tick-infested guinea pigs compared to the controls (raise of 5 times). No message for IL-4 and IL-10 was detected on the analyzed tissues. In contrast, TGF-beta was detected on tissues collected from all animals (experimental or controls), suggesting a spontaneous production of this cytokine in guinea pigs. Taken together, these data suggest that a T helper 1-type pattern of cytokine production might be associated with the resistance expressed by guinea-pigs to ticks. Moreover, our results can provide new approaches to control ticks, i.e. suggest adjuvants to be added to anti-tick vaccines that preferably induce a Th1-type of response.
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Expressão gênica de citocinas em cobaias resistentes a carrapatos Rhipicephalus sanguineus / IL-12 AND IFN-gamma mRNA EXPRESSION IS ENHANCED ON TICK-RESISTANT GUINEA PIGS

Franzin, Alessandra Mara 31 January 2005 (has links)
Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que parasitam vertebrados e transmitem uma grande variedade de agentes infecciosos para o homem e animais domésticos. Cobaias, diferentemente de cães e camundongos, são capazes de desenvolver resistência a carrapatos Rhipicephalus sanguineus após sucessivas infestações. Ao comparar o tipo de resposta imune desenvolvida por cobaias e cães frente a carrapatos observou-se que cobaias re-infestadas desenvolvem uma pequena reação de hipersensibilidade imediata e uma forte reação de hipersensibilidade tardia à inoculação cutânea com antígenos de carrapatos. Já em cães e camundongos, é notada somente uma forte reação de hipersensibilidade imediata. Também foi verificado que células dos linfonodos de cobaias infestadas três vezes com carrapatos (resistentes) proliferam intensamente na presença de saliva de carrapatos, diferentemente do que ocorre com células de cães e camundongos re-infestados (suscetíveis) que não proliferam. Esses achados sugerem o envolvimento de um padrão Th1 de resposta imune na aquisição de resistência, no entanto essa hipótese ainda não foi confirmada. Assim sendo, no atual trabalho procurou-se verificar a expressão de mRNA de citocinas na pele e linfonodos de cobaias infestadas e re-infestadas com carrapatos. Para tal foram delineados primers e padronizadas reações de PCR para detectar a expressão de mensagem das citocinas IL-12p40, IFN-gama e TNF-alfa, pertencentes a um padrão Th1, e IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-beta, pertencentes a um padrão Th2 de resposta imune. Os resultados obtidos demonstraram que cobaias sucessivamente infestadas apresentaram um aumento significativo na intensidade de mensagem para IL-12p40 nos linfonodos, tanto comparado com animais uma vez infestados (aumento de 2,6 vezes), quanto comparado com os controles (aumento de 13 vezes). Embora a análise estatística não tenha apontado uma diferença significativa houve elevação consistente na intensidade de mRNA para IFN-gama nos linfonodos de cobaias re-infestadas comparadas às infestadas apenas uma vez (aumento de 2,4 vezes). Também foi observado um aumento significativo na intensidade da mensagem para IL-5 nos linfonodos de cobaias infestadas uma vez quando comparadas aos controles (aumento de 5 vezes). Não foi detectada expressão de mensagem para IL-4 e IL-10 nas amostras analisadas. Já a expressão de mensagem para TGF-beta foi observada em todos os animais (experimentais ou controles), sugerindo que essa citocina possa ter uma expressão constitutiva em cobaias. Tomados em conjunto, os resultados sugerem o envolvimento predominante de um perfil de citocinas de padrão Th1 na aquisição de resistência em cobaias a carrapatos. Nossos resultados poderão auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens para o controle de carrapatos, como, por exemplo, sugerir adjuvantes mais adequados a serem utilizados em vacinas anti-carrapatos. O conhecimento gerado não se restringe à indução de proteção contra carrapatos como também a possibilidade de aumentar a resistência de hospedeiros a patógenos transmitidos por carrapatos que poderiam ser controlados por uma resposta tipo Th1. / Ticks are hematophagous arthropods of cosmopolitan distribution and are significant vectors of several diseases for humans and animals. Guinea pigs, unlike dogs and mice, develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks after successive infestations. When the immune reaction between tick-infested guinea pigs and dogs/mice are compared, guinea pigs develop both immediate and strong delayed type hypersensitivity reactions while dogs and mice develop only a strong immediate reaction. Additionally was shown that lymph node cells from tick-infested guinea pigs (resistant hosts) proliferate intensely when cultured with tick saliva, differently to what is observed with cells from tick-infested dogs and mice (susceptible hosts). These findings propose the contribution of a Th1 cytokine pattern on the acquired immune response to ticks; however this hypothesis still has to be tested. This being so, in this study we investigated the expression profile of genes coding for selected cytokines on R. sanguineus infested guinea-pigs. Messenger RNA for IL-12-p40, IFN-gamma and TNF-alfa (Th1 cytokine pattern) and IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-beta (Th1 cytokine pattern) was measured in skin and lymph nodes biopsies from tick-infested guinea pigs. Our results demonstrated that repeatedly tick-infested guinea pigs presented a significant increase on the intensity of message for IL-12p40 in the lymph nodes compared to both, one time tick-infested guinea pigs (raise of 2.6 times) or controls (raise of 13 times). Although the statistical analysis did not point out differences, there was a consistent increase on the mRNA intensity for IFN-gamma on the lymph nodes from re-infested guinea pigs compared to one time tick-infested animals (raise of 2.4 times). In addition, a significant enhance on the intensity of message for IL-5 on the lymph nodes from one time tick-infested guinea pigs compared to the controls (raise of 5 times). No message for IL-4 and IL-10 was detected on the analyzed tissues. In contrast, TGF-beta was detected on tissues collected from all animals (experimental or controls), suggesting a spontaneous production of this cytokine in guinea pigs. Taken together, these data suggest that a T helper 1-type pattern of cytokine production might be associated with the resistance expressed by guinea-pigs to ticks. Moreover, our results can provide new approaches to control ticks, i.e. suggest adjuvants to be added to anti-tick vaccines that preferably induce a Th1-type of response.
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Avaliação da atividade de acaricidas químicos sintéticos, extrato botânico sobre Rhipicephalus sanguineus e ação dos óleos essenciais sobre Amblyomma cajennens. / Evaluation of activity of synthetic chemical acaricides, botanical extract on Rhipicephalus sanguineus and action of essential oils on Amblyomma cajennense.

D`ALESSANDRO, Walmirton Bezerra 22 October 2008 (has links)
Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao WalmirtonBezerra.pdf: 3515322 bytes, checksum: 262c3d8c28e9609dbeee4234b3332f81 (MD5) Previous issue date: 2008-10-22 / Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari, Ixodidae) known as tick-star , is a ixodid heteroxenous tree-host found too often in horses. Have little specific parasite, particularly in periods of larvae and nymph, is considered the most important in ixodid transmission of spotted fever to humans in Brazil. Rhipicephalus sanguineus, tick ectoparasite mainly from domestic dogs in urban areas, but also parasite other mammals, birds and reptiles, is responsible for the transmission of pathogens to their hosts. By developing in synanthropic environments, with their immature stages occasionally infecting man, this ixodídeo could cause increased incidence of erliquiosis, babesiosis and spotted fever in humans. The difficulties in controlling these ixodids, including the development of resistance to some acaricides chemicals synthetic main products used in their control, studies to encourage development of alternative measures, more efficient and less environmental impact. The objective of this work was monitoring the susceptibility and/or resistance of R. sanguineus to 14 insecticide products/acaricides, among the most acaricide sold in Goiás for control of ectoparasites of medical and veterinary importance, and verify the potential of substances extracted from plants, Carapa guianensis AUBLET (Meliaceae), Piper hispidinervum C.DC. (Piperaceae) and Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) in botanical exploration of acaricides for control of A. cajennense and R. saguineus. Engorged female of R. sanguineus were collected in environments naturally infested frequented by dogs in different districts and municipalities of Goiânia. Engorged female of A. cajennense were collected on horses from rural farms of different neighborhoods and surrounding municipalities of Goiânia. In the laboratory they were washed with distilled water, dried with paper towel and put in incubators B.O.D., to conduct the oviposition. Envelopes were used to filter paper impregnated with different concentrations of synthetic chemical acaricides, of essential oils from the leaves and branches side of P. hispidinervum, essential oil coming seeds of C. guianensis and stem bark of M. pubescens. In the control group used up only distilled water and solvent. Bioassays were made in quadruplicate. In the first study, Lethal Concentrations, CL50 and CL99, after 24 h and 48 h of exposure were calculated for the products that caused a framework for possible resistance or resistance to larvicidal R. sanguineus, according to WHO criteria. There was a framework of resistance to the basic products of Cypermethrin, Cypermethrin + Piperonyl Butoxide (PBO), Deltamethrin, Permethrin and Amitraz in 24 h presenting mortalities of 58.36%, 71.36%, 48.7%, 64.5% and 77.8%, respectively. In 48 h of exposure to Amitraz the mortality rate was 88%, presenting a framework for possible resistance accounting for 0.07% of the products tested. The lethal concentrations CL50 and CL99 were: Cypermethrin (0.06% and 7.04%), Cypermethrin + PBO (0.06% and 2.1%), Deltamethrin (0.06% and 1.57%); Permethrin (0.06% and 0.3%), Amitraz 24 h (0025% and 0.73%) and Amitraz 48 h (0.06% and 0.31%). The products Deltamethrin, Cypermethrin, Permethrin, Cypermethrin + PBO and Amitraz (24 and 48 h of exposure) were 35.2, 21, 7.85, 3, 3.65, 1.55 times, respectively, higher than the dosages recommended by manufacturers. In the second study noted that the essential oil of C. guianensis on the larvae of A. cajennense resulted in 24 h, mortality not exceeding 10% for 35% concentration in 48 h of exposure received at the CL50 of 7.38% and 45.45% of CL99, the essential oil of P. hispidinervum shown in 24 h of exposure CL50 of 0.42% and CL99 of 0.88%, in 48 h of exposure CL50 of 0.45% and CL99 of 1.06%. There was Knock down the effect on the larvae of A. cajennense the essential oil of P. hispidinervum, significantly influencing mortality average. In the third study there was the lethal action of ethanol crude extract of stem of bark M. pubescens on R. sanguineus, in the reading of 48 h LC50 and CL99 was 0.15% and 0.99%, respectively.The plants showed larvicidal effect on A. cajennense and R. sanguineus. The essential oils and extracts studied demonstrated greatest potential for the exploration of acaricides plants, with less environmental impact, to be used as a strategy for control of R. sanguineus and A. cajennense. / Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari, Ixodidae) conhecido como carrapato-estrela , é um ixodídeo heteroxeno encontrado com muita freqüência em eqüídeos. Têm pouca especificidade parasitária, principalmente nos estágios de larva e ninfa, sendo considerado o ixodídeo mais importante na transmissão da febre maculosa para os humanos no Brasil. Rhipicephalus sanguineus, carrapato ectoparasita principalmente dos cães domésticos em áreas urbanizadas, mas que também parasita outros mamíferos, aves e répteis, é responsável pela transmissão de patógenos aos seus hospedeiros. Por se desenvolver em ambientes sinantrópicos, com seus estágios imaturos, parasitando ocasionalmente o homem, este ixodídeo poderá vir a causar aumento na incidência de erliquiose, babesiose e febre maculosa no homem. As dificuldades existentes no controle dos ixodídeos, incluindo o desenvolvimento de resistência a alguns acaricidas químicos sintéticos, principais produtos utilizados em seu controle, incitam estudos para desenvolvimento de medidas alternativas, mais eficientes e de menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi monitorar a susceptibilidade e/ou resistência de R. sanguineus a 14 produtos inseticidas/acaricidas, dentre os mais comercializados em Goiás para controle de ectoparasitos de importância médica e veterinária, e verificar a potencialidade de substâncias extraídas das plantas Carapa guianensis AUBLET (Meliaceae), Piper hispidinervum C.DC. (Piperaceae) e Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae), na prospecção de acaricidas botânicos para controle de A. cajennense e R. sanguineus. As teleóginas de R. sanguineus foram coletadas, em ambientes naturalmente infestados, freqüentados por cães, de diferentes bairros e municípios de Goiânia. Teleóginas de A. cajennense foram coletadas em cavalos oriundos de propriedades rurais de diferentes bairros e municípios circunvizinhos de Goiânia. No laboratório, as teleóginas foram lavadas com água destilada, secas em papel toalha e acondicionadas em incubadoras B.O.D., para realizarem a oviposição. Foram utilizados envelopes de papel filtro impregnados com diferentes concentrações dos acaricidas químicos sintéticos, óleo essencial provenientes das folhas e ramos secundários de P. hispidinervum, óleo essencial provindo das sementes de C. guianensis e o extrato bruto etanólico da casca do caule de M. pubescens. No grupo controle utilizou-se apenas água destilada e solvente. Os bioensaios foram realizados em quadruplicata. No primeiro estudo, Concentrações Letais, CL50 e CL99, após 24 h e 48 h de exposição foram calculadas para os produtos que proporcionaram um quadro de resistência ou possível resistência larvicida para R. sanguineus, segundo critérios da OMS. Observou-se resistência para as larvas de R. sanguineus produtos que apresentaram mortalidades a base de Cipermetrina (58,36%), Cipermetrina + Butóxido de Piperolina (PBO) (71,36%), Deltametrina (48,7%), Permetrina (64,5%) e Amitraz (77,8%) nas 24 h, correspondendo a 36% dos produtos testados. Em 48 h de exposição ao Amitraz a mortalidade foi de 88%, apresentando um quadro de possível resistência, correspondendo a 0,07% dos produtos testados. As concentrações letais CL50 e CL99 encontradas foram: Cipermetrina (0,06% e 7,04%), Cipermetrina + PBO (0,06% e 2,1%), Deltametrina (0,06% e 1,57%), Permetrina (0,06% e 0,3%), Amitraz 24 h (0,025% e 0,73%) e Amitraz 48 h (0,06% e 0,31%). Os produtos Deltametrina, Cipermetrina, Permetrina, Cipermetrina + PBO e Amitraz (24 e 48 h de exposição), foram 35,2; 21; 7,85; 3; 3,65; 1,55 vezes, respectivamente, maiores do que as dosagens recomendadas pelos fabricantes. No segundo estudo observou-se o efeito letal do óleo essencial de C. guianensis sobre as larvas de A. cajennense ocasionando nas 24 h, mortalidade não superior a 10% para concentração 35%, nas 48 h de exposição obtiveram-se as CL50 de 7,38% e CL99 de 45,45%. O óleo essencial de P. hispidinervum ocasionou nas 24 h de exposição CL50 de 0,42% e CL99 de 0,88%, nas 48 h de exposição CL50 de 0,45% e CL99 de 1,06%. Observou-se o efeito Knock down sobre as larvas de A. cajennense pelo óleo essencial de P. hispidinervum, influenciando significativamente na mortalidade média. No terceiro estudo observou-se a ação letal do extrato bruto etanólico da casca do caule de M. pubescens sobre R. sanguineus, em 48 h a CL50 e CL99 foi de 0,15% e 0,99%, respectivamente. Os óleos essenciais e extrato estudados demonstraram como método alternativo para a prospecção de acaricidas vegetais, de menor impacto ambiental, a serem utilizados como nova estratégia para controle de R. sanguineus e A. cajennense.

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