Le cancer de l’ovaire est l’une des cinq causes les plus fréquentes de décès par cancer chez les femmes dans le monde développé. Environ 90% des cancers de l’ovaire proviennent de l’épithélium que l’on nomme cancer de l’ovaire épithélial (EOC). Le EOC est un cancer hormono-dépendant et les stéroïdes sexuels jouent un rôle crucial en favoriant la prolifération et de la survie des cellules. Les 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17β-HSDs) jouent un rôle important pour le contrôle de la concentration intracellulaire de tous les stéroïdes sexuels actifs. Le mécanisme qui reculent le fonctionnent et l’expression des 17β-HSDs dans le EOC sont très peu compris. L’inhibition de certains 17β-HSDs pourrait être un traitement de l’EOC et ette approche thérapeutique doit être étudiée. Les résultats de notre étude ont démontré que les 17β- HSD types 1, 5 et 7 sont tous exprimés dans les cellules OOC-3, mais que la type 1 est la plus abondante. L’expression des 17β-HSD types 1 et 7 dans les tumeurs ovariennes épithéliales que dans les ovaires normaux (type 1, 2.2 fois; type 7, 1.9 fois). Mais l’expression de la 17β-HSD 5 est significativement plus faible dans les tumeurs, suite au développement de l’EOC (-5.217 fois). De plus, la prolifération cellulaire a diminué à la suite du knockdown la 17β-HSD type 1 ou type 7 par des siRNAs spécifiques dans les cellules OVCAR-3, mais, le knockdown de la type 5 a un effet contraire. Nous suggérons que la 17β-HSD 5 peut être impliquée dans une signalisation d’hormones stéroïdiennes pour le développement du cancer de l’ovaire épithélial. Les 17β-HSD 1 et 7 pourraient être des biomarqueurs importants pour l’EOC diagnostiqué tôt et ils peuvent également être de nouvelles cibles pour le traitement de l’EOC. / Ovarian cancer is one of the top five commonest causes of female cancer death in the developed world. About 90% of ovarian cancer have epithelial origins. Epithelial ovarian cancer (EOC) is a hormone-dependent cancer, in which the sex steroids play a crucial role in maintaining the cell proliferation and survival. The 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSDs) are important in the control of intracellular concentration of all active sex steroids. The function and expression of 17β-HSDs in EOC is not fully understood. Whether or not 17β-HSDs could be a therapeutic approach for the EOC treatment needs to be studied. Our results showed that 17β-HSD types 1, 5 and 7 are all expressed in EOC cells OVCAR-3 and type 1 is the highest one. The expression of 17β-HSD types 1 and 7 is higher in epithelial ovarian tumor tissues than in normal ovaries (type1, 2.2-fold; type7, 1.9-fold), but the expression of 17β-HSD type 5 is significantly lower in the tumor, following the EOC development (-5.2-fold). We found that cell proliferation was decreased after 17β-HSD type 1 or 7 knockdown by specific siRNAs in OVCAR-3 cells. While knocking down type 5 has the opposite effect. We suggest that 17β- HSD type 5 may be involved in steroid hormone signaling in EOC development. Moreover, 17β-HSD types 1 and 7 could be important biomarkers for early diagnosed EOC and novel targets for EOC treatment.

La famille des 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17β-HSDs) est responsable de l'inter-conversion entre les stéroïdes estrogéniques ou androgéniques peu actifs (cétone) et très actifs (alcool). Plus précisément, les iso formes 1, 7 et 12 catalysent principalement la réduction de l'estrone (El) en estradiol (E2) soit l'hormone la plus estrogénique. Les estrogènes et les androgènes actifs sont impliqués dans le développement de plusieurs maladies hormono-dépendantes, tel que le cancer du sein et le cancer de la prostate, respectivement. Puisque les 17β-HSDs contrôlent la synthèse des estrogènes et des androgènes actifs en catalysant la dernière étape de leur biosynthèse, l'inhibition de ces enzymes constitue une approche intéressante d'un point de vue thérapeutique, puisqu'elle permettrait de réduire la concentration des hormones actives dans la circulation et par conséquent, pourrait empêcher la prolifération des cellules cancéreuses sensibles aux estrogènes et androgènes. Dans le but d'améliorer l'activité des inhibiteurs de la 17β-HSD1, trois nouvelles familles (époxydes, lactones et furanes) de dérivés de l'estradiol en positions 16 et 17 Ont été préparées. Des expériences d'amarrage moléculaire (docking) ont été réalisées en utilisant comme point de départ la structure tridimensionnelle de l'inhibiteur EM-1745, un hybride estradiol/adenosine complexé avec la 17β-HSD1. Parmi les nombreux composés synthétisés, les composés furaniques se sont révélés les meilleurs inhibiteurs. Les réactions de méthathèse de Grubbs et d'hydrogénation catalytique sont des étapes clefs dans la synthèse de ces composés. Dans le but d'obtenir des inhibiteurs de la 17β-HSD12, deux séries de 17a-amidodésoxyestradiol ayant deux niveaux de diversité moléculaire ont été préparées à l'aide de la chimie en solution. La première série a été obtenue à l'aide de la chimie en parallèle alors que les composés de la deuxième série ont été obtenus par réaction de carbonylation directe en utilisant les micro-ondes. La chimie en parallèle en solution ou sur support solide a été choisie comme une méthode rapide pour préparer plusieurs produits, accélérant ainsi la découverte de nouveaux agents thérapeutiques. Finalement, le "linker triazene" a été adapté à la chimie des stéroïdes afin d'obtenir des librairies de dérivés stéroïdiens déshydroxylés (sans OH) en position 3, ces produits étant connus pour avoir une bonne affinité avec la 17β-HSD12.

Chez l'humain, la formation des hormones stéroïdiennes dans les tissus périphériques via le précurseur déhydroépiandrostérone (DHEA) circulant joue un rôle majeur dans le maintien du fonctionnement adéquat des tissus androgéno- et estrogéno-sensibles. Comme les primates ont le pouvoir de sécréter une grande quantité de DHEA via les glandes surrénales, le singe représente ainsi un meilleur modèle animal pour étudier la stéroïdogénèse que le rat ou la souris. Chez ces derniers, l'enzyme 17α-hydroxylase, 17,20-lyase (CYP17) est absente dans les glandes surrénales, lesquelles sont donc incapables de produire et de sécréter la DHEA et la 4-androstène-3,17-dione (4-dione) dans la circulation, comme le font humain et les primates. Dans le présent projet, nous étudions deux enzymes chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) qui possèdent le potentiel de métaboliser les androgènes, mais les preuves de leur implication réelle sont encore manquantes. La première est la rétinol déshydrogénase de type 12 (RDH12) qui transforme le rétinal en rétinol, les résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire suggèrent qu'elle possède la capacité de convertir la dihydrotestostérone (DHT) en 5α-androstane-3p, 17β-diol (3β-diol). La deuxième enzyme est la 17β-hydroxysteroide dehydrogenase (17β-HSD) type 11, qui possède la capacité de catalyser la transformation du 5α-androstane-3α, 17β-diol (3α-diol) en androstérone (ADT). Pour déterminer les activités catalysées par la RDH12, nous avons préparé des transfectants stables qui expriment l'enzyme en utilisant les cellules transformées de rein embryonnaire d'humain (HEK-293). Nous avons trouvé que Macaca fascicularis RDH12 (mfRDH12) catalyse efficacement et sélectivement la transformation de 5α-androstane-3,17-dione (5α-dione) en epiandrostérone (Epi-ADT) et DHT en 3β-diol, respectivement. L'enzyme est exprimée spécifiquement dans la peau, la glande mammaire et le cerveau. Le niveau d'expression le plus élevé est dans la peau où elle est exprimée spécifiquement dans la glande sébacée. En utilisant l'androgène synthétique R1881 pour déterminer s'il est capable de stimuler l'expression de la RDH12 comme celle de la rétinol déshydrogénase de type 11 (RDH11), une enzyme paralogue de la RDH12, nous avons trouvé que ce produit ne stimule pas l'expression de la RDH12, par contre, il est un inhibiteur puissant de l'activité 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase. Pour déterminer le rôle potentiel de la 17β-HSD type 11 dans le métabolisme des androgènes, nous avons quantifié le niveau d'expression de l'enzyme, déterminé la localisation de l'enzyme dans plusieurs tissus en utilisant le PCR en temps réel et l'hybridation in situ, et examiné s'il y a association avec les tissus androgéno-sensibles.

La famille des enzymes 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) humaines est responsable de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. Les enzymes réductrices de cette famille, c'est-à-dire la 17β-HSDl, la 17β-HSD5 et la 17β-HSD7, sont impliquées dans la dernière étape de la synthèse des estrogènes actifs, jouant ainsi des rôles importants dans plusieurs cancers reliés au système endocrinien. Les autres facteurs qui permettent la progression ou la deletion de gènes sont les molécules de stéroïdes en action avec les récepteurs stéroïdiens nucléaires. Dans cette thèse, je présente la structure cristalline de la 17β-HSD1 avec plusieurs stéroïdes, incluant A-diol, 3β-diol, DHT et E₁, les deux premiers étant reconnus pour avoir une plus faible affinité pour l'enzyme. De plus, des études de cristallographie, de modélisation par ordinateur aussi bien que des études de biologie cellulaire ont démontré la propriété inhérente de translation des stéroïdes sexuels. Cette étude est d'un intérêt particulier puisqu'elle ouvre de nouvelles portes pour l'exploration d'une thérapie hormonale adjuvante. Je présente, de plus, des études d'inhibition aussi bien que le design et la prédiction de nouveaux inhibiteurs en utilisant la cristallographie, les essais enzymatiques et la modélisation de la 17β-HSD1 et de la 17β-HSD5. Finalement, je présente une étude préliminaire structure-fonction de la 17β-HSD7. Une revue sur plusieurs sujets touchant la cristallogenèse et l'activité de la 17β-HSD est aussi rapportée dans l'annexe.

Les enzymes stéroïdiennes 17P-hydroxystéroïdes déshydrogénases types 1 (17P-HSD1) et 5 (17P-HSD5) catalysent la formation de l'estradiol et l'inactivation du dihydrotestostérone (DHT). L'estradiol stimule la croissance des cellules cancéreuses du sein (CCS) tandis que le DHT, à des concentrations physiologiques, exerce un effet antiprolifératif sur elles. Dans cette thèse, je présente les travaux réalisés dans le double but d'évaluer l'effet des deux enzymes sur les niveaux des hormones et la prolifération des CCS et d'évaluer l'impact de l'expression de la 17P-HSD1 sur celle des gènes et protéines exprimés dans ces CCS. Les principaux résultats que j'ai obtenus suite à ces travaux sont les suivants : (1) l'utilisation de petits ARN interférents (siRNA) et d'un inhibiteur stéroïdien a permit de démontrer que l'expression et l'activité de la 17P-HSD1 sont inversement corrélées à la concentration de DHT des CCS mais positivement corrélées à leur niveau d'estradiol et à leur prolifération. Ainsi, la 17P-HSD1 stimule la croissance des CCS au moyen d'une double action sur les niveaux de ces deux hormones. (2) La 17P-HSD5 tend à augmenter le niveau d'estradiol dans la lignée de CCS humain MCF7 et contribue significativement à l'augmentation de sa croissance cellulaire. (3) Des analyses quantitatives de RT-PCR en temps réel ont démontré que la 17P-HSD1 module l'expression endogène des gènes estrogéno-régulés (dont pS2 et c-Myc) ainsi que leur réactivité à l'estradiol dans la lignée de CCS humain T47D. (4) L'analyse de puces à ADN a révélé que, dans les cellules T47D cultivées en l'absence de stéroïde, la 17P-HSD1 est capable de moduler la transcription de plus d'une quarantaine de gènes endogènes comprenant plusieurs protéines kinases impliquées dans la régulation de la croissance cellulaire. (5) Des analyses protéomiques complètes ont montré qu'en présence d'estradiol, la surexpression de la 17P-HSD1 entraine une modification du profil protéomique des cellules MCF7. (6) L'étude protéomique a également révélé que les lignées cellulaires MCF7 et T47D présentent une certaine divergence protéomique. La première exprime plus fortement les protéines impliquées dans la répression de la croissance cellulaire tandis que celles qui contribuent à la stimulation de la prolifération cellulaire sont plus fortement exprimées dans la dernière. / Human 17p-hydroxysteroid dehydrogenases types 1 (17P-HSD1) and 5 (17P-HSD5) catalyze the formation of the active estrogen estradiol (E2) and the inactivation of the androgen dihydrotestosterone (DHT). E2 stimulates breast cancer cell (BCC) growth whereas DHT has shown an antiproliferative effect. In this thesis, I present the study of the roles of 17P-HSD1 and 17P-HSD5 in the modulation of hormone levels and in the proliferation of BCC, and of the impact of the expression of 17P-HSD1 on that of endogenous genes and proteins in BCC. The main results obtained in this study are as follow: (1) using RNA interference and an inhibitor of 17P-HSD1, enzyme immunoassays and cell proliferation assays demonstrate that 17p-HSDl expression is negatively correlated to DHT levels in BCC, but positively correlated to E2 levels and BCC proliferation. 17P-HSD1 up-regulates BCC growth by a dual action on E2 synthesis and DHT inactivation. (2) 17P-HSD5 tends to increase the level of E2 in the human BCC line MCF7 and significantly contributes to the increase of the cell growth. (3) Quantitative real-time RT-PCR analyses showed that 17P-HSD1 modulates the expression of endogenous estrogen-responsive genes (including pS2 and c-Myc) and their responsiveness to E2 in the human BCC line T47D. (4) DNA-microarray analysis revealed that, in T47D cells cultured in steroid-deprived medium, 17P-HSD1 modulates the transcription of more than forty endogenous genes which include several protein kinases involved in cell growth regulation. (5) Complete functional proteomics analyses showed that in the presence of E2, the overexpression of 17pHSD1 modifies the proteomic profile of MCF7 cells. (6) The proteomic data also reveals that the proteomes of T47D and MCF7 cell lines differ significantly and suggest that MCF7 cells express a higher level of proteins implicated in cell proliferation repression than T47D cells, whereas the latter expresses more proteins strongly involved in cell growth progression.

Les hormones stéroïdiennes comme les androgènes, les estrogènes, les glucocorticoïdes et dans une moindre mesure les progestines, sont des modulateurs reconnus du développement pulmonaire. Plusieurs éléments concernant la régulation de l’action de ces stéroïdes restent encore à être identifiés, surtout lors des stades sacculaire et alvéolaire. Premièrement, nous avons caractérisé l’expression des 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) de type 1, 2 et 5, de la 5α-réductase de type 1, de la 3α-HSD et du récepteur des androgènes (AR) dans le poumon murin en développement du jour gestationnel (JG) 19.5 au jour postnatal (PN) 30. Les niveaux de 17β-HSD de type 2 diminuaient dramatiquement à la fin du stade sacculaire alors que l’expression du AR augmentait graduellement de la naissance à l’âge adulte. Le AR fut principalement détecté dans le noyau des cellules épithéliales des voies aériennes et dans certaines cellules des voies respiratoires. Les ARNm de la 17β-HSD de type 2 et le AR colocalisaient durant le stade sacculaire, mais la 17β-HSD de type 2 était absente de l’épithélium des voies aériennes durant le stade alvéolaire. Deuxièmement, les niveaux des androgènes et des estrogènes furent mesurés dans le poumon murin du stade canaliculaire au stade alvéolaire. Les niveaux androgéniques présents dans le poumon étaient significativement différents par rapport à ceux présents dans un tissu de référence. Ces résultats sont compatibles avec la présence d’un métabolisme des androgènes régulé lors du développement pulmonaire. Troisièmement, l’expression de la 20α-HSD et des gènes associés à la voie de synthèse «surrénalienne» des glucocorticoïdes furent caractérisés du JG 15.5 au PN 15. Finalement des expériences de culture d’explants pulmonaires ont démontré qu’au JG 15.5, cette voie de synthèse était capable de produire de la corticostérone à partir d’un substrat de progestérone. L’accumulation de corticostérone n’était cependant observable que dans une sous-population des échantillons prélevés au JG 15.5 et était totalement absente après. Cette observation, la forte expression de la 21-hydroxylase, la présence de fortes activités 20α-HSD et 5α-réductase suggèrent toutes la présence d’une régulation locale de l’action du récepteur des glucocorticoïdes (GR) dans le poumon en développement s’ajoutant à celle détectée pour le AR. / Steroid hormones such as progestogens, estrogens, androgens and glucocorticoids are known modulators of lung development. Several elements concerning the role and regulation of steroid action in the developing lung, especially for the saccular and alveolar stages, remain to be investigated. First, a qPCR analysis of 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSD) type 1, 2 and 5, of 5α-réductase type 1, of m3α-HSD and of androgen receptor (AR) was performed during the saccular and alveolar stages of mouse lung development. AR expression showed a statistically significant increase during the alveolar stage while levels of 17β-HSD 2 expression decreased at the end of the saccular stage and remained low throughout the alveolar period. The androgen receptor (AR) protein was primarily detected in the nucleus of airway epithelial cells and of a subset of respiratory epithelial cells. 17β-HSD 2 mRNA was co-localized with AR protein during the saccular stage, but was absent from airway epithelium during the alveolar stage. Second, androgen and estrogen levels were measured in the murine developing lung from the canalicular to the alveolar stage. Significant difference of androgen levels between lung and control tissue. This fact added to the nuclear localization of AR is compatible with the presence of a regulated androgen metabolism during lung development. Third, expression of 20α-HSD and of the genes associated with the adrenal glucocorticoid synthesis pathway was characterized in the developing lung, from GD 15.5 to PN 15. Finally, corticosterone synthesis was only observed in a fraction of lung explants from gestation day (GD) 15.5. This observation and strong expression of 21-hydroxylase, of 20α-HSD and of 5α-reductase activities suggests local regulation of GC action. It thus appears that the actions of androgens and of glucocorticoids are both regulated at a pre-receptor level in the developing lung from the canalicular stage until the end of the alveolar stage.

À l'origine, la grande majorité des cancers du sein sont stimulés par les hormones estrogéniques, comme l'estradiol (E2) qui joue un rôle capital dans le développement de cette maladie. Pour bloquer l'action de cette hormone, l'utilisation des anti-estrogènes est bien connue, mais une autre alternative est de bloquer la formation de l'hormone en inhibant l'une des enzymes impliquées dans sa formation. Parmi les enzymes nécessaires à la biosynthèse de l'E2, l'isoforme 1 de la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase (17β-HSD1) catalyse la transformation de l'estrone (El) en E2. Il n'existe cependant pas d'inhibiteurs de la 17β-HSD1 disponibles pour une utilisation en clinique. Les travaux de notre groupe de recherche ont permis d'identifier des inhibiteurs de cette enzyme. Malheureusement ces dérivés d'E2 montraient une activité estrogénique. Pour améliorer leur potentiel inhibiteur et éliminer leur activité agoniste sur le récepteur des estrogènes (RE), différentes stratégies ont été employées. Dans le cadre de mon projet de recherche, les molécules synthétisées à cette fin ont été évaluées pour leur activité inhibitrice et leur estrogénicité résiduelle. Ces travaux ont abouti à la sélection du dérivé PBRM comme un puissant inhibiteur de la 17β-HSD1 qui, de plus, est non-estrogénique in vitro et in vivo. Pour la toute première fois, nous avons pu démontrer qu'un inhibiteur de la 17β-HSD1 est en mesure d'inhiber in vivo 100% de la croissance d'une tumeur (xénogreffes de cellules de cancer du sein) stimulées avec E1. D'autre part, il est bien connu que les médicaments utilisés en chimiothérapie ne possèdent pas toujours les qualités idéales requises : entre autres, une faible toxicité, un large indice thérapeutique et une faible capacité à induire de la chimiorésistance. Une partie des efforts de notre équipe de recherche a été consacrée au développement d'une nouvelle famille d'agents anticancéreux, les aminostéroïdes. Mon projet de recherche a porté sur l'évaluation biologique de nouvelles molécules, principalement celle nommée RM-133 qui a démontré un potentiel cytotoxique sur plusieurs lignées cellulaires de cancer (HL-60, MCF-7, T-47D, LNCaP), qui produit une concentration plasmatique acceptable chez le rat (AUC0-12 h= 752 ng*h/ml) et qui possède un indice de sélectivité (HL-60 vs lymphocytes normaux) accru par rapport aux aminostéroides de première génération.

À ce jour, les études épidémiologiques ont démontré que seulement 25% des agrégations familiales de cancer du sein observées ont lieu dans des familles ayant une mutation dans l'un des gènes de prédisposition comprenant BRCA 1, BRCA2, TP53, PTEN, ATM, STK11, CHEK2, BR/P1 et PALB2. Le nombre et les propriétés des facteurs génétiques composant le 75% restant de l'excès du risque génétique sont encore inconnus, quoique selon le modèle polygénique ce risque génétique serait causé par plusieurs allèles de susceptibilité pouvant, par exemple, influencer le métabolisme des hormones sexuelles. En effet, il est maintenant bien établi que les estrogènes jouent un rôle prédominant dans la régulation de la croissance cellulaire, ainsi que la différentiation de la glande mammaire normale et des carcinomes mammaires hormono-sensibles. Parmi les enzymes responsables de la formation et l'inactivation des stéroïdes sexuels actifs, les membres de la famille des 17~-hydroxystéroïde déshydrogénases (17~-HSDs) sont d'excellents candidats. Afin d'évaluer le rôle potentiel de ces gènes candidats, nous avons donc procédé au re-séquençage des régions promotrices, des jonctions intron-exon et des exons des gènes HSD17B1, HSD17B2, HSD17B7 et HSD17B12 chez une cohorte de 50 Canadiennes Françaises atteintes d'un cancer du sein, nonporteuses d'une mutation BRCA 1/2 et provenant de familles ayant une forte histoire de cancer du sein et/ou de l'ovaire. Pour ces gènes, nos analyses ne démontrent pas l'existence de mutations germinales qui auraient permis d'expliquer le regroupement de cas de cancer du sein chez ces familles. Toutefois, nous avons identifié 88 variants de séquence dont environ la moitié n'avaient jamais été répertoriés. De plus, nous avons aussi procédé à l'étude de l'impact fonctionnel des cinq variants résultant en un changement d'acide aminé chez les enzymes 17~-HSD de types 1 et 2 et nous avons démontré par expression in vitro que ces variations faux-sens ne modifient pas les propriétés catalytiques de ces enzymes. Finalement, des marqueurs ont été sélectionnés pour mener de futures études d'association à l'aide de larges cohortes, a'fin de mieux définir la possible association entre le risque génétique de cancer du sein et les variants de séquence des gènes HSD1781, HSD1782, HSD1787 et HSD17812.

No description available.

No description available.