Les ribosomes, acteurs principaux de la synthèse protéique, sont constitués de protéines et d’ARNs. Ces dernières années la notion de "ribosome spécialisé" est apparue. Cela implique que les ribosomes sont hétérogènes dans leur composition protéique et les modifications chimiques des ARNr. Ces différentes populations de ribosome présenteraient des spécificités de traduction différentes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à une modification chimique des ARNr particulière, les 2’-O-méthylations des riboses, à leur variabilité et à leur rôle dans la fidélité et la régulation de la traduction.Pour réaliser cette étude, un modèle de cellules HeLa a été créé dans lequel la synthèse de la fibrillarine, la méthyltransférase responsable des 2’-O-méthylations, est inhibée par un shRNA (small hairpin RNA) intégré de façon stable dans le génome. L’étude de l’impact de la baisse de la fibrillarine sur les 2’-O-méthylations a permis de montrer que la diminution des méthylations des ARNr est globale mais varie selon la position. Ainsi, certaines positions sont plus sensibles que d’autres à la baisse du taux de fibrillarine.J’ai tout d’abord étudié les effets de la baisse de la méthylation des ARNr sur la traduction globale, par la technique de ribosome profiling. Cette technique est fondée sur le séquençage à haut débit des fragments d’ARNm protégés par les ribosomes. J’ai ainsi pu montrer que 43 gènes candidats étaient différentiellement traduits en condition d’hypométhylation des ARNr. A partir de cette liste j’ai cherché des éléments fonctionnels et/ou moléculaires communs à plusieurs gènes candidats. J’ai par la suite montré que les taux de translecture et de décalage de cadre de lecture augmentaient quand les ARNr sont hypométhylés. La baisse de la méthylation des ARNr entraîne donc une baisse de la fidélité de la traduction.Des études précédentes ont montré que l’initiation IRES-dépendante était impactée par la baisse des méthylations des ARNr. J’ai donc réalisé une étude globale sur l’initiation de la traduction en adaptant la technique de ribosome profiling de façon à identifier spécifiquement les ribosomes en cours d'initiation. J’ai ainsi révélé que 66 sites d’initiation étaient impactés par la baisse de la méthylation des ARNr.Nous avons localisé les positions méthylées les plus impactées sur la structure 3D du ribosome. Ceci nous a permis de regrouper les modifications par région. Nous nous sommes intéressés à un groupe de méthylations conservées entre la levure et l’homme et situées au niveau du tunnel de sortie du peptide. J’ai délété chez S. cerevisiae les snoARNs responsables de ces méthylations. J’ai ensuite cherché à démontrer si la perte de ces méthylations avait un impact sur la croissance cellulaire et la sensibilité à différents antibiotiques. J'ai aussi effectué des mesures de translecture et de décalage de cadre de lecture. L’ensemble de mes résultats a montré que la délétion conjointe de trois des quatre snoARNs impliqués dans les méthylations autour du tunnel de sortie du polypeptide n'a pas d'effet sur la fidélité de la traduction.Au cours de cette étude chez la levure, j’ai révélé un effet inédit de la délétion du gène ASC1 sur la translecture des codons stop. Asc1p est une protéine plateforme associée au ribosome, dont l’absence entraîne une diminution de la translecture du codon stop. Les mécanismes moléculaires impliqués demeurent actuellement inconnus.Au cours de ma thèse, j’ai pu montrer par des approches globales et spécifiques que la baisse de la méthylation des ARNr entraînait des variations spécifiques de l’expression protéique ainsi qu’une diminution spécifique de la fidélité de la traduction. Les mécanismes moléculaires impliquées sont toujours activement recherchés. / Ribosomes are composed of proteins and RNAs. During these last years, the concept of « specialized ribosome » has been revived. This concept is based on the principle that ribosomes are heterogeneous in protein composition and rRNA chemical modifications. These different ribosomes populations would present different translational specificities. During my thesis, I was interested in a particular rRNA chemical modification, ribose 2’-O-methylation, its variability and its role in translational fidelity and regulation.To make this study, a HeLa cell-line in which fibrillarin (the methyltransferase responsible for 2’-O-methylations) synthesis is inhibited by a shRNA (small hairpin RNA) stably integrated in the genome. The study of impact of fibrillarin decrease on 2’-O-methylations enabled us to show that rRNA methylation decrease is global but varies with the position. So, some positions are more sensitive than others positions to fibrillarin decrease.First I studied rRNA methylation decrease effects on global translation, by ribosome profiling. This method is based on high-throughput sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. By this way I revealed 43 candidate genes that are differentially translated in rRNA hypomethylated condition. From this list I searched functional and/or molecular elements common to several candidate genes. Then I showed that readthrough and frameshifting rates increase when rRNA is hypomethylated. So rRNA methylation decrease leads to translational fidelity decrease.Previous studies have shown that IRES-dependant initiation is impacted by rRNA methylation decrease. Then I performed a global study of translation initiation by adapting ribosome profiling method to identify initiating ribosomes specifically. Therefore I revealed that 66 initiation sites are impacted by rRNA methylation decrease.We localized the most impacted methylated positions on the 3D ribosome structure. It enabled us to group modifications by region. We focused our interest on one group of methylations conserved between yeast and human and localized around the peptide exit tunnel. I deleted snoRNAs responsible for these methylations in S. cerevisiae. Then I analysed if the loss of these methylations impacts the cell growth and the antibiotics sensitivity. I also make measures of readthrough and frameshifting. My results show that the targeted deletion of three out of four snoRNAs involved in the methylations around the peptide exit tunnel has no effect on translational fidelity.During this study in yeast, I revealed an unprecedented effect of ASC1 gene deletion on stop codons readthrough. Asc1p is a scaffold protein associated with the ribosome, whose absence causes a decrease of codon stop readthrough. Currently molecular mechanisms implicated remain unknown.During my thesis, I showed with global and specific approaches that rRNA methylation decrease leads to specific variations of protein expression together with specific decrease of translational fidelity. Molecular mechanisms are still actively investigated.

Le ribosome est responsable de la traduction des ARNm en protéines. Au sein du ribosome, les ARNr jouent un rôle central dans la traduction, et leurs modifications post-transcriptionnelles moduleraient l'activité traductionnelle du ribosome, impactant ainsi sur l'expression génique. Les ARNr humains contiennent 106 2'-O-méthylations, ajoutées par la fibrillarine (FBL). FBL fonctionne au sein d'un complexe snoRNP contenant les protéines Nop56, Nop58, 15.5kDa et un petit ARN nucléolaire (snoARN) à boîte C/D. La régulation de l'activité de la FBL et du complexe snoRNP à boîte C/D ne sont pas connus. Ce travail a exploité des données structurales de FBL et du complexe de méthylation pour construire un modèle permettant d'explorer les relations ses structure-fonction. L'impact de l'acétylation de FBL a également été exploré. Le 5-fluorouracile (5-FU) est un analogue de l'uracile, dont la cytotoxicité dépend de son altération du métabolisme des ARNr. Le 5-FU inhibe la maturation des ARNr et altère la localisation de plusieurs facteurs nucléolaires, dont FBL. Ce travail montre que le 5-FU induit une nouvelle acétylation de FBL en position K292. De plus, le 5-FU réduit l'association de FBL avec les membres protéiques du complexe de méthylation, et induit une baisse globale de ses interactions. De plus, ce travail propose un rôle nouveau de la déacétylase SIRT7 et de l'acétyltransférase CBP sur le complexe de méthylation. Ces enzymes semblent aussi participer aux dérégulations du complexe de méthylation induites par le 5-FU. L'ensemble de ces résultats supportent l'implication des modifications post-traductionnelles dans la régulation du complexe de méthylation des ARNr / The ribosome is responsible for the translation of mRNA into proteins. Within the ribosome, rRNAs play a crucial role in translation, and their post-transcriptional modifications regulate the ribosome’s translational activity and impact on gene expression. The human ribosome contains 106 2’-O-methylations added by fibrillarin (FBL). FBL functions through a box C/D snoRNP complex consisting of Nop56, Nop58 and 15.5kDa along with a box C/D small nucleolar RNA (snoRNA). The regulation of FBL ad the C/D box snoRNP complexe are unknown. This work exploitated strtuctural data on FBL and the methylation complex to build a model allowing the extrapolation of structure-function relationships. The impact of FBL acetylation was also investigated. 5-FU is a uracile analog, and its cytotoxicity depends mostly on its alteration of RNA metabolism. As such, 5-FU inhibits rRNA maturation and alters the localization of nucleolar factors such as FBL. 5-FU induced a novel FBL acetylation at position K292, decreased FBL interaction with the methylation complex proteins, and induced a large scale inhibition of its interactions. This discovered a new role of the deacetylase and the acetyltransferase CBP on snoRNP integrity. Moreover, this work suggests that these enzyme participate in the 5-FU-induced alteration of snoRNP. s. This work supports the involvement of post-translational modifications in the regulation of the rRNA C/D box snoRNP 2’-O-methylation complex

La biogenèse des ribosomes matures et fonctionnels est notamment dépendante de petites particules ribonucléoprotéiques composées d’ARN et de protéines, les snoRNP (small nucleolar RiboNucleoProteins). Celles-ci sont subdivisées en deux familles : les snoRNP à boîtes C/D et les snoRNP à boîtes H/ACA. Ces deux classes de snoRNP catalysent des modifications chimiques, respectivement de 2’-O-méthylation et de pseudouridylation, sur des positions spécifiques des ARN ribosomiques (ARNr), ou sont impliquées dans des clivages du long ARNr précurseur. Les snoRNP à boîtes C/D sont composées d’un snoARN à boîtes C/D servant de guide pour cibler la position à modifier, et d’un jeu invariant de quatre protéines : Snu13p/SNU13, Nop1p/Fibrillarine, Nop56p/NOP56 et Nop58p/NOP58 (levure/Homme). Ces snoRNP sont produites par la cellule grâce à la présence de plusieurs complexes protéiques constituant une machinerie pour leur assemblage. Outre plusieurs facteurs protéiques déjà connus dans la biogenèse de snoRNP à boîtes C/D comme les protéines Rsa1p/NUFIP, Hit1p/ZNHIT3 et les protéines du complexe R2TP, d’autres protéines pourraient compléter cette machinerie. Parmi ces facteurs additionnels, la protéine Bcd1p/ZNHIT6, pour Box C/D snoRNA protein 1, est essentielle pour maintenir spécifiquement la stabilité in vivo des snoARN à boîtes C/D, et des associations ont pu être identifiées entre Bcd1p/ZNHIT6 avec différents partenaires protéiques de la machinerie d’assemblage de ces particules. Toutefois, l’étape d’assemblage où Bcd1p/ZNHIT6 intervient et la fonction qu’elle y accomplit demeurent inconnues. L’utilisation d’outils in vivo et in vitro chez la levure S. cerevisiae et chez les mammifères nous ont permis de progresser dans la compréhension de la fonction de Bcd1p/ZNHIT6 dans l’assemblage des snoRNP à boîtes C/D. Bcd1p est un facteur d’assemblage recruté de manière co-transcriptionnelle sur les loci codant les snoARN à boîtes C/D et est requis pour le recrutement des complexes d’assemblage sur les snoARN en cours de transcription. Plus spécifiquement, Bcd1p affecte l’interaction de Nop58p avec le facteur d’assemblage Rsa1p, suggérant une fonction dans le recrutement de Nop58p dans une pré-snoRNP en cours d’assemblage. Ce travail a permis d’apporter des informations importantes permettant d’expliquer le caractère essentiel de Bcd1p dans la fonction et la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D / Ribosome biogenesis is especially dependent on the action of small RNA/proteins complexes called small nucleolar ribonucleoproteins (snoRNPs). They are divided into two main families: the so-called box C/D snoRNPs and box H/ACA snoRNPs. Each category performs specific enzymatic processes, 2’-O-methylation and pseudouridylation, respectively, and induces target-specific chemical modification on rRNAs. Few snoRNPs are also essential for pre-rRNA processing. The box C/D snoRNPs are formed by the association of a box C/D snoRNA with a set of four invariant proteins: Snu13p/SNU13, Nop1p/Fibrillarine, Nop56p/NOP56 and Nop58p/NOP58 (yeast/Human). Biogenesis of these RNPs relies on the action of several proteins complexes which constitute a dedicated assembly machinery. Rsa1p/NUFIP, Hit1p/ZNHIT3, and components of the R2TP complex are the best characterized protein actors of this machinery. Additional protein factors probably participate in box C/D snoRNP biogenesis; Bcd1p/ZNHIT6 (Box C/D snoRNA protein 1) is such a candidate as it is essential for the in vivo stability of box C/D snoRNAs, and it was found associated with proteins involved in this machinery in yeast and Human. However, the mechanism governing the recruitment of this protein towards the biogenesis of box C/D snoRNP, and the step of the assembly process relying on the presence of Bcd1p are still unknown. In S. cerevisiae and Human, in vivo and in vitro tools allowed us to improve the understanding of the functions of Bcd1p/ZNHIT6 in box C/D snoRNP assembly. Bcd1p is an assembly factor that is recruited co-transcriptionally on box C/D snoRNA loci, and is required for the recruitment of assembly complexes on nascent snoRNAs. Bcd1p is important for Nop58p association with the assembly factor Rsa1p, which suggests that its primary function is to recruit Nop58p to nascent pre-snoRNPs. This work evidenced important information on the essential role of Bcd1p in C/D snoRNP biogenesis and function