Escherichia coli is the best characterized bacterium; it grows rapidly, and it is easy to manipulate genetically. An increased knowledge about the physiology of this model organism will facilitate the development of engineered E.coli strains for applications such as production of biofuels and biofilm control. The aims of this work were the application of protein engineering to increase E. coli hydrogen production, the identification of the proteins regulating extracellular DNA production (eDNA), and the evaluation of the effect of the proteins synthesizing the signal 3'-5'-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) on biofilm formation. The Escherichia coli hydrogen production rate was increased 9 fold through random mutagenesis of fhlA. Variant FhlA133 (Q11H, L14V, Y177F, K245R, M288K, and I342F) enhances hydrogen production by increasing transcription of the four transcriptional units regulated by FhlA. The amino acid replacements E363G and L14G in FhlA increased hydrogen production 6 fold and 4 fold, respectively. The complete E. coli genome was screened to identify proteins that affect eDNA production. The nlpI, yfeC, and rna mutants increased eDNA production and the hns and rfaD mutants decreased eDNA production. Deletion of nlpI increases eDNA 3 fold while overexpression of nlpI decreases eDNA 16 fold. Global regulator H-NS is required for eDNA with E. coli since deletion of hns abolished eDNA production while overexpression of hns restored eDNA to 70 percent of the wild-type levels. Our results suggest that eDNA production in E. coli is related to direct secretion. Deletions of the genes encoding the diguanylate cyclases YeaI, YedQ, and YfiN increased swimming motility and eDNA as expected for low c-di-GMP levels. However, contrary to the current paradigm, early biofilm formation increased dramatically for the yeaI (30 fold), yedQ (12 fold), and yfiN (18 fold) mutants. Hence, our results suggest that c-di-GMP levels should be reduced for initial biofilm formation because motility is important for initial attachment to a surface.

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:41:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Higa_JulianaSuyama_M.pdf: 2740628 bytes, checksum: 20ced0f2848628f2541d4313632cfc0b (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Escherichia coli (E.coli) enteropatogênica (EPEC), é um dos agentes causadores de diarreia em crianças, principalmente em países em desenvolvimento. EPEC pode ser dividida em típica (tEPEC) ou atípica (aEPEC) pela presença ou ausência do plasmídeo EAF, respectivamente e, mais precisamente pela expressão da fímbria Bfp. Uma característica de EPEC é a capacidade de causar uma lesão histopatológica denominada "attaching and effacing" (lesão A/E) no epitélio intestinal e os genes responsáveis pela formação da lesão A/E estão localizados na ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement). Outra característica de EPEC é a formação de microcolônias que possibilitam a formação de biofilme. Um dos mecanismos de regulação da formação de biofilme envolve a molécula sinalizadora Bis-(3'-5')-monofosfato de guanosina cíclico (c-di-GMP), um mensageiro secundário universal em bactérias que está envolvido na regulação de uma grande variedade de processos celulares. Para exercer sua função, c-di-GMP precisa se ligar e alterar alostericamente a estrutura de uma molécula efetora. Um dos receptores conhecidos para c-di-GMP é YcgR, uma proteína de domínio PilZ que possui um sítio de ligação para c-di-GMP e está envolvida diretamente na regulação do movimento flagelar através da ligação do complexo YcgR-c-di-GMP às proteínas da base do motor flagelar. Existem poucos dados na literatura sobre as funções de YcgR, todos focados apenas no seu papel na regulação da motilidade. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência de YcgR na motilidade, formação de biofilme, adesão e formação de lesão A/E em um amostra de aEPEC do sorotipo O55:H7. O gene ycgR foi deletado da amostra selvagem através da técnica de recombinação homóloga proposta por Datsenko e Wanner (2000). A complementação da amostra mutante foi realizada através da clonagem do gene ycgR no plasmídeo de expressão pBAD Myc HisA. Os resultados obtidos indicam que a deleção do gene ycgR reduz a motilidade e aumenta a formação do biofilme inicial na amostra O55:H7. Além disso, a adesão em células epiteliais e a formação da lesão A/E também foram reduzidas em comparação à amostra selvagem. Os resultados fenotípicos corroboram os observados na análise transcricional dos genes eae, ler e espA, que participam da formação da lesão A/E, e dos genes bscA, fimA e csgD, envolvidos na formação do biofilme inicial. Com exceção do gene csgD que apresentou um aumento na transcrição na amostra mutante, todos os outros genes avaliados apresentaram uma menor transcrição em relação à amostra selvagem. Poucos trabalhos na literatura demonstram o papel do mensageiro secundário em amostras de E. coli patogênicas, assim, estes resultados são os primeiros descritos para uma amostra de aEPEC e possibilitam que no futuro novos estudos possam analisar com mais detalhes a participação de c-di-GMP na regulação de fatores de virulência não só de aEPEC mas também de outras E.coli patogênicas / Abstract: Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is a causative agent of diarrhea in children, especially in developing countries. EPEC can be categorized in 2 subgroups termed typical (tEPEC) or atypical (aEPEC) by the presence or absence of the EAF plasmid respectively, and more precisely by the expression of the Bfp fimbriae. One characteristic of EPEC is the ability to cause a histopathological lesion on epithelial cells called "attaching and effacing" (A/E lesion). The genes responsible for the production of the A/E lesion are encoded in a pathogenicity island named "locus of enterocyte effacement" (LEE). Another feature of EPEC is the formation of microcolonies, which allow biofilm formation. One of the regulation mechanisms of biofilm formation involves the signaling molecule bis- (3'-5') cyclic guanosine monophosphate (c-di-GMP), a ubiquitous second messenger in bacteria that participates in the regulation of a wide variety of cellular processes. To perform its function, c-di-GMP needs to bind and alter allosterically the structure of an effector molecule. One of the known (many?) receptors for c-di-GMP is YcgR, a Pilz domain protein that has a c-di-GMP binding site and is involved directly in the regulation of flagellar movement through the binding of the YcgR-c-di-GMP complex to flagellar motor proteins. There are few published data on the YcgR functions and they focus mainly on the role of the YcgR in motility regulation. The aim of this study was to evaluate the influence of YcgR in motility, biofilm formation, adhesion and A/E lesion formation in an aEPEC strain serotype O55:H7. ycgR gene deletion was performed by homologous recombination as proposed by Datsenko and Wanner (2000). Complementation of O55:H7 mutant strain was achieved by cloning ycgR in pBAD/Myc-HisA plasmid. The results indicate that the deletion of ycgR gene decreases the motility and increases the formation of initial biofilm on O55:H7 strain. Moreover, the adhesion on epithelial cells and the A/E lesion formation were also diminished in comparision to the wild type strain. The phenotypic results are consistent with the transcriptional analysis of eae, ler and espA genes involved in A/E lesion formation, and of bcsA, fimA and csgD genes involved in the initial steps of biofilm formation. With the exception of csgD gene that showed an increased transcription level in the mutant strain, all other analysed genes showed a decrease in transcription when compared to the wild type strain. Few studies demonstrate the role of a second messenger molecule in Escherichia coli pathogenic samples, and therefore, these results are the first report in this regard for an aEPEC strain. This work should encourage further studies in order to analyze in more detail the involvement of c-di GMP in the regulation of virulence factors not only in aEPEC, but also in other pathogenic Escherichia coli pathotypes / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular