SANTOS, A. K. S. Diagnóstico molecular e caracterização dos genes de virulência de infecção por Escherichia coli enteropatogênica em crianças no Semiárido Brasileiro. 2015. 110 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Carolinda Oliveira (ppgmm@ufc.br) on 2017-07-11T12:40:12Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_aksdossantos.pdf: 2114374 bytes, checksum: 97c602dc080778ec9538704944699720 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2017-07-11T13:49:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_aksdossantos.pdf: 2114374 bytes, checksum: 97c602dc080778ec9538704944699720 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T13:49:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_aksdossantos.pdf: 2114374 bytes, checksum: 97c602dc080778ec9538704944699720 (MD5) Previous issue date: 2015-07-13 / The Escherichia coli diarrheagenic (DEC) are important pathogens associated with intestinal infections. Among these, Escherichia coli (EPEC) is one of the most important etiological agents for the diagnosis of diarrhea in infantos. However, the epidemiology of infections by these pathogens remain poorly elucidated in much of the world, so this study aimed to evaluate the impact of EPEC infection in children with and without diarrhea 2-36 months of life of the Brazilian semiarid, study type observational case-control, which also examined the presence or absence of diarrhea in children participating. The study population consisted of 365 cases and 365 controls, and the cases, children with diarrhea history in the 14 days before you check for the study. Socioeconomic parameters were evaluated through epidemiological questionnaire. The diagnosis of EPEC was carried out by xMAP (Bioplex 200) based on the eaeA genes (chromosomal) and bfpA (plasmid). Samples identified as EPEC were analyzed for five Polymerase Chain Reactions (PCR) of the Multiplex type for 19 EPEC virulence factors widely investigated in literature: espB, espD, tir, espC, espZ, espL, Ler, Map, espG, espH, nleE, nleF, nleB, paa, nleC, nleD, espJ, cesT and espP. Among the 730 children, EPEC was diagnosed in 118 children. The typical EPEC proved in 1.7% of cases (6/365) and 0.6% of controls (2/635). While atypical EPEC was detected in 13.7% of cases (50/365) and 16.4% of controls (60/365). And all samples isolated EPEC genes read, cest, and espB were the most prevalent (67.7%; 58.4%; 54.2% and 52.5%) respectively. These are associated with the global regulation of pathogenicity island bacteria, as well as the secretion and translocation various effector proteins into the host cell, and microtubule destruction and disruption tight junctions. In contrast, the lowest prevalence of the tir gene was (4,2% - 5/118), an important component of bacterial adhesion to host cell. The prevalence of the espD gene, associated with liposaccharide membrane pore translocation protein, was significantly associated with cases (p = 0.0354) as compared to controls. In the hierarchical combination analysis of the virulence genes the data suggest that three groups of genes were important and associated with the cases compared to the controls. The presence of the Paa gene, related to the protein associated with enterocyte adhesion injury, but in the absence of other virulence genes such as espH, espJ and espG, related to actin polymerization, inhibition of phagocytosis and effector translocation blocker T3SS , Respectively, are associated with cases compared to controls. A set of virulence genes, the presence of espJ and in the absence of nleF. And another set of virulence genes, with presence of espC, and in the absence of espP. The data also showed that in the hierarchical combinations of the virulence genes, such as the presence of espP and in the absence of nleF, as well as the presence of espG and in the absence of tir were associated with protection in the controls compared to the cases. The data suggest that the prevalence of EPEC is relatively high in this child population in the Brazilian semi-arid region. / As cepas Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) são importantes patógenos associados às infecções intestinais. Dentre estes, a Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos agentes etiológicos mais relevantes para o diagnóstico de diarreias em infantos. Contudo a epidemiologia das infecções por esses patógenos permanecem pouco elucidadas em grande parte do mundo. Este trabalho objetivou avaliar o impacto da infecção por EPEC em crianças com e sem diarreia de 2-36 meses de vida no Semiárido Brasileiro, em estudo do tipo observacional caso-controle, que também examinou a presença ou ausência de diarreia nas crianças participantes. A população estudada consistiu em 730 crianças, 365 casos e 365 controles, sendo os casos, crianças com histórico de diarreia nos 14 dias antes à seleção para o estudo. Foram avaliados parâmetros socioeconômicos através de questionário epidemiológico. O diagnóstico de EPEC foi realizado pela técnica de xMAP (Bioplex 200) com base nos genes eaeA (cromossomal) e bfpA (plasmidial). As amostras identificadas como EPEC foram analisadas por cinco Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) do tipo Multiplex para 19 fatores de virulência de EPEC amplamente investigados na literatura: espB, espD, tir, espC, espZ, espL, Ler, Map, espG, espH, nleE, nleF, nleB, paa, nleC, nleD, espJ, cesT e espP. Entre as 730 crianças, a EPEC foi diagnosticada em 118 crianças. A EPEC típica mostrou-se em 1,7% dos casos (6/365) e em 0,6% dos controles (2/635). Enquanto a EPEC atípica foi detectado em 13,7% dos casos (50/365) e 16,4% dos controles (60/365). E de todas as amostras de EPEC isoladas, os genes ler, cesT, espB e espG foram os mais prevalentes (67,7%; 58,4%; 54,2%; e 52,5%), respectivamente. Estes estão associados com a regulação global da ilha de patogenicidade da bactéria, assim como a secreção e a translocação de diversas proteínas efetoras para dentro da célula do hospedeiro, e a destruição de micro túbulos e ruptura das junções firmes entre as células intestinais. Em contrapartida, o gene de menor prevalência foi o tir (4,2% - 5/118), importante componente para a aderência bacteriana a célula do hospedeiro. A prevalência do gene espD, associado com a proteína de translocação dos poros da membrana de lipossacarídeo, foi significativamente associado com os casos (p=0,0354) quando comparados com os controles. Na análise de combinação hierárquica dos genes de virulência os dados sugerem que três grupos de genes que foram importantes e associados com os casos comparados com os controles. A presença do gene Paa, relacionado com a proteína associado a lesão de aderência do enterócito, mas na ausência de outros genes de virulência como o espH, espJ e espG, relacionados com polimerização de actina, inibição de fagocitose e bloqueador de translocação de efetor T3SS, respectivamente, estão associados com os casos comparados com os controles. Um conjunto de genes de virulência, a presença de espJ e na ausência de nleF. E outro conjunto de genes de virulência, com presença de espC, e na ausência de espP. Os dados mostraram também que nas combinações hierárquicas dos genes de virulência, tais como a presença de espJ e na ausência de nleF, bem como a presença de espG e na ausência de tir foram associados com proteção nos controles comparados com os casos. Os dados sugerem que a prevalência de EPEC é relativamente alta nesta população infantil no semiárido brasileiro.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) constitui um importante patotipo de E. coli envolvido com doença diarréica. EPEC é dividida em dois sub-grupos, EPEC típica (tEPEC), portadora do plasmídio EAF (EPEC adherence factor), e EPEC atípica (aEPEC), desprovida desse plasmídio. EPEC produz lesão attaching-effacing (A/E) em células intestinais, determinada por genes contidos no locus of enterocyte effacement (LEE). LEE codifica um sistema de secreção tipo 3 (SST3), a adesina de membrana externa Intimina e várias proteínas efetoras que incluem Tir (receptor translocado de intimina). Entre as amostras de aEPEC isoladas em nosso meio, aquelas pertencentes ao sorotipo O51:H40 têm sido as mais frequentes. Em estudo anterior, analisamos 11 amostras de E. coli do sorotipo O51:H40 que apresentavam a região LEE aparentemente completa, 70 por cento das quais foram capazes de produzir a lesão A/E, conforme indicado pela positividade em um teste in vitro, que avalia o acúmulo de actina decorrente da lesão A/E. Para ampliar o conhecimento do potencial enteropatogênico dessas amostras, neste estudo, foram investigadas diversas propriedades genotípicas e fenotípicas, bem como o comportamento in vivo de amostras selecionadas em coelho e em rato. Foram pesquisados genes recém descritos em E. coli (lpfA1, cifA, ldaG, espJ, toxB, espM e espT) e a ocorrência de fosforilação de resíduos de tirosina na molécula Tir, em cultivos de células HeLa e células intestinais diferenciadas T84. Os resultados obtidos confirmam que o sorotipo O51:H40 contém amostras com potencial enteropatogênico, uma vez que 75 por cento das amostras testadas produziram lesão A/E em alça ileal de coelhos in vivo. Além disto, a aEPEC 1711-4, como a tEPEC E2348/69, apresentou capacidade significativa de translocar a mucosa intestinal em ensaios de translocação bacteriana (TB) em ratos, sendo que a aEPEC 1711-4 provocou também danos à perfusão tecidual. A ausência de translocação observada com mutante defectivo na montagem do SST3 (1711-4:escN- ) sugeriu que proteínas efetoras secretadas são importantes para a ocorrência do fenômeno. Em conclusão, o sorotipo O51:H40 de E. coli compreende amostras potencialmente enteropatogênicas, a maioria das quais deve ser classificada como aEPEC; o sobrecrescimento de pelo menos uma amostra de aEPEC, em intestino de rato, pode levar à translocação e a danos à microcirculação sistêmica.. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an important pathotype of E. coli involved in diarrheal disease. EPEC is divided into two groups, typical EPEC (tEPEC), carrier of plasmid EAF (EPEC adherence factor), and atypical EPEC (aEPEC), devoid of the plasmid. EPEC produces injury attachingeffacing (A/E) in intestinal cells, determined by genes in the locus of enterocyte effacement (LEE). LEE encodes a type 3 secretion system (SST3), the outer membrane adhesin of Intimin and several effector proteins including Tir (translocated receptor for intimin). Among aEPEC strains of isolated in our midst, those belonging to serotype O51: H40 have been the most frequent. In a previous study, we analyzed 11 strains of E. coli of serotype O51: H40 that had an apparently LEE region complete, 70% of which were of them was able to produce the lesion A/E, as indicated by a positive in vitro assay, which assesses the accumulation of actin due to the injury A/E. To increase the knowledge of the enteropathogenic potential of these strains in this study, we investigated several genotypic and phenotypic properties and the behavior of strains selected in vivo in rabbit and rat. We studied genes recently described in E. coli (lpfA1, cifA, ldaG, espJ, toxB, espM and espT) and the occurrence of residues of tyrosine phosphorylation in Tir molecule in cultures of HeLa cells and T84 intestinal cells differentiated. The results confirm that serotype O51: H40 includes strains with enteropathogenic potential, since 75% of the strains tested produced lesion A/E in the rabbit ileal loop in vivo. Moreover, the aEPEC 1711-4/89, as tEPEC E2348/69, showed significant ability translocation of the intestinal mucosa in bacterial translocation (BT) assays in rats, and the aEPEC 1711-4/89 also caused damage to tissue perfusion. The lack of translocation observed with mutant defect in the assembly of SST3 (1711-4: escN- ) suggested that secreted effector proteins are important for the occurrence of the phenomenon. In conclusion, serotype O51:H40 of E. coli includes potentially enteropathogenic strain, most of which should be classified as aEPEC; the overgrowth of at least one strain of aEPEC in intestine of rats, can lead to damage to the translocation and systemic microcirculation. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

SAMPAIO, I. C. Avaliação do transporte transmembrânico de glicose, glutamina e alanil-glutamina em íleo de camundongos nutridos e desnutridos infectados por Escherichia coli enteropatogênica. 2013. 94 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-27T13:12:05Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_icsampaio.pdf: 2023722 bytes, checksum: 5a90dfd95b7f17ad24c74e2d9e2301a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-27T13:12:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_icsampaio.pdf: 2023722 bytes, checksum: 5a90dfd95b7f17ad24c74e2d9e2301a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T13:12:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_icsampaio.pdf: 2023722 bytes, checksum: 5a90dfd95b7f17ad24c74e2d9e2301a5 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and malnutrition are a major cause of morbidity and mortality in developing countries. The purpose of this study was to evaluate the transport of Na+-glucose, Na+-glutamine and H+-alanyl-glutamine by measurement of short circuit current (Isc) and transepithelial resistance (TR) in the ileum of nourished and malnourished mice infected with EPEC. Albino mice of approximately 35 days of age were subjected to a standard diet or a diet deficient in proteins, lipids and minerals, the Regional Basic Diet (RBD). Of these animals was submitted to acute infection for 3 hours of direct contact with bacteria in isolated intestinal loop. For comparison, the same was done using the commensal bacterium Escherichia coli HS. They were anesthetized with ketamine and xylazine intramuscularly. The ileum was removed, dissected the serous membrane, open with a scalpel, segmented and mounted in Üssing chambers. The total mRNA was extracted and, from this, cDNA was done to analyze if malnutrition caused alterations in gene transcription of transporters as SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1 and CFTR and related proteins to cell junctions such as ZO-1, Claudin-1 and Claudin-2 and occludin. At the same time, immunofluorescence analysis of proteins SGLT-1, SN-1, SN-2 and PEPT-1 were performed. The results showed that EPEC reduced the area of the villi only during malnutrition (1,339 ± 0,1 mm²). But, the basal CCC did not alter (67,41 ± 2,0 μA/ cm²), while EPEC, E. coli HS and malnutrition, when isolated, reduced the basal CCC (65,96 ± 5,1 μA/ cm ², 72,51 ± 7,7 μA/ cm ² and 74,23 ± 5,7 μA/ cm²). However, malnutrition did not change the transport systems of glucose (ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²), glutamine (ΔCCC = 236.7 ± 43.32 μA/ cm²) and alanyl-glutamine (ΔCCC = 282,6 ± 39,10 μA/ cm²), because occured an increase in gene expression of SGLT-1 and PEPT-1 and increased synthesis of SGLT-1, SN-1, SN-2 and PEPT-1. Already EPEC altered glucose transport (ΔCCC = 102,6 ± 38,3 μA/ cm²), and E. coli HS decreased transport of glucose (ΔCCC = 103,5 ± 106,6 μA/ cm²) and glutamine (ΔCCC = 123,4 ± 106,5 μA/ cm²), whereas in undernourished animals EPEC reduced transport of glutamine (ΔCCC = 62,10 ± 42,7 μA/ cm²), and E. coli HS reduced levels of glucose absorption (ΔCCC = 84,40 ± 178,3 μA/ cm²). Therefore, these substrates may facilitate the recovery of the membrane and alleviate the vicious cycle of malnutrition, infection and diarrhea by increasing absorption (CCC) and the maintenance of normal intestinal permeability (Rt), but before using them for the treatment it is essential to evaluate the nutritional status of the host and the presence of pathogens in their intestinal epithelium. / A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e a desnutrição são uma das maiores causadoras de morbidade e mortalidade infantil em países subdesenvolvidos. Este estudo propõe avaliar o transporte de Na+-glicose, Na+-glutamina e H+-alanil-glutamina através da medida da corrente de curto circuito (CCC) e da resistência transepitelial (Rt) no íleo de camundongos nutridos e desnutridos infectados com EPEC. Camundongos albinos de 28 a 35 dias de idade foram submetidos a uma dieta padrão ou a uma dieta multideficiente em proteínas, lipídeos e minerais, a DBR. Parte desses animais foi submetida à infecção aguda por 3 horas de contato direto com a bactéria em alça ligada. Para comparações, o mesmo foi feito utilizando a bactéria comensal Escherichia coli HS. Foram anestesiados com ketamina e xilazina por via intramuscular. O íleo foi removido, dissecado da membrana serosa, aberto com bisturi, segmentado e montado em câmaras de Üssing. O mRNA total foi extraído e, a partir deste, foi feito o cDNA a fim de observar, por PCR em tempo real, se a desnutrição causou alteração na transcrição dos genes SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1, CFTR, ZO-1, Claudina-1 e Claudina-2 e Ocludina. Em paralelo, análise por microscopia confocal das proteínas SGLT-1, SN-1, SN-2 e PEPT-1 foi realizada. Os resultados mostraram que a EPEC reduziu a área dos vilos apenas durante a desnutrição (1,339 ± 0,1 mm²). Mesmo assim, não alterou a CCC basal (67,41 ± 2,0 µA/cm²), enquanto que a EPEC, a E. coli HS e a desnutrição, quando isoladas, reduziram a CCC basal (65,96 ± 5,1 µA/cm², 72,51 ± 7,7 µA/cm² e 74,23 ± 5,7 µA/cm²). Porém, a desnutrição não alterou os sistemas de transporte de glicose (ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²), glutamina (ΔCCC = 236,7 ± 43,32 µA/cm²) e alanil-glutamina (ΔCCC = 282,6 ± 39,10 µA/cm²) devido ao aumento na expressão da transcrição gênica de SGLT-1 e PEPT-1 e ao aumento da síntese de SGLT-1, SN-1, SN-2 e PEPT-1. Já a EPEC alterou o transporte de glicose (ΔCCC = 102,6 ± 38,3 µA/cm²), e a E. Coli HS diminuiu o transporte de glicose (ΔCCC = 103,5 ± 106,6 µA/cm²) e de glutamina (ΔCCC = 123,4 ± 106,5 µA/cm²), enquanto que, nos animais desnutridos, a EPEC reduziu o transporte de glutamina (ΔCCC = 62,10 ± 42,7 µA/cm²), e E. Coli HS reduziu os níveis de absorção de glicose (ΔCCC = 84,40 ± 178,3 µA/cm²). Portanto, é possível que esses substratos favoreçam a recuperação da membrana e aliviem o ciclo vicioso de desnutrição, infecção e diarreia através do aumento da absorção (CCC) e recuperação da normalidade da permeabilidade intestinal (Rt). Porém, deve-se avaliar o estado nutricional do hospedeiro e se há presença de patógenos associados, a fim de eleger o melhor substrato para cada caso.

CAVALCANTE, Paloma Araújo. Regulação das guanosina trifosfatases RHO na redução da migração de células intestinais induzida por cepas selvagem e padrão de Escherichia coli enteropatogênica. 2013. 94 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-09-24T11:04:57Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_pacavalcante.pdf: 1663971 bytes, checksum: 7616b7683ef04c5834f92d390bd4310a (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-09-24T11:10:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_pacavalcante.pdf: 1663971 bytes, checksum: 7616b7683ef04c5834f92d390bd4310a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-24T11:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_pacavalcante.pdf: 1663971 bytes, checksum: 7616b7683ef04c5834f92d390bd4310a (MD5) Previous issue date: 2013 / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an important pathogen associated with diarrheal diseases. Intestinal infections cause impairment of the intestinal barrier and one of the earliest response mechanisms to recover is migration of the intestinal cells to cover the injured area. The key proteins that regulate cell migration are small Rho GTPases, Rac1, Cdc42 and RhoA. The alanyl-glutamine (Ala-Gln) increases this migration process, however the mechanisms involved in this response are still unknown. Thus, we investigated the effect of a wild type strain and standard (E2348/69) of EPEC strain and a commensal E. coli HS on intestinal cell migration, as well as transcriptional regulation and gene expression of Rho GTPases and the role of supplemental Ala-Gln in the migration process in the presence or absence of infection. Infection by EPEC strains and commensal E. coli HS significantly reduced intestinal cell migration. However, this effect was more pronounced in cells infected by the strains of EPEC compared to those infected by the commensal strain of E. coli HS. We observed a high percentage of necrotic cells, about 30%, induced only by EPEC strain pattern 12 and 24 hours after infection. The addition of Ala-Gln in uninfected cells significantly stimulated in a dose dependent migration after 24 hours. However, when this nutrient was added over 12 and 24 hours in the presence of infection, there was no reversion of the damage. Regarding the gene expression of Rho GTPases, we observed an increase in transcription of rac1 in cells that had been infected by the strains of EPEC and E. coli HS as well as an increase in rhoA transcription in cells infected with EPEC strain pattern at 2 hours after infection. However, the analysis of proteins by immunofluorescence, RhoA and Cdc42 shown to be elevated in cells infected with EPEC pattern when compared to the control. Whereas cells infected with wild EPEC strain was observed an increase of Rac1 and reduction of RhoA. These data showed that cell migration is reduced mainly by the intestinal pathogenic strains of EPEC, in regulating gene transcription and expression of the protein Rho GTPases. Supplementation with Ala-Gln in intestinal cells only promoted cell migration in the absence of infection. / Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um importante patógeno associado às doenças diarreicas. Infecções intestinais ocasionam comprometimento da barreira intestinal e um dos primeiros mecanismos de resposta à recuperação é a migração das células intestinais. As principais proteínas que regulam esse processo são as pequenas GTPases Rho, Rac1, RhoA e Cdc42A. A alanil-glutamina (Ala-Gln) estimula este processo migratório, entretanto os mecanismos envolvidos nesta resposta ainda são desconhecidos. Desse modo, investigou-se o efeito de uma cepa selvagem e padrão (E2348/69) de EPEC, e de uma cepa comensal E. coli HS na migração celular intestinal, bem como a regulação da transcrição e expressão gênica das GTPases Rho e o papel da suplementação com Ala-Gln no processo de migração na presença ou ausência da infecção. A infecção pelas cepas de EPEC e pela cepa comensal reduziram significativamente a migração celular intestinal. Entretanto, houve uma maior redução desse efeito nas células infectadas pelas cepas de EPEC quando comparado àquelas infectadas pela cepa comensal de E. coli HS. Observou-se um alto percentual de células necróticas, cerca de 30%, induzido pela cepa padrão de EPEC apenas nos tempo de 12 e 24 horas após infecção. A adição da Ala-Gln em células não infectadas estimulou significativamente e de modo dose dependente a migração após 24 horas. Porém, quando esse nutriente foi adicionado durante 12 e 24 horas na presença da infecção, não houve uma reversão do dano. Em relação à expressão gênica das GTPases Rho, observou-se um aumento da transcrição de rac1 nas células que haviam sido infectadas pelas cepas de EPEC e E. coli HS, bem como um aumento da transcrição de rhoA nas células infectadas pela cepa padrão de EPEC após 2 horas da infecção. Todavia, na análise das proteínas por imunofluorescência, RhoA e Cdc42 mostraram-se aumentadas nas células infectadas pela EPEC padrão quando comparado ao controle. Enquanto que as células infectadas com a cepa selvagem de EPEC observou-se um aumento de Rac1 e redução de RhoA. Esses dados mostraram que a migração das células intestinais é reduzida principalmente pelas cepas patogênicas de EPEC, ao regular a transcrição e expressão gênicas das proteínas GTPases Rho. A suplementação com Ala-Gln em células intestinais promoveu a migração celular apenas na ausência da infecção.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Colégio Doutoral Franco Brasileiro (CDFB) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A principal diferença entre Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) típica (tEPEC) e atípica (aEPEC) é a presença do plasmídeo EAF (EPEC adherence factor) apenas em tEPEC. Apesar de os dois grupos promoverem uma lesão denominada attaching and effacing (lesão A/E) no epitélio intestinal, algumas diferenças em relação aos demais mecanismos de virulência podem existir. Neste estudo, duas amostras selvagens de aEPEC (1711-4, sorotipo O51:H40, e 3991-1, O não tipável, não móvel) foram analisadas quanto à capacidade de aderir, invadir, persistir e induzir a produção de IL-8 em células intestinais T84 e Caco-2, diferenciadas in vitro. Os resultados foram comparados com os obtidos com a amostra protótipo de tEPEC E2348/69. O papel do flagelo nos processos de adesão, invasão e indução da produção de IL-8 e de um sistema de secreção tipo III (SST3) na indução da produção de IL-8 foram também investigados com aEPEC 1711-4, utilizando-se mutantes isogênicos deficientes em flagelina ou EscN, respectivamente. As amostras aEPEC 3991-1 e 1711-4 aderiram significativamente mais às células T84 do que em Caco-2. Entretanto, aEPEC 1711-4 foi mais invasiva do que aEPEC 3991-1 e tEPEC E2348/69. Além disso, as amostras de aEPEC persistiram em ambas as linhagens celulares por um mínimo de 48 h, mas o índice de persistência foi maior para aEPEC 3991-1 em células Caco-2. Nesta linhagem celular, a produção de IL-8 foi significativamente maior nos tapetes celulares infectados com a amostra selvagem aEPEC 1711-4 em 3 h do que naqueles infectados com as demais amostras. Além disso, o mutante aEPEC 1711-4 ΔfliC induziu menor estimulação da produção de IL-8 em fase precoce (3 h), mas não no período tardio (24 h) após infecção. O mutante aEPEC 1711-4 ΔescN estimulou níveis de IL-8, em três horas, significativamente mais elevados do que a amostra selvagem, o que sugere um papel antiinflamatório dos efetores injetados pelo SST3 durante a fase inicial da interação bactéria-célula hospedeira. Nossos achados indicam que aEPEC é um patotipo heterogêneo quanto a sua habilidade de aderir, invadir, persistir e induzir a produção de IL-8, e sugerem que algumas aEPEC podem ser mais eficientes em induzir resposta inflamatória do que a tEPEC protótipo E2348/69. Na infecção de enterócitos in vitro, a integridade do flagelo da aEPEC 1711-4 é necessária para adesão e invasão eficientes e estimulação precoce, mas não tardia, da produção de IL-8. / The main difference between typical (tEPEC) and atypical (aEPEC) enteropathogenic Escherichia coli is the presence of EPEC adherence factor (EAF) plasmid in tEPEC. Although both groups can promote attaching and effacing lesions in the intestinal epithelium, some differences concerning virulence mechanisms may exist. In this study two wild type aEPEC strains (1711-4, serotype O51:H40 and 3991-1, O non typeable non motile) were analyzed concerning their capacity to adhere to, invade, persist and stimulate IL-8 production by differentiated epithelial intestinal cells Caco-2 and T84 in vitro. Results obtained with aEPEC strains were compared to those obtained with the tEPEC prototype strain E2348/69. The role of flagellum in adhesion, invasion and stimulation of IL-8 production and that of a type III secretion system (T3SS) were also investigated with aEPEC 1711-4, using isogenic mutants deficient in flagellin or EscN, respectively. aEPEC strains 3991-1 and 1711-4 adhered significantly more to T84 than to Caco-2 cells. On the other hand, aEPEC 1711-4 was more invasive than aEPEC 3991-1 and tEPEC E2348/69. Besides that, aEPEC strains persisted in both cell lineages for a minimum of 48 hours, although this index was higher for aEPEC 3991-1 in Caco-2 cells. In this cell lineage, IL-8 production was significantly higher in monolayers infected with the wild type aEPEC strain 1711-4 in 3 hours after infection than in those monolayers infected with other strains. Moreover, the aEPEC mutant 1711-4 ΔfliC induced lower IL-8 levels in early phase (3 h) but not at late phase (24 h). The aEPEC mutant 1711-4 ΔescN stimulated IL-8 levels, in early phase, significantly higher than that induced by the wild type strain, indicating an anti-inflammatory role for the effectors injected by the T3SS during the initial interaction between bacteria and host cell. Our findings indicate that aEPEC is a heterogeneous group of pathogens concerning their ability to adhere to, invade, persist and stimulate IL-8 production and suggests that some aEPEC are more prone to induce inflammatory response than the prototype tEPEC strain E2348/69. In the in vitro infection model of enterocytes, the integrity of flagella of aEPEC 1711-4 is necessary for efficient adhesion, invasion and early but not late stimulation of IL-8 production. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4558_1.pdf: 1181663 bytes, checksum: 7ba0bd46a0d99f1d1a726aa959691db3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Introdução: O colostro humano é de fundamental importância nutricional para o desenvolvimento do recém-nascido além de atuar como uma primeira linha de defesa imunológica contra patógenos presentes no ambiente externo ao útero materno. Dentre as moléculas do colostro humano com propriedades antiinfecciosas, a IgA secretora é o principal e mais abundante anticorpo. Esta imunoglobulina inativa fatores de virulência da Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), principal causadora de diarréia em crianças com até 1 ano de idade.Objetivo: Determinar e comparar as concentrações de IgA secretora (IgAS) total e anti-EPEC em colostro de mães eutróficas e desnutridas atendidas em um hospital público da cidade do Recife(PE). Materiais e Métodos: Foram coletadas amostras de colostro de 15 mães eutróficas e 10 mães desnutridas. O estado nutricional materno foi avaliado segundo variáveis antropométricas (peso, estatura e índice de massa corporal). As concentrações de IgAS total e IgAS anti-EPEC foram determinadas por enzyme-linked immunoassay (ELISA). Resultados: As concentrações de IgAS total do colostro das mães eutróficas e desnutridas foram 2390,16 ± 650,06 &#956;g/ml e 2490,96 ± 418,06 &#956;g/ml, respectivamente. Os níveis de IgAS anti-EPEC do colostro das mães eutróficas e desnutridas foram 1668,03 ± 1199,98 &#956;g/ml and 1038,79 ± 573,99 &#956;g/ml, respectivamente. A comparação entre as concentrações de IgAS total e IgAS anti-EPEC das amostras de colostro de mães eutróficas e desnutridas não apresentou diferença significativa (Teste U de Mann-Whitney, p<0,05). Conclusão: O aleitamento materno exclusivo, como forma de combate às infecções por EPEC, deve ser incentivado mesmo diante de uma desnutrição materna

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Silva.pdf: 1665108 bytes, checksum: 8a2eda0da827e922952dbcfec94773cd (MD5) Previous issue date: 2016-11-21 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Escherichia coli (EPEC) was frequent cause of many cases of diarrhea in Brazil and around the world, and one of the main agents responsible for high mortality rates among children aged 0-5 years. EPEC is known to cause histological damage to the microvilli of enterocytes, characterized by the formation of a shaped support ultrastructure. One of the factors responsible for pathogenicity is complex BFP (bundle forming pili). The presence of genes BfpA promotes adhesion and consequently the injury of EPEC strains characterized as typical. Differently, some EPEC strains lack EAF (EPECBfpA-) causing lesions shaped as pedestal, but more slowly, called atypical EPEC. BfpA is known as immunogenic and recently the incidence of atypical (EPECBfpA-) is increasing, it is believed that these bacteria injury occurs through other means making it important to develop strategies for identifying. In this study several predicted peptide sequences were synthesized, to produce polyclonal antibodies and anti-EPEC -BfpA in BALB / c antibodies that are used to target specific identification of typical and atypical EPEC. To achieve the objectives of bioinformatics tools and prediction of protein epitopes immuneepitope B were used for antigenic regions specific mapping for the EPEC two phenotypes. Synthetic peptides were purchased to immunize Balb / C mice, so the antisera are evaluated for specificity EPEC. As results, it was possible to construct and synthetize six linear BfpA peptides (P1-P6). P6 peptide was selected as the product of this study due to its ability to induce the antibodies production against this protein and this serum recognize the native protein in typical EPEC strains. We believe that the functional characterization of these antibodies by developing new tools will help in the diagnosis of these two specific strains of EPEC and will contribute to studies involving these bacteria. / A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) tem sido causa frequente de muitos casos de diarreia no Brasil e no mundo, além de ser um dos principais agentes responsáveis pelas taxas de mortalidade entre as crianças de 0 a 5 anos de idade. A EPEC causa uma lesão histológica nas microvilosidades dos enterócitos caracterizada pela formação de uma ultraestrutura em forma de pedestal. Um dos fatores de patogenicidade responsável é o complexo BfpA (bundle forming pili). A BfpA promove a adesão das cepas de EPEC denominadas como típicas. Diferentemente, algumas cepas de EPEC são desprovidas do Fator de Aderência de Escherichia coli -EAF (EPECBfpA-) e tendem a provocar as lesões típicas de pedestal com mais lentidão e por isso são denominadas EPEC atípicas. Como a BfpA é uma proteína imunogênica e recentemente a incidência de EPECBfpA- atípicas vem aumentando, acredita-se que a lesão por estas bactérias ocorra por outras vias tornando importante o desenvolvimento de estratégias para sua identificação. Neste estudo várias sequências antigenicamente preditas foram usadas para sintetizar peptídeos a fim de produzir anticorpos policlonais anti-BfpA em camundongos BALB/c visando a identificação específica da EPEC típica. Para alcançar os objetivos, inicialmente ferramentas de bioinformática de proteínas e de predição de epítopos B foram utilizadas para mapeamento de regiões antigênicas específicas para EPEC. Peptídeos sintéticos foram adquiridos para a imunização de camundongos Balb/c, afim de que antissoros fossem avaliados quanto a especificidade à EPEC. Como resultados foi possível a construção e síntese de seis peptídeos lineares de BfpA (P1-P6). O peptídeo P6 foi selecionado como produto deste estudo devido a habilidade de induzir a produção de anticorpos contra esta proteína e este soro reconhecer a proteína nativa em cepas de EPEC típica. Acredita-se que a caracterização funcional destes anticorpos permita o desenvolvimento de ferramentas para o diagnóstico específico das duas linhagens de EPEC visando a contribuição para estudos futuros sobre o controle do processo fisiopatológico no intestino.

Orientador: Rodrigo Tavanelli Hernandes / Resumo: O principal mecanismo de virulência de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é a capacidade de causar uma lesão histopatológica na mucosa intestinal denominada attaching and effacing (AE), caracterizada pela aderência íntima das bactérias, destruição das microvilosidades e formação de estruturas semelhantes a pedestais, ricos em F-actina, nos enterócitos infectados. Genes do locus of enterocyte effacement (região LEE) codificam todas as proteínas necessárias para a formação da lesão AE. As EPEC são divididas em típicas (tEPEC) e atípicas (aEPEC), com base na presença do EPEC adherence factor plasmid no primeiro grupo. A partir de um conjunto de sete amostras de aEPEC pertencentes ao sorotipo O2:H16, obtidos de surtos e casos esporádicos de diarreia, mostramos que cinco deles produziram uma adesão híbrida localizada/difusa (AL/AD) em células HeLa. Neste estudo, uma amostra de aEPEC deste sorotipo (282/14), que produziu o padrão AL/AD, foi selecionada para investigar as estruturas bacterianas envolvidas em seu fenótipo adesivo. Para este propósito, a amostra de aEPEC 282/14 foi mutagenizada usando o kit EZ::TN <R6Kyori/KAN-2> Tnp transposome kit, gerando uma biblioteca de inserções Tn5. Esses mutantes de inserção Tn5 foram testados quanto a perda ou redução da capacidade aderente, em ensaios realizados em 6 h de incubação com células HeLa. Dentre 320 clones pesquisados, nove foram considerados deficientes em sua capacidade de interagir com células epiteliais e quatro deles a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main virulence mechanism of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is the capacity to cause a histopathological lesion on the intestinal mucosa, termed Attaching and Effacing (AE); characterized by intimate bacterial adherence, microvillus destruction and formation of F-actin rich pedestal-like structures, in infected enterocytes. Genes of the locus of enterocyte effacement (LEE region) encode all proteins necessary for AE lesion formation. EPEC are divided in typical (tEPEC) and atypical (aEPEC), based on the presence of the EPEC adherence factor plasmid in the former group. From a collection of seven aEPEC O2:H16, obtained from outbreak and sporadic cases of diarrhea, we showed that five of them produced a hybrid localized/diffuse adherence (LA/DA) in HeLa cells. In this study, we selected one aEPEC isolate of this serotype (282/14) that produced the LA/DA pattern, to investigate the bacterial structures involved in its adhesive phenotype. For this purpose, aEPEC 282/14 was mutagenized using the EZ::TN < R6Kyori/KAN-2 > Tnp transposome kit, generating a library of Tn5 insertions. These Tn5 insertion mutants were screened for non-adherent or less adherent mutants, in assays performed in 6 h of incubation with HeLa cells. Among the 320 clones screened, nine were considered deficient in their ability to interact with epithelial cells, and four of them presented the Tn5 insertion in genes within the LEE region, such as tir, escV, and grlR. In order to confirm the role of ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Um estudo prévio descreveu uma cepa de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) do sorotipo O142:H34 (Ec48/66) que apresentava o padrão de adesão agregativa (AA), característico de E. coli enteroagregativa (EAEC), e os genes eae e aatA. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel de fímbrias no padrão AA dessa cepa. A mesma aderiu no padrão AA nas linhagens HeLa, HEp-2, HT-29 e T84, além de causar a lesão A/E em células HeLa e HT-29. Foi detectada a presença dos genes que compõem o operon da fímbria AAF/I de EAEC e da fímbria E. coli common pilus (ECP). Ambos os operons foram sequenciados mostrando alta identidade com os operons presentes em EAEC (agg) e EPEC (ecp). Mutantes nos genes aggC e ecpC mantiveram o padrão AA e a capacidade de causar a lesão A/E em células HeLa. O mutante em aggC apresentou diminuição significativa da adesão. Análises filogenéticas posicionaram essa cepa em um grupo constituído por EPEC. A cepa Ec48/66 é uma EPEC atípica que expressa o padrão AA, o qual é parcialmente dependente de uma variante de AAF/I, mas não de ECP. / A previous study described a strain of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), serotype O142:H34 (Ec48/66), presenting the aggregative adherence pattern (AA), typical of enteroaggregative E. coli (EAEC), and the eae and aatA genes. The aim of this study was to evaluate the role of fimbriae in the AA pattern of Ec48/66. This strain presented the AA pattern in HeLa, HEp-2, HT-29 and T84 cells, and the ability to cause the A/E lesion in HeLa and HT-29 cells. The presence of the genes comprising the operons of AAF/I fimbriae and E. coli common pilus (ECP) was detected. Both operons were sequenced showing high identity with the operons present in EAEC (agg) and EPEC (ecp). Mutants in the aggC and ecp genes maintained the AA pattern and the ability to cause the A/E lesion in HeLa cells. The aggC mutation significantly reduced the adherence. Phylogenetic analyzes located the strain in the group consisting of EPEC. The Ec48/66 strain is an atypical EPEC expressing the AA pattern, which is partially dependent on a variant of AAF/I, but not on ECP.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:54Z : No. of bitstreams: 1 Publico-115.pdf: 983090 bytes, checksum: 7f674d882f7cc66c5e1e6fe6b081c85c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e Programa Brasil Alemanha / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC) produz lesão attaching/effacing (A/E) em células eucarióticas mediada pela adesina de membrana externa intimina. EPEC são sub-agrupadas em típica (tEPEC) e atípica (aEPEC). Recentemente demonstramos que a amostra de aEPEC 1551-2 (sorotipo O não-tipável, não-móvel) invade células HeLa por um processo dependente da expressão de intimina do subtipo omicron. Neste estudo, avaliamos se amostras de aEPEC expressando diferentes subtipos de intimina também são invasoras utilizando ensaios quantitativos de proteção com gentamicina. Também avaliamos se aEPECs invadem células intestinais diferenciadas T84 e Caco-2. Cinco das seis amostras testadas invadiram células HeLa e T84 numa faixa de 13.3%-20.9% e 5.8%-17.8%, respectivamente, do total de bactérias associadas às células. As amostras estudadas foram significantemente mais invasoras que a amostra protótipo de tEPEC E2348/69 (1.4% e 0.5% em células HeLa e T84, respectivamente). A amostra 1551-2 foi ainda testada em células Caco-2 diferenciadas, o que resultou num índice de invasão semelhante àqueles obtidos em células T84 (7,5%±1,7) e também significantemente maior que a tEPEC E2348/69 (1,8%±0,6). A invasão de células T84 foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos ainda que a invasão de células HeLa por aEPEC 1551-2 depende de filamentos de actina, mas não de microtúbulos. Além disso, a infecção de monocamadas não diferenciadas e o rompimento das tight junctions aumentaram a eficiência da invasão de células T84, sugerindo uma via de invasão preferencial pela superfície não diferenciada. Em resumo, amostras de aEPEC podem invadir cultura de células in vitro com eficiência variável e independentemente de subtipo de intimina. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) produce attaching/effacing (A/E) lesions on eukaryotic cells mediated by the outer membrane adhesin Intimin. EPEC are subgrouped into typical (tEPEC) and atypical (aEPEC). We have recently demonstrated that aEPEC strain 1551-2 (serotype O non-typable, non-motile) invades HeLa cells by a process dependent on the expression of intimin subtype omicron. In this study, we evaluated whether aEPEC strains expressing other intimin subtypes are also invasive using the quantitative gentamicin protection assay. We also evaluated whether aEPEC invade intestinal differentiated T84 cells. Five of six strains invaded HeLa and T84 cells in a range of 13.3%-20.9% and 5.8%-17.8%, respectively, of the total cellassociated bacteria. The strains studied were significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.4% and 0.5% in HeLa and T84 cells, respectively). aEPEC strain 1551-2 was also tested in differentiated Caco-2 cells, resulting in an invasion index similar to that obtained in T84 cells (7.5%±1.7%). This strain was also significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.8%±0.6%). Invasiveness of T84 cells was confirmed by transmission electron microscopy. We also showed that invasion of HeLa cells by aEPEC 1551-2 depended on actin filaments, but not on microtubules. In addition, infection of non-differentiated monolayers and disruption of tight junctions enhanced its invasion efficiency in T84 cells, suggesting preferential invasion via a non-differentiated surface. In summary, aEPEC strains may invade intestinal cells in vitro with varying efficiencies and independently of the intimin subtype. / CAPES - Probral: 281/07 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações