Universiẗat, Diss., 2007--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Univ., Diss., 2009--Frankfurt (Main).

Um eine Verbindung zwischen den bereits bekannten in vitro-Effekten und der bislang weitgehend ungeklärten in vivo-Situation zu knüpfen, wurden der intestinale Metabo-lismus sowie die Lipoxygenase-hemmenden Eigenschaften von ausgewählten sekun-dären Pflanzeninhaltsstoffen mit verschiedenen Modellsystemen untersucht. Folgende kamen zur Anwendung: intestinaler Metabolismus Lipoxygenase-hemmende Eigenschaften - menschlicher Speichel - Soja Lipoxygenase-1 - künstlicher Magensaft - 5-Lipoxygenase aus humanen neu- - Ileostomabeutelinhalt trophilen Granulozyten - Kolostomabeutelinhalt Die ex vivo-Modellsysteme (Ileo- und Kolostomabeutelinhalte, 5-Lipoxygenase aus menschlichen neutrophilen Granulozyten) wurden speziell auf metabolische Kompe-tenz beziehungsweise Zellvitalität überprüft. Die verwendeten Darminhalte wiesen ein breites Spektrum an Enzymaktivitäten und angemessene Zahlen anaerober kolonien-bildender Einheiten auf. Nach Isolierung der neutrophilen Granulozyten aus periphe-rem Humanblut erwiesen sich sowohl Zellvitalität (> 90% lebende Zellen) als auch Zellkonzentration (> 5000 Zellen/ µl) für unsere Studien als geeignet. Mit diesen sorg-fältig geprüften Modellsystemen wurden folgende Anwendungen untersucht: I. Einfluss des Zuckerrests, der Aglyconstruktur und der Mikroflorakonzentration auf die Hydrolyse von Phenolglycosiden im menschlichen Dünndarm II. Inkubation der gegen ileale Hydrolyse/Abbau resistenten Verbindungen mit Kolostomabeutelinhalten III. Einfluss des Zuckerrests und der Aglyconstruktur auf die Hydrolyse von Hei-delbeeranthocyanen im menschlichen Dünn- und Dickdarm IV. Metabolismus von D-Galacturonsäure und amidiertem Pektin V. Flavonoide und deren intestinale Metabolite als Soja Lipoxygenase-1-Inhibi-toren VI. Anthocyane als Lipoxygenase-Inhibitoren: Studien mit Soja Lipoxygenase-1 sowie 5-Lipoxygenase aus menschlichen neutrophilen Granulozyten Hierzu wurden Quercetin- und p-Nitrophenolglycoside (hier: 3-O-β-D-Glucoside, 3-O-β-D-Galactoside, 3-O-α-L-Arabinoside, 3-O-β-D-Xyloside und 3-O-α-L-Rhamno-side), anthocyanreicher Heidelbeerextrakt, D-Galacturonsäure und amidiertes Pektin unter anaeroben edingungen bei 37°C für 24 beziehungsweise 10 h mit Ileostoma-beutelinhalten von gesunden Probanden inkubiert. Zusätzlich wurden Quercetin, Quer-cetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid, Chlorogensäure, Procyanidin B2, (-)-Epicatechin, Phloretin, D-Galacturonsäure und amidiertes Pektin unter anaeroben Bedingungen bei 37°C für 24 h mit Kolostomabeutelinhalten von gesunden Probanden inkubiert. Die Substrate und Metabolite wurden mittels Hochdruckflüssigchromatographie-Dioden-array-Detektion (HPLC-DAD) und HPLC-Elektrospray-Ionisierung-Tandemmassen-spektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS) identifiziert. Die Gehalte von D-Galacturonsäure und amidierten Pektin wurden nach Carbazolreaktion photometrisch bestimmt. Metha-nol wurde via Headspace Solid-phase Microextraction Gaschromatographie/Massen-spektrometrie (HS-SPME-GC/MS) gemessen; die Bestimmung kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) erfolgte mittels GC-Flammenionisations-Detektion (GC-FID). Die Enzym-versuche wurden spektrophotometrisch ausgewertet, wobei die Bildung des Hydroper-oxidprodukts bei 234 nm beziehungsweise 236 nm verfolgt wurde. / To develop a link between the already known in vitro effects of various secondary plant constituents and the still unclear in vivo situation, both the intestinal metabolism and the lipoxygenase-inhibitory properties of selected secondary plant constituents were studied with various model systems. The following were applied: intestinal metabolism lipoxygenase-inhibitory properties - human saliva - soybean lipoxygenase-1 - simulated gastric juice - human neutrophil granulocyte - human ileostomy fluid 5-lipoxygenase - human colostomy fluid The ex vivo model systems (i.e. ileostomy and colostomy fluids, human neutrophil granulocyte 5-lipoxygenase) were particularly checked for metabolic competence and cell viability, respectively. The screened intestinal fluids showed a broad range of enzymatic activities and proper counts of anaerobic colony forming units. After isola-tion of neutrophil granulocytes from human peripheral blood, the cell vitality (> 90% viable cells) and cell concentration (> 5000 cells/ µl) were adequate for our studies. With these carefully proved model systems, the following applications were perfor-med: I. Influence of sugar moiety, aglycon structure and microflora concentration on the human ileal hydrolysis of phenol glycosides II. Incubation of compounds resistant to ileal hydrolysis/degradation with human colostomy fluids III. Influence of sugar moiety and aglycon structure on the hydrolysis of bilberry anthocyanins in the small and large intestine of humans IV. The metabolism of D-galacturonic acid and amidated pectin V. Flavonoids and corresponding intestinal metabolites as soybean lipoxygenase-1 inhibitors VI. Anthocyanins as lipoxygenase inhibitors: studies with both soybean lipoxyge-nase-1 and human neutrophil granulocyte 5-lipoxygenase Thus quercetin and p-nitrophenol glycosides (i.e. 3-O-β-D-glucosides, 3-O-β-D-galac-tosides, 3-O-α-L-arabinosides, 3-O-β-D-xylosides and 3-O-α-L-rhamnosides), antho-cyanin-rich bilberry extract, D-galacturonic acid and amidated pectin were incubated under anaerobic conditions at 37°C for 24 and 10 h, respectively, with ileostomy fluids from healthy volunteers. In addition, quercetin, quercetin 3-O-α-L-rhamnoside, chlo-rogenic acid, procyanidin B2, (-)-epicatechin, phloretin, D-galacturonic acid and ami-dated pectin were incubated under anaerobic conditions at 37°C for 24 h with colo-stomy fluids from healthy volunteers. The substrates and metabolites were identified by high performance liquid chromatography-diode array detection (HPLC-DAD) and HPLC-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). The contents of D-Galacturonic acid and amidated pectin were determined photometrically after carbazole reaction. Methanol was measured via headspace solid-phase microex-traction gas chromatography/mass spectrometry (HS-SPME-GC/MS) and short chain fatty acids (SCFA) were determined by GC-flame ionisation detection (GC-FID). The enzyme assays were analyzed spectrophotometrically, monitoring the appearance of hydroperoxide products at 234 nm and 236 nm, respectively.

Catechine gehören als Flavan-3-ole zur Gruppe der Polyphenole. Aufgrund deren vielfältiger positiver Effekte auf den menschlichen Organismus nehmen sie in der Ernährungsforschung einen hohen Stellenwert ein. Dabei hat man bei den Flavan-3-olen meist nur die in der Natur vorherrschenden Isomere (+)-Catechin und (-)-Epicatechin untersucht, doch auch (-)-Catechin und (+)-Epicatechin sind Naturstoffe. Letztere findet man z.B. in Guarana oder in verarbeiteten Lebensmitteln, wie z.B. Kakao- und Kakaoerzeugnissen. Sie entstehen durch Epimerisierung unter den technologischen Bedingungen beim Rösten der Kakaobohnen und der Alkalisierung der Kakaomasse. Bei der Kakao-Verarbeitung werden ferner auch Catechin-C-Glykoside gebildet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Stabilitätsstudien mit (+)-Catechin bei unterschiedlichen pH-Werten und Temperaturen durchgeführt. Der zweite Teil dieser Arbeit umfasst Untersuchungen von Catechin-Isomeren und zwei Catechin-C-Glykosiden auf ihren Einfluß auf die Lipoxygenase (LOX)- und Xanthinoxidase (XOD)-Aktivität. Für die Catechin-C-Glykosidbildung ist von uns eine neue Vorstellung zu deren Entstehungsmechanismus im Laufe der Lebensmittelverarbeitung entwickelt worden. Abschließend wurden anhand von Modelling-Studien die Effekte auf die Enzymsysteme erklärt. / As flavan-3-ols, catechins belong to the group of polyphenols. Due to their manifold positive effects on the human organism, catechins are of important significance in food research. Although only the two most abundant isomers in nature, (+)-catechin and (-)-epicatechin, have been studied in most cases; however, (-)-catechin and (+)-epi-catechin occur in nature as well. The latter are found i.e. in guarana or in processed food, as cacao and cacao products as the result of epimerization due to technological processing, i.e. while roasting the cocoa beans and alkalisation of the cacao mass. Catechin-C-glycosides are also formed during cacao processing. In the first part of this thesis stability studies with (+)-catechin at different pH values and temperatures were carried out. The second part of this work comprises analysis of catechin isomers and two catechin-C-glycosides on their influence on lipoxygenase (LOX)- and xanthinoxidase (XOD)-activity. For the building mechanism of catechin-C-glycosides during food processing a new hypothesis was developed. Finally the effects on enzyme systems were explained by means of modelling studies.

University, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Zsfassung in engl. und dt. Sprache.

Tübingen, Univ., Diss., 2007.

Univ., Diss., 2005--Frankfurt (Main) / Zsfassung in engl. und dt. Sprache

Leukotriene sind, neben anderen Arachidonsäuremetaboliten, wichtige Mediatoren in Entzündungsprozessen. Um ihre Rolle bei den pathophysiologischen Prozessen nach Ischämie und Reperfusion des Herzmuskels aufzuklären, wurden Wildtyp-Mäuse und 5-LOX-KO-Mäuse, die keine Leukotriene produzieren können, untersucht. Die linke vordere Herzkranzarterie wurde für 30min ligiert und 24h in vivo reperfundiert. Bei den KO-Mäusen fand sich zwar eine signifikant höhere Anzahl eingewanderter Neutrophiler im reperfundierten Gewebe, dagegen ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen Wildtyp- und KO-Mäusen bezüglich der resultierenden Infarktgröße und bezüglich der im Gewebe gemessenen Menge an TNF-a. Demnach lässt sich kein Einfluss der 5-Lipoxygenase-Ausschaltung auf den Entzündungsprozess nach Myokardischämie und die Entstehung eines Reperfusionsschadens feststellen. / Leukotrienes are arachidonic acid derivatives that function as important mediators in inflammatory response reactions. To investigate their role in the pathophysiological processes after ischemia and reperfusion of the heart, wildtype mice and 5-LOX-KO-mice that cannot produce leukotrienes were compared using a mouse model of myocardial ischemia and reperfusion. The left anterior coronary artery was ligated for 30 minutes and then reperfused for 24 hours. This yielded no significant difference between wildtype and KO mice with regard to infarct size and amount of TNF-a measured in the heart tissue, even though there was a significantly larger number of infiltrating neutrophiles in the heart tissue of the KO mice. We conclude that there is no effect of the 5-lipoxygenase-knockout on the inflammatory response following myocardial ischemia or on the developing reperfusion injury.

Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. / cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities.