El análisis de los materiales constituyentes de obras de arte y objetos arqueológicos esde gran importancia para los estudios arqueométricos, así como los conservativos yrestaurativos dirigidos al conocimiento y acondicionamiento del patrimonio histórico ycultural. Dicho análisis, generalmente, se ve condicionado por la necesidad de utilizarmétodos de análisis no destructivos, así como micro- o submicromuestras, en el caso deque se requiera tomarlas del objeto estudiado.No obstante, en este contexto, uno de los problemas analíticos más frecuentes esla identificación de los pigmentos pictóricos presentes en lienzos, pinturas murales,policromías, tejidos, etc. Aunque para este propósito se dispone de métodos analíticosbien establecidos, los análisis sobre muestras reales se ven dificultados por la elevadadilución del pigmento en el conjunto de la muestra, la coexistencia de diferentespigmentos y la presencia de aglutinantes, capas de preparación y películas protectoras.Todo ello hace deseable la búsqueda de métodos alternativos a los empleadostradicionalmente (microscopía electrónica, espectrometría infrarroja, etc.) quecompleten el abanico de técnicas disponibles al servicio de la Arqueometría y laConservación y Restauración.En este marco se ha venido desarrollando en el Departamento de QuímicaAnalítica de la Universidad de Valencia, en colaboración con el Departamento deConservación y Restauración de Bienes Culturales de la Universidad Politécnica deValencia, una línea de investigación dirigida a la aplicación de técnicasvoltamperométricas al análisis de materiales y objetos arqueológicos y artísticos. Es unalínea de trabajo basada en las aportaciones de una rama de la Electroquímica del EstadoSólido, que se denomina Voltamperometría de Micropartículas, dirigida a lacaracterización de micromuestras sólidas mediante el registro de su respuestavoltamperométrica. Esta metodología se inspira directamente en los trabajos de Scholz,Grygar y colaboradores en los 90, basados a su vez en los trabajos clásicos de Lamache,Bauer y Brainina, entre otros, en los 70 y 80. La estrategia adoptada consiste en utilizarla muestra a estudiar como modificador electródico, depositando unos pocosmicrogramos de ella sobre la superficie de un electrodo inerte, habitualmente de grafito,y registrando posteriormente la respuesta electroquímica en contacto con un medioelectrolítico adecuado.En la presente Tesis se ponen a punto métodos voltamperométricos para laidentificación de pigmentos orgánicos e inorgánicos, así como de los procesos dealteración que algunos de ellos pueden sufrir, y su posterior aplicación al análisis demuestras reales procedentes de objetos artísticos y arqueológicos. Para ello secaracterizan mecanismos de reacción y parámetros electroquímicos como el potencialde pico y el coeficiente de electrotransferencia. También se desarrollan métodos para laespeciación y la identificación de componentes pigmentantes y productos de alteraciónen materiales cerámicos y vítreos. Los resultados obtenidos en cada caso se validanmediante el empleo de técnicas no electroquímicas y también, se estudia la aplicaciónde estrategias que faciliten la identificación de forma inequívoca, como son las técnicassustractivas, deconvolutivas, la preparación de muestras sintéticas multicomponentes yel tratamiento de datos mediante representaciones como las de Tafel, entre otras.Los resultados obtenidos en las diferentes etapas de la investigación llevada acabo, han dado lugar a la publicación de diversos trabajos en importantes revistascientíficas dentro del campo de la Química Analítica, los cuales son la base de lapresente Tesis. / Chemical analysis of materials from art and archeological objects is undoubtedly oneof the most important aspects of archaeometry, conservation and restoration ofhistorical and cultural heritage. In particular, pigment analysis plays an essential rolein the conservation of works of art in which the identification of pigments and thestudy of their alterations in samples from canvas paintings, wall paintings,polychromed sculptures, textile pieces, etc. are frequently required. This analysisoften implies to use non-destructive methods and is conditioned by the fact that theamount of sample is usually restricted to the microgram level or less. Although thereare several well-established analytical methods, they are not suitable for real sampleanalysis because of the excessive dilution of the pigment in the sample, thecoexistence of different pigments, and the presence of binding media and protectivefilms. For these reasons, from the studies of the groups of Lamache, Brainina andScholz, the application of electrochemical techniques to obtain information on thecomposition and structure of solid compounds can be considered a practicalproposition in the field of analytical chemistry.In this context, the purpose of this Thesis is to obtain voltammetric methodswhich extend the scope of the traditional available ones for the anlysis of pigmentsand alteration products in pictorial samples, glazes an ceramic materials,archaeological glass, etc.The general methodology used is based on the voltammetry of microparticles,which consists of microsample characterization by recording voltammetric responseof the solid immobilized in the surface of an inert elctrode dipped into an appropiateelectrolyte solution. The reaction mechanism and electrochemical parameters such asthe peak potential an charge transfer coeffitients, are characterized, as well asdeconvolution techniques or synthetic multicomponent samples have been used withthe purpose of getting a more unequivocal identification. The results have beenvalidated with other non electrochemical techniques.The extensive work developed during this investigation project is recorded indifferent papers published in some of the most important scientific journals in thefield of analytical chemistry.

El actual deterioro de la capa de ozono ha provocado un incremento de la radiaciónUV solar que llega a la Tierra, que hace necesaria una mayor protección con el fin deevitar efectos perjudiciales para la salud. El uso de productos cosméticos para laprotección solar que incorporan filtros UV en su formulación podría contribuir aprevenir estos efectos dañinos.El control analítico de estos productos es necesario, ya que debe garantizarse sueficacia y seguridad. Sin embargo no existen métodos oficiales para su análisis, por loque el desarrollo de métodos analíticos rápidos y exactos para el control del productocosmético acabado es de gran interés, y constituye el objeto de esta Tesis Doctoral.Se ha puesto especial atención en el desarrollo de métodos en los que se utilicenreactivos inocuos o de baja toxicidad, reduciendo igualmente la cantidad de reactivosutilizada y minimizando la generación de residuos, con el fin de proponer métodos deanálisis limpios, y así cumplir con la actual tendencia de la química analíticadenominada "Química Analítica Verde" ("Green Analytical Chemistry", en inglés).Se han propuesto métodos automatizados basados en el uso de la espectroscopía deabsorción UV/VIS, fluorimetría y quimioluminimetría. La automatización de losprocedimientos permite aumentar la rapidez del análisis. Las características analíticasde estos métodos son adecuadas para el control analítico de los filtros UV en losproductos cosméticos acabados.También se han desarrollado métodos de cromatografía líquida con detección UV/VISque permiten realizar en pocos minutos la determinación simultánea de los filtros UVmás utilizados a nivel internacional. Las características analíticas de estos métodosson adecuadas para el control analítico de los productos cosméticos acabados.Además, en el último capítulo de esta Tesis Doctoral, se ha puesto a punto un métodoanalítico para la determinación en orina de usuarios de productos cosméticos para laprotección solar de uno de los filtros UV más utilizados, con el fin de estudiar losmecanismos de excreción y acumulación en el organismo y facilitar información sobresu posible efecto toxicológico. / Damage to the ozone layer has led to an increment in the solar UV radiation reachingearth, which in turn makes strong protection necessary in order to prevent harmfuleffects on human health. The use of sunscreen cosmetics could help to prevent orminimize these harmful effects.The analytical control of these products is necessary, since their efficacy and safetymust be guaranteed. However, there are no official analytical methods to be used, andthus the development of rapid and accurate analytical methods in order to controlsunscreen cosmetics is, without any doubt, of high interest, and this topic is the aim ofthis Doctoral Thesis. Special attention has been paid in the development of methodsthat use harmless reagents or with low toxicity, and moreover, by reducing the amountof employed reagents and thus minimizing the volume of waste of products generated,by proposing friendly (or "green") analytical methods for both the environment andoperator in order to fulfil with the current tendency of the analytical chemistry known as"Green Analytical Chemistry".In this sense, different automated methods based on the use of UV/VIS absorptionspectroscopy, fluorimetry and chemiluminiscence have been proposed. Theautomation of the procedures allows increasing the sample throughput. The analyticalfeatures of these methods are very suitable for the analytical control of the UV filters inthe sunscreen cosmetic products.On the other hand, different methods based on the use of liquid chromatography withUV/VIS detection have been also proposed, which allow the simultaneousdetermination of the worldwide most used UV filters in few minutes. The analyticalfeatures of these methods are also very suitable for monitoring the UV filters in thecosmetic products.Finally, the last chapter of this Doctoral Thesis is focused on the development of ananalytical method able to determine one of the most used UV filter in urine samplescoming from users of sunscreen cosmetic products, in order to study the excretion andbioaccumulation mechanisms in the human body, and thus providing information on itspossible toxicological side-effects.

El estudio de los objetos pertenecientes al patrimonio artísticopresenta un gran interés cultural e histórico, ya que proporciona informaciónsobre la evolución de las sociedades. No obstante, estos objetos sufrendegradaciones a lo largo del tiempo debido a las agresiones de agentesexternos y también a condiciones de conservación inadecuadas. La propuestade tratamientos de restauración y conservación exige disponer de unainformación lo más completa posible acerca de los materiales que fueronutilizados en su elaboración.Las obras de arte están habitualmente recubiertas por una capa debarniz, constituido por materiales químicamente estable s, con el objetivo deproteger a las capas internas del deterioro. Sin embargo, esta propia capaprotectora puede experimentar una degradación progresiva, la cual sepropaga a la propia obra de arte. Por otra parte, la capa pictórica contiene lospigmentos mezclados con aglutinantes, que cubren y cohesionan dichospigmentos, ejerciendo influencia en la cromaticidad de la obra de arte, ycaracteriza la técnica artística elegida por el autor.Los compuestos orgánicos más utilizados en la capa pictórica y elbarniz están constituidos químicamente por aceites secantes (pinturas alóleo), aglutinantes proteicos (técnicas artísticas de témpera y temple), cerasnaturales (pinturas en encáustica), resinas naturales (compuestos filmógenos)y resinas sintéticas (amplio uso debido a su versatilidad).La Tesis Doctoral presenta una serie de métodos analíticos para lacaracterización de materiales orgánicos utilizados en obras de arte, basadosen cromatografía y espectrometría de masas. Para cada caso se aplica latécnica analítica más adecuada, optimizando el tratamiento de muestra y lascondiciones instrumentales para incrementar los parámetros analíticos delmétodo. Posteriormente, para la diferenciación de los patrones y sucaracterización en las muestras artísticas, los datos obtenidos se tratanestadísticamente utilizando herramientas quimiométricas.Las metodologías desarrolladas son las siguientes:- Identificación de proteínas por cromatografía de líquidos-fluorescencia,previa derivatización para aumentar la fluorescencia de los analitos.- Caracterización de ceras mediante cromatografía de gases, trasderivatización para incrementar la volatilidad de los analitos.- Identificación de aceites secantes mediante cromatografía de líquidos-UVVisibley cromatografía de líquidos - fluorescencia , previa derivatizaciónpara incrementar la sensibilidad.- Caracterización de proteínas y aceites secantes mediante espectrometría demasas por infusión directa, sin necesidad de separación ni derivatizaciónprevia.RESUMEN- Identificación de materiales presentes en barnices de violines y laúdesitalianos del Renacimiento, mediante cromatografía de gases -espectrometría de masas, previa transmetilación para volatilizar loscompuestos con grupos carboxilato.- Caracterización de polímeros sintéticos y aditivos en obras pictóricasmodernas mediante pirólisis - cromatografía de gases - espectrometría demasas.La capacidad de predicción de las metodologías propuestas se evaluócon éxito mediante el estudio de muestras procedentes de obras artísticas degran relevancia, como son:i) obras pictóricas de los siglos XVI a XVIII pertenecientes al PatrimonioCultural Valenciano, donde se identificó proteína de huevo.ii) una oleorresina sobre tabla realizada en el 2003, del Patrimonio CulturalMejicano, donde se detectó cera de abeja.iii) diversas pinturas al óleo de los siglos XV a XX, mayor itariamentepertenecientes a la Basílica de la Virgen de los Desamparados y de laCatedral de Valencia, donde se caracterizó mayoritariamente aceite delinaza.iv) barnices de instrumentos musicales de cuerda fabricados por los luthiersmás renombrados de la época renacentista (siglos XVI-XVIII): un laúd deLaux Maler, una tiorba de Wendelio Venere y un violín de AntonioStradivari. En los tres casos se caracterizó aceite de linaza y resina de tipoPinaceae.v) Una obra pictórica moderna realizada por Georg Baselitz, consideradocomo uno de los pintores modernos más importantes de Alemania. Elanálisis reveló la presencia de una resina cetónica. / The study of objects from the Cultural Heritage has huge cultural andhistoric interest to understand the evolution of the societies. Nevertheless,these objects can endure degradation through the time. In order to proposeuseful conservation and restoration treatments, the maximum informationabout their original materials is needed.Artworks are usually covered by a varnish coat, made of chemicallyinert materials, in order to protect the inner layer from the degradation.However, this layer can also undergo a progressive deterioration, whichcould move to the own artwork. On the other hand, the pictorial layercontains the pigments mixed with binders which agglutinate and cover thesepigments, so that it influences the chromatic properties of the artwork, andcharacterizes the artistic technique chosen by the author.The Doctoral Thesis shows the development of several analyticalmethods in order to characterize organic materials used in artworks, asfollows:a) proteins by liquid chromatography - fluorescence.b) natural waxes by means gas chromatography.c) drying oils by liquid chromatography - UV-Visible and liquidchromatography - fluorescence.d) Proteins and drying oils by means of direct infusion mass spectrometry.e) materials in historical italian violin varnishes, by gas chromatography -mass spectrometry.f) synthetic polymers in modern artworks by pyrolysis - gas chromatography- mass spectrometry.The proposed methodologies were successfully tested by the study ofsamples from relevant artwork, as:i) pictorial artworks (16th -18th Centuries), from the Valencian CulturalHeritage, where egg protein was identifiedii) an oleoresin on panel (2003), from the Mexican Cultural Heritage, wherebeeswax was identifiediv) varnishes of string musical instruments by the most famous luthiers ofthe Baroque period (16th - 18th Centuries): a luth by Laux Maler, a theorboby Wendelio Venere and a violin by Antonio Stradivari. In the three cases,linseed oil and a Pinaceae-type resin were characterizedv) a modern pictorial artwork by Georg Baselitz, the most important currentpainter in Germany. The analysis showed the presence of ketonic resin.

Esta Tesis Doctoral forma parte de una línea de investigación dedicada al control analítico y a la estimación de la eficacia y seguridad de los productos cosméticos, en particular de los protectores solares y de otros productos cosméticos relacionados con el proceso de bronceado y blanqueamiento de la piel.Se han abordado dos temas:En la Parte 1, se detallan los métodos analíticos desarrollados para la estimación de los niveles de absorción percutánea y excreción urinaria de filtros UV en productos cosméticos para la protección solar.En la Parte 2, se detallan los métodos analíticos desarrollados para la determinación de principios activos despigmentantes en productos cosméticos para el blanqueamiento de la piel.En la Primera Parte de la presente Tesis Doctoral se han desarrollado métodos analíticos selectivos y sensibles, que permiten la estimación in vitro de los niveles de absorción percutánea de algunos filtros UV utilizados en formulaciones cosméticas para la protección solar.Igualmente, mediante la colaboración de voluntarios, se han desarrollado métodos que permiten determinar los niveles excretados, por vía urinaria, de algunos filtros UV tras la aplicación tópica de formulaciones cosméticas conteniendo dichos filtros.Mediante el desarrollo y empleo de estos métodos será posible avanzar en el estudio de la cinética de absorción/excreción de los filtros solares. Este estudio es de interés desde el punto de vista de la seguridad del usuario y permitirá que en el futuro se diseñen formulaciones para la protección solar basadas en filtros UV con bajo nivel de absorción y rápida eliminación del organismo humano.En la Segunda Parte de la presente Tesis Doctoral se han desarrollado métodos analíticos que permiten la determinación de diversos ingredientes empleados en las modernas formulaciones cosméticas para el blanqueamiento de la piel.Mediante estos métodos se puede realizar el control de calidad de la producción. Este control es necesario para asegurar que el producto cosmético presenta la concentración de activos despigmentantes necesaria para conseguir la eficacia esperada, pero no sobrepasando estos niveles de concentración para no comprometer la seguridad de los usuarios, ya que una concentración excesiva puede favorecer la aparición de efectos secundarios no deseados (alergias, irritación.).Además, se han desarrollado métodos analíticos que permiten el control de sustancias como hidroquinona y resorcinol en dichos productos cosméticos, estando ambas sustancias prohibidas actualmente por la legislación, ya que no se consideran seguras para los usuarios. De esta manera se puede controlar la aparición de fraudes por el uso indebido de dichas sustancias, pudiendo proceder a la retirada del producto por las autoridades competentes. / This Doctoral Thesis consists of a line of research dedicated to analytical control and estimation of the effectiveness and safety of cosmetic products, particularly sunscreens and other cosmetics related to the process of skin tanning and whitening. This Doctoral Thesis has two issues: - Part 1 describes the analytical methods developed to estimate the levels of percutaneous absorption and urinary excretion of UV filters in cosmetic products for sun protection. - Part 2 describes the analytical methods developed to determinate active ingredients in skin whitening cosmetic products.

El objetivo de esta tesis ha sido desarrollar y mejorar métodos analíticos para el control de calidad de productos de limpieza y para la evaluación de su impacto ambiental. Se ha prestado especial interés en el uso de los alcoholes grasos polietoxilados (FAEs), y a la caracterización de alquilpolifosfonatos (APPs), que son frecuentemente empleados como aditivos en productos de limpieza.Se ha llevado a cabo un estudio sistemático de los FAEs con el objeto de desarrollar y mejorar métodos para su caraterización y determinación en matrices industriales y ambientales, usando derivatización previa con anhídridos cíclicos, seguida de HPLC. Los objetivos fueron aumentar la velocidad y el rendimiento de la reacción de derivatización de FAEs con anhídridos, mejorar su reproducibilidad y la tolerancia de la reacción a la presencia de agua en las muestras, mejorar la resolución cromatográfica tanto entre las series hidrocarbonadas sucesivas como entre oligómeros dentro de una misma serie, nivelar los factores de respuesta de los oligómeros y reducir los límites de detección tanto en UV-Vis como en detección por MS. Se intentó primero la derivatización con anhídrido maleico (A. Micó-Tormos et al., J. Chromatogr. A 1180, 32-34, 2008). La reacción se completaba a 80 ºC en 15 min, y se observó que la adición de urea en suspensión en el medio de reacción proporcionaba rendimientos mayores. Para resolver los oligómeros solapados, se aplicó una deconvolución de los picos mediante un algoritmo genético asistido por el método local de Powell no restringido. El procedimiento se aplicó con éxito a muestras industriales y ambientales.A partir de la regularidad de los tiempos de elución, se predijeron los tiempo de retención de los oligómeros de los derivados de los FAEs de acuerdo con n y m. Se desarrollaron modelos que predicen los tiempos de retención en función del porcentaje medio de la concentración de ACN en cada punto del gradiente. Estos modelos fueron útiles para ahorrar tiempo en la optimización.A continuación, se estudio la esterificación de FAEs con anhídrido ftálico en 1,4-dioxano (A. Micó-Tormos et al., J. Chromatogr. A 1203, 47-53). La reacción se completó a 110 ºC en 60 min, también en presencia de urea molida en suspensión. En este caso, se describe un procedimiento sencillo para predecir de forma precisa las concentraciones de todos los oligómeros en las muestras descritas.Por ultimo, se ha introducido la derivatización con anhídrido difénico (A. Micó-Tormos et al., J. Chromatogr. A 1216, 3023-3030, 2009). El empleo de este reactivo se compara con el uso de los anhídridos maleico y ftálico. Se obtuvieron mejores parámetros cromatográficos que en los casos de los dos anhídridos anteriores, por lo que se escogió este anhídrido como óptimo.Más recientemente, se planteó el problema del solapamiento de los oligómeros monoetoxilados y no etoxilados (oligómeros con valores de m = 0 y 1 respectivamente) con los oligómeros más pesados dentro de las respectiva series hidrocarbonadas. Combinando la derivatización con anhídrido difénico con cromatografía 2D, se han obtenido las series bien ordenadas, con resolución total de los oligómeros dentro de cada serie.Por ultimo, se describen métodos para la rápida caracterización de APPs industriales mediante infusión en el espectrómetro de masas y electroforesis capilar zonal (CZE) con detección fotométrica indirecta (IPD) y detección mediante espectrometría de masas (MS) (V. Bernabé-Zafón, A. Micó-Tormos et al., Electrophoresis 28, 341-352, 2007). / The aim of this PhD was to develop improved analytical methods for the quality control of cleaning products, and for the evaluation of their environmental impact.Concerning fatty alcohol ethoxylates (FAEs), a study for developing improved methods for their caracterization and determination in industrial and environmental matrices, using previous derivatization with cyclic anhydrides, followed by HPLC, was carried out. The objectives were to increase the rate and yield of derivatization reactions, to improve their reproducibility and tolerance to the presence of water, to enhance chromatographic resolution, to level-off the response factors of the oligomers and to reduce the limits of detection. Regularity of the elution of FAE derivatives according to both n and m was used to predict the retention time of the oligomers. For this purpose, models which predicted the retention times as function of the average of acetonitrile (ACN) concentration along the gradient, were developed. These models were useful to design mobile phases with a preselected total analysis time.We addressed the problem of overlapping of the non-ethoxylated and mono-etoxylated oligomers with heavier oligomers within the respective hydrocarbon series. We obtained well ordered series and full oligomer resolution by combining derivatisation with diphenic anhydride with 2D chromatography. This was implemented by using a novel set-up in which a single quaternary pump serves the two columns. Excellent resolution between the oligomers within the series was achieved with alkyl-diol column as first dimension and penta-fluoro-propyl (PFP) column as second dimension. Using low temperatures resolution increased, and all the oligomers were resolved.Methods for the rapid characterization of industrial APPs by infusion mass spectrometry and capillary zone electrophoresis (CZE) with indirect photometric (IPD) and mass spectrometric (MS) detection, were described. Technical grade APPs were examined. A solution of adenosine triphosphate disodium salt (ATP) was used as BGE. The nominal compounds of the industrial APPs and their impurities were well resolved. The peaks were identified by using extracted ion electropherograms. Application of CZE-IPD and CZE-MS to the quality control of industrial APPs, and of CZE-MS to the identification and characterization of APPs in cleaning products, was demonstrated.

En la presente tesis se han preparado nuevas columnas monolíticas para electrocromatografía capilar (CEC) por polimerización in situ de mezclas que contenían diferentes monómeros de base de acrilato y metacrilato, estudiando diversos iniciadores de la reacción polimérica.Las columnas resultantes se han caracterizado por sus propiedades morfológicas y electrocromatográficas. En el primer caso se han empleado las técnicas de microscopía electrónica de barrido, adsorción/desorción de nitrógeno y porosimetría de intrusión de mercurio. En las separaciones electrocromatográficas se ha estudiado la eficacia, el comportamiento de retención y la selectividad de las columnas, así como sus características de flujo.Se ha demostrado que las propiedades electrocromatográficas de las columnas dependen fuertemente de la morfología del lecho monolítico, y que variando la composición de la mezcla de polimerización y las condiciones en que se lleva a cabo el proceso es posible ajustar el tamaño medio de poro y el área específica de los monolitos. Para ello se ha estudiado la influencia de diferentes factores, entre los que se incluyen la naturaleza del monómero de base empleado, el tipo de iniciación, el iniciador utilizado dentro de un mismo tipo de iniciación, la concentración del iniciador, la temperatura de polimerización, las relaciones monómeros/porógenos y monómero/agente entrelazante, la naturaleza del cross-linker, el contenido de monómero ionizable, y la naturaleza y composición del disolvente porogénico empleado.Se ha examinado para cada tipo de columnas estudiado la repetibilidad y reproducibilidad de su preparación, calculando el coeficiente de variación de diversos parámetros electrocromatográficos.Se ha evaluado el mecanismo de interacción predominante entre las distintas fases estacionarias preparadas y diversos analitos neutros, estudiando el orden de elución de estos últimos y representando los logaritmos de sus factores de retención (log k) experimentales frente a los coeficientes de partición en 1-octanol/agua (log Po/w) calculados por métodos computacionales.Se han estudiado además las propiedades porosas y electrocromatográficas de monolitos obtenidos con mezclas de monómeros de diferente hidrofobicidad, demostrando que su preparación constituye una interesante vía para ajustar las propiedades de las fases estacionarias de metacrilato con objeto de obtener separaciones adecuadas en CEC.Y se ha demostrado el potencial ofrecido por la iniciación química, no empleada hasta ahora en la preparación de columnas monolíticas de acrilato y metacrilato para CEC, habiéndose obtenido, tras la optimización de las condiciones de polimerización, fases estacionarias monolíticas con propiedades satisfactorias para todos los sistemas investigados. / In these studies, new methacrylate and acrylate ester-based monolithic columns for capillary electrochromatography (CEC) were synthesized in situ in fused silica capillaries, and different initiators of polymeric reaction were investigated.Morphologic properties of the resulting materials were characterized by scanning electron microscopy, mercury intrusion porosimetry and nitrogen adsorption/desorption techniques. Regarding to CEC separations, efficiency, retention behaviour and selectivity of columns were studied, as well as their flow-though properties.A strong dependance of electrochromatographic performance of these columns with the porous structure of monolithic bed was found, and mean pore diameter and surface area of monoliths were adjusted by changing the composition of polymerization mixture and conditions of columns preparation. Several factors were studied, including the effect of bulk monomer nature, initiation type, nature and amount of initiator, polymerization temperature, monomers/porogens and monomer/cross-linker ratios, cross-linker nature, content of charged monomer, and nature and composition of porogenic solvent system.The repeatability and reproducibility of each series of columns was studied by calculating the relative standard deviation (RSD) of several electrochromatographic parameters.Retention mechanism between stationary phases and different neutral compounds was investigated, studying the elution order of analytes and plotting the logarithm of their retention factor (log k) values against the calculated 1-octanol-water coefficient (log Po/w) values.Monoliths based on mixtures of monomers of different hydrophobicity were also synthesized, constituting their preparation a promising way to tailor the chromatographic and porous properties of methacrylate stationary phases suitable for CEC.The obtained results along these studies also demonstrated that chemical initiation constitutes an attractive alternative to prepare methacrilate- and acrylate-based monolithic columns with good features as stationary phases for CEC.

Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos capaces de crecer en gran variedad de sustratos, contaminando con frecuencia alimentos, en especial, los de origen vegetal, pudiendo producir una respuesta tóxica en animales o seres humanos después de la ingestión del alimento contaminado. Los principales hongos productores de micotoxinas pertenecen a los géneros Penicillium, Aspergillus, Fusarium y Alternaria que pueden producir entre otras, las micotoxinas: alternarioles, aflatoxinas, zearalenona, patulina, ocratoxinas y tricotecenos. Dada la peligrosidad de la ingesta de micotoxinas, la Unión Europea, preocupada por la calidad y salubridad de los alimentos, ha aprobado el Reglamento (CE) 1881/2006 de la Comisión en el que controla la presencia de micotoxinas en productos alimentarios que llegan al consumidor. De entre las diferentes micotoxinas las que están adquiriendo mayor relevancia debido a que están siendo encontradas en gran variedad de sustratos son: la ocratoxina A (OTA) y los tricotecenos tipo B, así como la patulina (PAT). La OTA es nefrotóxica, nefrocarcinogénicas, inmunosupresora, teratogénica y posiblemente genotóxica. Los niveles más altos de incidencia de OTA se han encontrado en cereales y productos derivados, así como en uva y derivados. Los tricotecenos pueden producir diferentes efectos tóxicos en animales y humanos como rechazo del alimento, vomito, hemorragia, anemia, immunosupresión, reducción de ganancia de peso y diarrea. También son unos potentes inhibidores de la síntesis de la proteína. El desoxinivalenol es el más frecuente tricoteceno detectado en muestras de cereal, aunque también se puede encontrar nivalenol, 3- y 15-acetildesoxinivalenol. Todas estas micotoxinas están clasificadas como tricotecenos tipo B. La patulina, produce hiperemia, congestión y lesiones hemorrágicas, especialmente en el tracto digestivo; así como náuseas y vómitos. La PAT puede detectarse en frutas, hortalizas, cereales y piensos. Para la determinación de las micotoxinas se utilizan técnicas cromatográficas que ofrecen los mejores resultados, sin embargo es imprescindible su optimización para adaptarlas a cada matriz, así como de un método previo de preparación, extracción y purificación adecuado para cada tipo de sustrato. La tesis doctoral está enfocada a: i) La realización de estudios de la micobiota presente en trigo y manzana. ii) La evaluación de la incidencia de especies fúngicas potencialmente productoras de OTA y tricotecenos tipo B en trigo y de patulina en manzana. iii) La mejora de los métodos de detección de la OTA, tricotecenos tipo B y patulina en los productos a estudiar. Para ello se realiza un estudio de la metodología existente y se procede al análisis comparativo y a una posterior optimización con procedimientos desarrollados en nuestro laboratorio. iv) La optimización de técnicas de análisis sensibles, fiables y reproducibles para la determinación de las toxinas en los cereales y manzanas y en sus derivados considerados mediante GC, LC, GC-MS, LC-MS. v) El análisis de los tricotecenos tipo B y ocratoxina A en trigo y sus derivados como pan, y comprobar su incidencia y cantidad de toxina encontrada para establecer el grado de peligrosidad para el consumo humano, y comparar los resultados con los de otros países. De igual modo se abordó el estudio de la patulina para la manzana y sus derivados. vi) Los estudios de la influencia de la temperatura de incubación, actividad de agua y tipo de aislado en la producción de tricotecenos tipo B, OTA y patulina. vii) El desarrollo de métodos predictivos para poder predecir la existencia de micotoxinas y poder eliminar riesgos controlando los diversos factores de la manipulación del trigo. viii) Los estudios sobre el uso de fitosanitarios con respecto al control de la presencia de estas especies fúngicas contaminantes en las materia primas y el efecto que estos pueden ejercer sobre la producción de diferentes micotoxinas. / The mycotoxins are secondary metabolites produced by filamentous fungi able to grow in great variety of substrates, contaminating frequently foods such as wheat and apple. These foods can produce a toxic effects in humans. The main producing fungi of mycotoxins belong to the genera Penicillium, Aspergillus and Fusarium that can produce among others, patulin, ochratoxin and trichothecene mycotoxins. Research carried out in the development of the Doctoral Thesis has permitted: i) Mycobiota study of wheat coming from the Spanish market with special attention to the potentially producing species of ochratoxin A (OTA), nivalenol, deoxynivalenol, and 3–acetyldeoxynivalenol and 15–acetyldeoxynivalenol and mycobiota study of apple especially by Penicillium expansum, the main patulin producing species. ii) Critical study and optimization of chromatographic methods for ochratoxin, type–B trichothecene and patulin determination in vitro culture media of the main producing fungal species. iii) Chemotyping of isolates belonging to species that are potential producers of ochratoxins, type–B trichothecenes and patulin in wheat and apple. iv) Study of the influence of physicochemical factors on mycelial growth of the fungi and mycotoxin production. v) Design and application of response surface models to predict deoxynivalenol accumulation by Fusarium graminearum and ochratoxin A accumulation by Aspergillus ochraceus in wheat in different conditions. vi) Optimization of the methodology for determining of ochratoxin A and type–B trichothecenes in wheat and wheat products, and of patulin in apple and apple products. Analysis of foodstuffs in Spain. vii) Stability study of ochratoxin A and type– B trichothecenes for baking process. viii) Critical study of mycotoxin multi–detection methods by LC–MS in wheat flour. Preparation and optimization of an analytical method to determine the maximum number of mycotoxins present in wheat flour.

Se han desarrollado métodos rápidos y sensibles para la caracterización de aceites vegetales en función de su origen botánico, y para la caracterización y autentificación de aceites de oliva en relación a su calidad, origen genético y geográfico. En primer lugar, se establecieron los contenidos de tocoferoles y tocotrienoles en aceites de distinto origen botánico mediante electrocromatografía capilar (CEC) y nano cromatografía líquida (LC), y los contenidos de esteroles mediante cromatografía líquida ultra-rápida (UPLC) y CEC. Por otro lado, se aplicaron herramientas quimiométricas como el análisis discriminante lineal (LDA), con el fin de desarrollar métodos capaces de clasificar los aceites vegetales en función de su origen botánico. Para ello, se utilizaron los espectros de infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR), el perfil de la fracción alcohólica establecido mediante HPLC usándose la espectrometría de masas (MS) como técnica de detección, y los perfiles de aminoácidos y esteroles obtenidos bien por infusión directa en MS o mediante HPLC-UV-Vis. Posteriormente, se desarrollaron métodos capaces de evaluar la calidad del aceite de oliva, utilizándose el perfil de ácidos grasos libres obtenido mediante infusión directa en MS para construir modelos de LDA capaces de clasificar las muestras en función de su calidad. Por otro lado, se desarrolló un método olfatométrico usando matrices de sensores de óxidos metálicos, para clasificar diversos aceites en función del umbral sensorial, establecido previamente por un panel de cata, de los defectos organolépticos típicos de los aceites de oliva. Estos mismos datos se usaron para cuantificar el porcentaje de defecto presente en las muestras. Por otro lado, y mediante la construcción de modelos de LDA, se desarrollaron métodos capaces de clasificar los aceites de oliva virgen extra (EVOO) en función de su variedad genética. Para ello, se utilizaron los perfiles de ácidos grasos libres y compuestos fenólicos establecidos mediante MS de infusión directa, los perfiles de esteroles establecidos mediante HPLC-MS y UPLC-MS y los espectros de FTIR. A su vez, se desarrollaron métodos con el fin de clasificar EVOOs en función de su origen geográfico, usándose para ello los perfiles de compuestos fenólicos establecidos mediante CEC. Por último, se estudiaron los productos de oxidación del aceite de oliva, y se desarrollaron métodos para su evaluación. Se estudiaron los cambios producidos durante el almacenamiento en dos alícuotas de un aceite de oliva que diferían en su contenido de compuestos fenólicos, ya que una de las mismas fue sometida a un proceso previo de extracción de los mismos. Ambas alícuotas se sometieron a un proceso de envejecimiento acelerado durante 7 semanas, analizándose una porción de cada una de ellas una vez a la semana. Se estudiaron las diferencias obtenidas en los valores de acidez libre, absorbancia en el UV, índice de peróxidos, estabilidad oxidativa, contenido en ácidos grasos y en tocoferoles en función del contenido de fenoles en la muestra de partida, así como la evolución de estos valores con el envejecimiento. También se estudió la transformación experimentada por los compuestos fenólicos durante todo el proceso de oxidación mediante HPLC-MS. Estas mismas muestras fueron también analizadas mediante infusión directa en el MS, y mediante una matriz de sensores de óxidos metálicos con el fin de poderlas clasificar en función de su estado oxidativo. Por último, se construyeron modelos de regresión lineal múltiple con el fin de predecir el contenido de ácidos grasos oxidados de diversas muestras de aceite de oliva, bien mediante FTIR o mediante sensores de óxidos metálicos. / The objective of this PhD thesis was the development of fast and sensitive methods for the characterization of vegetable oils according to their botanical origin, and for the characterization and authentication of olive oils in relation to their quality, genetic and geographical origin. For this purpose, the content of tocopherols and tocotrienols in different vegetable oils have been determined by capillary electrochromatography (CEC) and nano liquid chromatography (LC), being sterol contents established by ultra-fast liquid chromatography (UPLC) and CEC. On the other hand, the use of linear discriminant analysis (LDA) was proposed to classify vegetable oils according to their botanical origin using as predictors Fourier transform infrared spectra (FTIR) data, alcohol profiles established by HPLC using mass spectrometry (MS) as detector, and amino acid profiles established by both direct infusion MS and HPLC-UV-Vis. Methods to evaluate olive oil quality have been also developed by using fatty acid profiles as predictors to construct LDA models capable of classifying oils according to their quality. An olfactometric method has been also proposed to classify oils according to the sensory threshold (previously established by a sensory panel) of the different olive oil defects. These data was also used to quantify defect percentage in the samples. LDA models have been also constructed to classify extra virgin olive oils (EVOOs) according to their genetic variety using as predictors FTIR data, fatty acid and phenolic profiles established by direct infusion MS and sterol profiles established by HPLC-MS and UPLC-MS. LDA models to classify EVOOs according to their geographical origin have been also constructed using phenolic profiles established by CEC. Finally, methods for the evaluation of olive oil oxidation products have been also developed, in which the chemical changes produced in olive oil samples containing different phenolic contents during an accelerated storage treatment were studied. These samples were also analyzed by direct infusion MS and electronic nose to classify them according to their oxidative status. Finally, multiple linear regression models were constructed to predict oxidized fatty acid contents of several olive oils previously established by FTIR or by electronic nose.

El arsénico y el mercurio son elementos traza, cuyas concentraciones en alimentos deben estar controladas por las autoridades sanitarias debido a que su excesiva ingesta puede entrañar efectos perjudiciales para la salud. De entre las distintas especies químicas de ambos tóxicos existentes en los alimentos, el arsénico inorgánico y el metilmercurio constituyen las especies más tóxicas, estando considerado el arsénico inorgánico como carcinógeno tipo I para el hombre, y el metilmercurio como posible carcinogénico para el hombre, grupo 2B. El arroz, en el caso del arsénico, y los productos de la pesca en el caso del mercurio, son alimentos de alto consumo susceptibles de presentar elevadas concentraciones de estos contaminantes y pueden por ello constituir un riesgo para la salud de los consumidores. En la estimación del riesgo toxicológico, la etapa de evaluación de la exposición tiene en cuenta la frecuencia y la magnitud de la misma. Dado que la dieta es la principal vía de entrada de arsénico y mercurio para el hombre, la evaluación de la magnitud de la exposición a ambos tóxicos debería considerar tanto la influencia del cocinado sobre la concentración del tóxico, como la biodisponibilidad oral (fracción soluble del contaminante ingerido que es absorbida por el epitelio intestinal y alcanza la circulación sistémica, hallándose así disponible para actuar en el organismo receptor). Una herramienta conservadora para la evaluación de la biodisponibilidad oral es la bioaccesibilidad, relación entre la concentración bioaccesible o soluble de una sustancia y la concentración total de la sustancia presente en la muestra. La bioaccesibilidad es indicativa de la máxima cantidad que puede absorberse por el epitelio intestinal y por ello se utiliza como indicador de la máxima biodisponibilidad oral. Conocer la bioaccesibilidad del arsénico y mercurio desde los alimentos puede aportar información novedosa en la estimación del riesgo toxicológico. En la actualidad, para estimar la bioaccesibilidad de los contaminantes pueden utilizarse métodos de digestión gastrointestinal in vitro estáticos y dinámicos que emulan las etapas gástrica e intestinal de la digestión humana. La mayoría de los estudios sobre arsénico en arroz y mercurio en pescados existentes en la bibliografía, no consideran el efecto del cocinado ni la bioaccesibilidad, limitándose a una determinación de las concentraciones de estos metales en los productos crudos. La presente tesis doctoral caracteriza las concentraciones de arsénico, mercurio y sus especies químicas de interés toxicológico en muestras de arroz y productos de la pesca, y evalúa el efecto del cocinado y de la bioaccesibilidad sobre dichas concentraciones y sobre la estimación del riesgo asumido a su consumo. / Arsenic (As) and mercury (Hg) are toxic trace elements, and their concentrations in foods must be controlled by health authorities because of the possible adverse effects on the health that are associated with their dietary intake. Inorganic arsenic is considered by the International Agency for Research on Cancer (IARC) as a carcinogen to humans, Group I and methylmercury compounds are classified by this agency as possibly carcinogenic to humans, Group 2B. Rice in case of arsenic, and seafood products and specially predatory fish, in case of mercury, tend to accumulate high levels of these pollutants. In risk assessment, the exposure assessment stage evaluates the extent, duration, frequency and magnitude of exposure to a chemical pollutant. The evaluation of the magnitude of exposure to metal(loid)s through food should consider not only the influence of cooking on the concentration of the contaminant, but also the oral bioavailability, i.e. the soluble fraction of the ingested pollutant that is absorbed by the intestinal epithelium and reaches the central (blood) compartment from the gastrointestinal tract. A conservative tool for evaluating oral bioavailability is oral bioaccessibility, defined as the fraction that is soluble in the gastrointestinal environment and is available for absorption. Bioaccessibility provides an indication of maximum oral bioavailability and is therefore an important tool to be used in risk assessment. For As and Hg, however, as for other toxic trace elements, evaluation of risk intake is normally based on concentrations of the contaminant in raw food. Most of the studies report data in raw products, not considering the effect of cooking and bioaccessibility on concentrations. The present thesis characterizes the concentrations of arsenic, mercury and their chemical species of toxicological interest, in samples of rice and seafood products, and evaluates the effect of cooking and bioaccessibility on these concentrations and on the estimation of the risk associated with consumption of these products.

Los productos de limpieza, contienen surfactantes (principal materia activa) y otros componentes. La presente Tesis se centra en el desarrollo de métodos analíticos para el control de calidad de algunos surfactantes y aditivos en estos productos. Los métodos están basados en cromatografía líquida de alta eficacia, electroseparación capilar e infusión en espectrómetro de masas. Esta Memoria se divide en: A. Caracterización y determinación de surfactantes no iónicos y aniónicos. A.1. Los alquilpoliglucósidos se determinaron mediante cromatografía líquida - espectrometría de masas. En modo ion-positivo, la detección, basada en los aductos con sodio, permitió distinguir entre homólogos de anillos y de cadena. A.2. Los alquiléter sulfatos son surfactantes de uso frecuente. Se desarrolló un método de caracterización y determinación basado en su derivatización cromogénica precolumna. Se estudió el aislamiento de esta familia de surfactantes para hacer aplicable el método a una amplia variedad de muestras. A.3. Los alcoholes grasos se encuentran frecuentemente en una amplia variedad de muestras industriales y domésticas. Se desarrolló un método de determinación de alcoholes grasos sin etoxilar y etoxilados, basado en su oxidación previa a los correspondientes ácidos carboxílicos o etoxi-carboxílicos, seguida de infusión directa en el espectrómetro de masas. B. Caracterización y determinación de polímeros. B.1. La industria de detergentes utiliza polímeros hidrosolubles, como la poli(vinilpirrolidona) y el poli(1-óxido-4-vinilpiridina), para inhibir la transferencia de color en el lavado de textiles. Además, el alcohol polivinílico se utiliza como agente anti-redeposición. Se proponen métodos para la determinación de estos polímeros en detergentes empleando electroforesis capilar, directamente o mediante complejación de colorantes. C. Métodos de identificación, clasificación y determinación de las enzimas, utilizadas en productos limpiadores. C.1. Se estudió el uso de electroforesis capilar para identificar directamente las enzimas. A partir de la enzima aislada por precipitación, los electroferogramas permitieron identificar el tipo de enzima e identificar algunas enzimas. C.2. Se desarrolló un método clasificatorio basado en el perfil de aminoácidos obtenidos por hidrólisis seguida de infusión directa en el espectrómetro de masas. En otro método, el perfil de aminoácidos se estableció por cromatografía líquida y detección UV, tras derivatización con orto-ftaldialdehido. Para ambos métodos, se construyeron modelos clasificatorios mediante análisis discriminante lineal. C.3. Se compararon diferentes columnas comerciales, incluyendo empaquetadas y monolíticas (poliméricas o de sílice), con el fin de obtener una óptima separación de los digestos obtenidos con tripsina de las enzimas empleadas en detergencia. El objetivo es desarrollar métodos más fiables de clasificación e identificación de enzimas, dada la especificidad de los péptidos obtenidos con tripsina. D. Desarrollo de columnas monolíticas para electrocromatografía capilar. D.1. Se prepararon columnas monolíticas para electrocromatografía capilar (CEC) con lauril metacrilato (LMA) como monómero base y peróxido de lauroilo (LPO) como fotoiniciador. Las prestaciones de estas columnas se establecieron con diversos solutos de prueba. D.2. Para preparar columnas monolíticas de LMA para CEC, se estudió la naturaleza y concentración de diferentes fotoiniciadores: 6,6’-azobisisobutironitrilo, 2,2- dimetoxi-2-fenilacetofenona, peróxido de dibenzoilo y LPO. Las prestaciones de cada columna se evaluaron midiendo la retención y la eficacia con mezclas de solutos de prueba. / Modern cleaners contain many ingredients, although surfactants predominate. This Thesis is focused on the development of analytical methods for quality control of some surfactants and additives in cleaning products. The main parts are: A. Characterization and determination of surfactants. A.1. Alkylpolyglucosides were determined by liquid chromatography with mass spectrometry detection of adducts with sodium ion. A.2. Alkylether sulfates were characterized by liquid chromatography with UV detection, previous isolation by solid phase extraction and transesterification with an anhydride. A.3. Ethoxylated fatty alcohols were determined by direct infusion in a mass spectrometer after their oxidation to the corresponding ethoxy carboxylic acids. B. Characterization of polymers. B.1. Water-soluble polymers as polyvinyl pyrrolidone and poly(4-vinylpyridine-1- oxide) are used to inhibit dye transfer during laundry. In addition, polyvinyl alcohol is used as anti-redeposition agent. Methods for the determination of these polymers in cleaners using capillary electrophoresis, directly or by complexation with dyes, were developed. C. Methods of identification, classification and determination of the enzymes mainly used in cleaners. C.1. The identification of the intact enzymes by capillary electrophoresis was studied. The enzymes were isolated, and the electropherograms were used to classify enzymes and to identify some of them. C.2. Two classification methods, based on enzyme hydrolysis, direct infusion into the mass spectrometer or liquid chromatography - UV to establish the amino acid profile, and linear discriminant analysis, were developed. C.3. Commercial columns, including packed and monolithic (polymeric and silica), were compared in order to achieve optimum separation of tryptic digests of enzymes. D. Monolithic columns for capillary electrochromatography (CEC). D.1. Lauryl methacrylate as monomer and lauroyl peroxide (LPO) as photoinitiator were used to prepare monolithic columns. D.2. To prepare CEC columns, different photoinitiators (4, 4'-azobisisobutyronitrile, 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone, dibenzoyl peroxide and LPO) at different concentrations were studied.