Los componentes miniaturizados son una realidad que nos acompaña y facilita nuestro día a día de una manera sutil. El ejemplo más claro es los avances en la microelectrónica que han permitido el desarrollo tanto de la electrónica de consumo como de las nuevas tecnologías de la información. Esta tendencia, sin embargo, también se ha hecho evidente en otras áreas del conocimiento como son la biología, la medicina o la química. En el campo de la química, y sobretodo a partir de los años 90, se ha realizado un gran esfuerzo científico para obtener dispositivos a microescala que nos permitan llevar a cabo los análisis de ciertos parámetros de interés, como por ejemplo sustancias contaminantes del medio ambiente. El uso de microanalizadores aporta un alto número de ventajas, como son la facilidad de producción a gran escala (con la consiguiente reducción de costes), bajo consumo de reactivos utilizados, bajo volumen de residuos generados (debido a las pequeñas dimensiones del dispositivo), tiempo de análisis cortos, así como la portabilidad, que permite al usuario realizar análisis in-situ en lugares donde difícilmente se podría colocar un equipo de grandes dimensiones y obtener la información en tiempo real.Son diversas las técnicas y los materiales utilizados para llevar a cabo la miniaturización de los sistemas de análisis químicos. El silicio y el vidrio han sido, sin duda, los materiales más utilizados con esta finalidad, no sólo debido a sus adecuadas propiedades físico-químicas, sino también al alto grado de desarrollo que han adquirido sus tecnologías asociadas. En los últimos tiempos, sin embargo, los polímeros han tomado el relevo como material para la microfabricación debido, especialmente, a su bajo coste.Con el objetivo de superar determinadas limitaciones encontradas tanto en los materiales clásicos como en sus tecnologías asociadas, en esta tesis se ha apostado por el uso de una tecnología alternativa denominada LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) o de cerámicas verdes. El uso de estos materiales nos aporta una gran versatilidad a la hora de diseñar y construir los analizadores miniaturizados. En primer lugar, los dispositivos se pueden fabricar sin necesidad de trabajar en condiciones de laboratorio estrictamente controladas, como por ejemplo salas blancas, o con personal altamente cualificado. Se pueden utilizar tanto microfresadoras como equipos láser y el proceso de prototipado es muy corto. Adicionalmente, la metodología multicapa permite diseñar con mucha facilidad dispositivo con complejas estructuras tridimensionales. Esto simplifica extraordinariamente la miniaturización e integración de las diferentes etapas de pretratamiento de la muestra (mezcla de reactivos, separación, preconcentración, etc.) que son necesarias para llevar a cabo determinados análisis, así como la integración monolítica de los sistemas de detección.En esta tesis se presenta una nueva metodología general de fabricación de sistemas de análisis miniaturizados que hemos aplicado al diseño de microanalizadores medioambientales para el control de la calidad del agua tanto de ríos como de redes de distribución de agua potable. Gracias a su versatilidad, la nueva metodología de fabricación ha permitido integrar diferentes tipos de detectores como los electroquímicos (potenciométricos y amperométricos) u ópticos (espectrofotométricos y luminiscentes). Así, se han construidos microanalizadores para parámetros como los iones amonio, nitrato, nitrito y fosfato que son claves para la monitorización de los procesos de eutrofización. En la actualidad, haciendo uso de esta tecnología, también se han desarrollado dispositivos para la determinación de microcontaminantes orgánicos persistentes. / Miniaturized components are a nearby reality that facilitates our daily life in a subtle way. One of the clearest examples is the advances suffered in microelectronics that have permitted the development of both the day by day and the new information technologies electronics. This tendency has also been observed in other knowledge areas, such us biology, medicine or chemistry. In this last field, especially from the nineties, a great scientific effort has been carried out in order to obtain microdevices that could allow us to perform analysis of certain environmental pollutant parameters. The use of microanalyzers provides a high number of advantages. Among them: easy mass production (as a result, costs reduction), low consumption of reagents, low volumes of waste products (due to the small dimensions of the constructed devices), short analysis times and portability. This last characteristic enables the user to carry out in-situ and in-time analysis in places where it would not be possible to place standard equipments, due to their higher dimensions.Silicon and glass have been the most widely used materials with miniaturization purposes, not only due to their appropriate physical and chemical properties, but also to the degree of development of their associated technologies. In the last years, however, polymers are becoming a good alternative due to, especially, their low cost.To avoid some limitations found both in the materials and in their technologies, in this thesis we have emphasize on the use of an alternative technology known as LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) or green tapes technology. The use of these materials provides us a great versatility to construct miniaturized analyzers. Firstly, the devices can be fabricated without the need of special working conditions, such as clean rooms or specialized staff. Ceramics can be mechanized by means of a simple CNC (Computer Numerically Controlled) equipment or a laser, being the prototyping process very short. Additionally, the multilayer methodology enables the design of complex three-dimensional structures in an easy way. This simplifies extraordinarily the miniaturization and integration of several sample pretreatment steps (mixing reagents, separation, preconcentration, etc.), which are needed to carry out some analysis, as well as the monolithic integration of the detection systems.In this thesis, a new general fabrication methodology to construct miniaturized analysis systems is presented. The procedure has been put into practice by means of the design of environmental microanalyzers to control the water quality in rivers and drinking waters. Thanks to its versatility, the new fabrication methodology has permitted to integrate different detection systems, such as electrochemical (potentiometric and amperometric) and optical (spectrophotometric and luminiscent). Thus, we have designed, developed and evaluated microanalyzers to determine parameters such as, ammonium, nitrate, nitrite and phosphate ions, which are key components in eutrophication processes. Nowadays, taking advantage of the LTCC technology, we have also developed devices to determine persistent organic micropollutants.

No description available.

En aquesta tesis s'han realitzat diferents síntesis de nanopartícules com són els quantum dots i les nanopartícules d'or i d'argent amb els seus corresponents coreshells (Au-Ag i Ag-Au). Aquestes nanopartícules s'han caracteritzat per diferents tècniques tant òptiques com especialment les electroquímiques. S'ha realitzat un nou sistema de quantificació electroquímica dels quantum dots sintetitzats pel mètode arrested precipitation, utilitzant elèctrodes serigrafiats i un aparell de detecció portàtil.Aquests quatum dots han estat utilitzats en un sensors de DNA i amb detecció electroquímica de celules com a marca electroquímica, utilitzant la tècnica de detecció electroquímica directe que s'havia emprat en la determinació de quantum dots. / Different synthesis of nanoparticles was carried out in this thesis, such as cadmium sulphide quatum dots, gold nanoparticles, silver nanoparticles and core-shell nanoparticles (Au-Ag and Ag-Au). These nanoparticles were characterized by different techniques such as optical and especially electrochemical techniques. CdS-QDs (synthesized by arrested precipitation method) were quantified using an electrochemical direct detection method with screen-printed electrodes and a portable potentiostat.These CdS-QDs were used to label in DNA sensor of hybridization and also to detect HeLa cells using the electrochemical direct method that was used in CdS-QDs determination.

Al camp alimentari hi ha una creixent demanda de metodologies analítiques que siguin ràpides, selectives i econòmiques, que permetin la detecció de diferents contaminants alimentaris per a garantir la seguretat del producte al llarg de la cadena alimentària de producció. En aquest context, els biosensors electroquímics s'alcen com a candidats ideals com alternativa a la instrumentació analítica convencional per a l'anàlisi fora de l'àmbit del laboratori. En aquesta tesi es van desenvolupar nous dissenys biomoleculars basats en biosensors electroquímics per a la seguretat alimentària abordant tres aspectes crítics dels dispositius biosensors, que convergeixen cap a la simplificació metodològica: la immobilització orientada del biomaterial, la marcació i la transducció del senyal electroquímic. Donada l'experiència del nostre grup d'investigació en la fabricació de compòsits de grafit-epoxi (GEC) i els avantatges electroquímics demostrats d'aquest material, es van construir nous transductors electroquímics basats en compòsits rígids per a la immobilització orientada de biomolècules per aconseguir la simplificació metodològica en la detecció de DNA i immunoespècies. Els nous transductors construïts es van basar en: i) biocompòsits de grafit-epoxi modificats en volum amb la proteïna avidina (Av-GEB), i ii) compòsits amb un element magnètic integrat (m-GEC). Els biocompòsits d'avidina constitueixen una plataforma universal per a la immobilització directa orientada de material biològic biotinilat, mitjançant la forta unió avidina-biotina. El propi transductor actua com a reservori de material biològic i es pot renovar amb un simple procediment de polit, obtenint una nova superfície per cada assaig. Els magneto elèctrodes permeten la integració de partícules magnètiques als procediments biosensors per tal de realitzar les reaccions biològiques de biorreconeixement en solució, reduint la complexitat de la matriu de les mostres i preconcentrant l'anàlit, obtenint així, una detecció més sensible. Es va dissenyar una nova estratègia de detecció de DNA provinent de mostres reals dels bacteris patògens Salmonella i Escherichia coli, mitjançant la incorporació d'encebadors marcats a la mescla de reacció de la PCR. A part d'amplificar la quantitat de DNA, es va aconseguir marcar doblement el producte amplificat amb biotina i digoxigenina, per aconseguir la immobilització posterior a partícules magnètiques recobertes d'estreptavidina o Av-GEB i la unió d'un conjugat enzimàtic (antiDIG-HRP) per a detectar el producte amplificat. Així es van obtenir uns protocols simples, ràpids i molt sensibles. Aquests protocols van proporcionar límits de detecció més baixos en comparació amb la tècnica clàssica de gel d'electroforesi i la PCR quantitativa amb sistema TaqMan. També es van obtenir resultats molt prometedors incorporant a la PCR un encebador magnètic, encebador unit a partícules magnètiques. Així, es va aconseguir l'amplificació directa a la superfície de les partícules magnètiques, simplificant la metodologia. Aquesta estratègia presenta potencial aplicabilitat per a la detecció directa electroquímica de productes amplificats al termociclador de la PCR. A l'últim bloc de la tesi es va desenvolupar una estratègia immunosensora simplificada amb detecció electroquímica, en la que l'haptè es va immobilitzar a partícules magnètiques recobertes de grups químics tosil, formant un enllaç covalent amb la molècula de naturalesa haptènica. Amb aquesta estratègia es va aconseguir quantificar l'àcid fòlic en mostres cegues de llet enriquida, obtenint valors de recuperació propers al 100%; i quantificar l'àcid fòlic en mostres reals de llet enriquida, obtenint valors molt propers als indicats a la composició dels productes. / The control of food quality along the food production chain has become of growing interest since the increasing incidence of food poisoning is a significant public health concern for customers worldwide. The development of new analytical methodologies with the advantages of rapid response, selectivity and low-cost is still a challenge for food hygiene inspection. Biosensors offer an exciting alternative to the traditional methods allowing decentralised analysis. Novel biomolecular approaches in electrochemical biosensing were developed in this thesis. The main features of these novel biosensing devices were focused on the integration of processes and the methodological simplification. These tasks were achieved considering the main critical aspects of biosensors design: the orientated immobilization of the biorecognition element, the labelling process to achieve the analytical signal and finally, the electrochemical transduction. Novel electrochemical transducers based on graphite-epoxy composites (GEC) were developed. The enhanced electrochemical properties of GEC material has been demonstrated previously in our research group. The novel transducers based on rigid composites were used for the simplified and oriented immobilization of biomolecules such as DNA and immunospecies. The new transducers developed were: i) graphite-epoxy biocomposites bulk-modified with avidin (Av-GEB), and ii) magneto electrodes based on graphite-epoxy composite (m-GEC). Avidin biocomposites can be considered as universal platforms for the oriented immobilization of biotinilated biomolecules, through the strong interaction between avidin and biotin. This biocomposite material acts not only as the electrochemical transducer but also as a reservoir for the biological material, being able to be easily renewed by a polish treatment, obtaining a new surface for each assay. The m-GEC magneto electrodes allow the integration of magnetic particles in biosensing procedures. The biorecognition reaction can thus be effectively performed in solution, reducing the matrix effect of the sample and preconcentrating the analyte, as a result these factors enhance the sensitivity of the detection. A sensitive, rapid and user-friendly strategy for the genetic detection of the main food pathogens - Salmonella and Escherichia coli- was designed. This approach was based on a double-tagging PCR by using two labelled primers, followed by electrochemical genosensing of the double-tagged amplicon. During PCR, not only the amplification of the genetic material was achieved, but also the double-labelling of the amplicon ends with both biotin and digoxigenin tags, in order to achieve the immobilization of the amplicon on streptavidin-modified beads or Av-GEB electrodes as well as the binding of an enzymatic conjugate (antiDIG-HRP) for the electrochemical detection. Better results were achieved in terms of limit of detection compared with the classic gel electrophoresis as well as quantitative PCR based on TaqMan probes. Promising results were also obtained with the use of a novel magnetic primer, primer bound to magnetic beads. This approach allows the DNA direct amplification on streptavidin magnetic beads surface. This strategy showed potential applicability for the direct electrochemical detection of the amplified products in the PCR termocycler. Finally, a simple immunosensing strategy with electrochemical detection was developed. In this case, the haptenic molecule was covalently immobilised on tosylactivated magnetic beads. The utility of this strategy was demonstrated for folic acid detection in spiked milk samples, obtaining recovery values around 100%. Moreover, folic acid was also quantified in real enriched milk samples showing results according to the expected labelled values.

En el presente trabajo se han diseñado, construido y evaluado dos fluorosensores miniaturizados y portátiles, que pueden representar una alternativa a la instrumentación analítica clásica de elevado coste, gran tamaño y elevado consumo de reactivos, que necesita de mantenimiento y de personal especializado para su utilización. El empleo de fluorescencia representa intrínsecamente una ventaja en términos de sensibilidad y minimización de interferencias, ya que existen muy pocas moléculas que sean fluorescentes, y menos aún en la zona vis-NIR del espectro electromagnético. Asimismo, los dos dispositivos desarrollados presentan una gran versatilidad para su posible uso en la detección de diversos analitos en función del optodo seleccionado. Los optodos empleados en los dispositivos desarrollados incluyen cromo(fluoro)ionóforos que han sido diseñados, sintetizados y caracterizados en el presente trabajo para operar con la instrumentación miniaturizada y de bajo coste disponible. Se han diseñado, sintetizado y caracterizado nuevos colorantes cianina (croconinas, cetocianinas y (nor)cianinas-anilinas) para su utilización como cromo(fluoro)ionóforos en optodos, tanto en medidas basadas en absorbancia como en fluorescencia.El primer dispositivo opera integrado como detector en un sistema de análisis por inyección de flujo continuo (FIA), y tanto con un optodo selectivo a potasio, como con uno selectivo a plomo, ha mostrado unas apropiadas características analíticas. Su utilización en la determinación de potasio en muestras dopadas de agua potable de red y de plomo en extractos de suelos contaminados ha demostrado su aplicabilidad en muestras reales. El segundo dispositivo consiste en una sonda más portátil y manejable y en la que la intercambiabilidad de la membrana es más fácil, para realizar medidas in-situ y en discontinuo. Ésta se ha activado químicamente con un optodo selectivo a plomo y ha mostrado adecuadas propiedades analíticas de respuesta. Finalmente, se ha aplicado a la determinación de plomo en muestras naturales, verificándose su buen funcionamiento. / In this study two miniaturized and portable fluorosensors were designed, constructed and evaluated. These sensors represent an alternative to classical analytical instrumentation which can be expensive, bulky and reagent dependent, not to mention the need for specialized technicians for its use and maintenance. The use of fluorescence represents an intrinsic advantage with regard to sensibility and interference minimization, since few fluorescent molecules exist in the vis-NIR region of the electromagnetic spectrum. These devices are also versatile; depending on the selected optode they can be used in the detection of diverse analytes. The optodes employed in these devices include chromo(fluoro)iononophores and were designed, synthesized and characterized in this study to operate with miniaturized and low-cost instrumentation. New cyanine dyes (croconines, ketocyanines and (nor)cyanine-anilines) were designed, synthesized and characterized for use as chromo(fluoro)iononophores in optodes for absorbance-based measurements as well as for fluorescence-based measurements. The first device operates as an integrated detector in a continuous flow injection analysis (FIA) system and showed excellent analytical performance with a potassium-selective optode, as well as with a lead-selective one. Its use in the determination of potassium in doped potable water samples, and of lead in contaminated soil extracts, demonstrates its applicability to natural samples. The second device consists of a more portable and user-friendly dip-probe which facilitates the interchangeability of the membrane when in-situ and continuous measurements are carried out. The dip-probe device was chemically activated with a lead-selective optode and also demonstrated good analytical response properties.Finally, this second device was applied to lead determination in natural samples, resulting in positive verifiable performance.

En esta memoria, se presenta la aplicación de diversos métodos quimiométricos para realizar el control de calidad de cuatro plantas medicinales de amplio uso comercial, para las cuales existen informes de confusiones, adulteraciones o presentación de reacciones adversas en los consumidores. El Capítulo uno es una introducción general y el Capítulo dos presenta los objetivos. El Capítulo tres trata sobre el control de calidad de E. senticosus, un miembro de la familia Araliaceae. Se ha desarrollado un procedimiento espectroscópico en el infrarrojo cercano (NIR) para obtener la huella dactilar de materiales sin procesar de E. senticosus. Los espectros fueron procesados utilizando diferentes métodos de reconocimiento de pautas. El modelado blando independiente de analogías de clases (SIMCA) y el análisis discriminante con mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) lograron una tasa general de éxito en la clasificación (GSR) de 84% y 92%, respectivamente. Según los ensayos con mezclas de laboratorio, es posible detectar adulteraciones en torno a un 5% de especie adulterante, dependiendo de su proximidad con la familia Araliaceae. La sensibilidad y la especificidad de los modelos fue superior al 73%. El Capítulo cuatro trata sobre P. ginseng; utilizando espectroscopia NIR y quimiometría se consiguió la correcta identificación de la especie, la detección de mezclas y la semicuantificación de mezclas binarias. Los espectros NIR fueron normalizados y se evaluó la capacidad de clasificación de SIMCA, PLS-DA y análisis discriminante. Todos obtuvieron igual sensibilidad (100%); sin embargo, SIMCA presentó el mejor GSR (95%) y tuvo la más alta especificidad (100%) y capacidad para detectar muestras adulteradas (80%). Además, la semicuantificación realizada con resolución multivariable de curvas - mínimos cuadrados alternados presentó un error medio de 5.53% e indicó que el cambio en la composición de la mezcla debe ser al menos de 3.64% para obtener buenos resultados. En el Capítulo cinco se describe una estrategia para la obtención de huellas dactilares cromatográficas utilizando varias longitudes de onda. La metodología propuesta se ensayó con Valeriana officinalis. Se construyeron huellas dactilares aumentadas reuniendo en un único vector de datos los cromatogramas de cuatro longitudes de onda (226, 254, 280 y 326 nm) en las cuales presentan máxima absorbancia los constituyentes característicos de valeriana. El pretratramiento de los datos incluyó la corrección de la línea base, la normalización y la alineación optimizada mediante correlación. Los valores de GSR logrados por SIMCA y PLS-DA fueron superiores al 90%. La sensibilidad y la especificidad fueron superiores al 94%. Los ensayos con mezclas indicaron que es posible detectar adulteraciones a un 5%, incluso si el adulterante es de la familia Valerianaceae. El Capítulo seis trata sobre la implementación de la estrategia de huellas dactilares aumentadas junto con la regresión PLS para mejorar la predicción de la actividad antioxidante de Turnera diffusa. Se seleccionaron de un gráfico de contorno las longitudes de onda que presentaron el mayor número de señales (216, 238, 254 y 345 nm). Cuatro variables latentes explicaron el 52.5% de la varianza de X y el 98.4% de Y. Se utilizó un conjunto externo de muestras para evaluar su fiabilidad, consiguiendo un error relativo estándar de predicción de 7.8%. El estudio de las variables más importantes para la regresión señaló los picos cromatográficos relacionados con la actividad antioxidante. El Capítulo siete contiene las conclusiones generales y el Capítulo ocho comenta las perspectivas futuras de trabajo. Finalmente, el anexo lista las publicaciones resultantes de la tesis. / This thesis deals with the application of chemometric methods for quality control; four medicinal plants for which there are reports of confusion, adulteration or presentation of adverse reactions in consumers have been studied. Chapter one is a general introduction and Chapter two presents the objectives. Chapter three studies E. senticosus, a member of the Araliaceae family. A near-infrared spectroscopic procedure to obtain a fingerprint of E. senticosus has been developed using raw materials. The spectra were processed by using different pattern recognition procedures. General classification success rates (GSR) of 84% and 92% were achieved by Soft Independent Modeling of Class Analogy (SIMCA) and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA), respectively. Tests on laboratory-made mixtures showed that it is possible to detect adulterations or counterfeits with about 5% foreign herbal material, depending on their closeness to the Araliaceae family. The sensitivity and specificity of constructed models were above 73%. Chapter four is about P. ginseng; proper identification, mixture detection and semi-quantitative determination of binary mixtures have been achieved using near-infrared spectroscopy and chemometrics. Raw NIR spectra were normalized and the classification ability of three different pattern recognition procedures was assayed. SIMCA, PLS-DA and discriminant analysis reached equal sensitivity value (100%); however, SIMCA obtained the best GSR (95%) and had the higher specificity (100%) and ability to detect debased samples (80%). Moreover, the semi-quantification of mixtures performed with multivariate curve resolution presented a mean percent error of 5.53% and showed that mixture composition should change in amounts larger than 3.64% in order to retrieve proper results. Chapter five describes a strategy for multi-wavelength chromatographic fingerprinting of herbal materials, using high performance liquid chromatography with a UV-Vis diode array detector. Valeriana officinalis was selected to show the proposed methodology. The enhanced fingerprints were constructed by compiling into a single data vector the chromatograms from four wavelengths (226, 254, 280 and 326 nm), those where characteristic chemical constituents of valerian presented maximum absorbance. Chromatographic data pretreatment included baseline correction, normalization and correlation optimized warping. The GSR values achieved by SIMCA and PLS-DA were above 90%. The sensitivity and specificity of constructed models were above 94%. Tests on laboratory-made mixtures showed that it is possible to detect adulterations or counterfeits with 5% foreign herbal material, even if it is from the Valerianaceae family. Chapter six deals with the implementation of the enhanced fingerprint strategy together with PLS regression, in order to improve the prediction of the antioxidant activity of Turnera diffusa. The wavelengths were selected from a contour plot, in order to obtain the greater number of peaks at each of the wavelengths (216, 238, 254 and 345 nm). A PLSR model with four latent variables explained 52.5% of X variance and 98.4% of Y, with a root mean square error for cross validation of 6.02. To evaluate its reliability, it was applied to an external prediction set, retrieving a relative standard error for prediction of 7.8%. The study of the most important variables for the regression indicated the chromatographic peaks related to antioxidant activity at the used wavelengths. Chapter seven presents the overall conclusions drawn from the quality control methods proposed for the four medicinal plants studied and Chapter eight describes several possibilities for further research. Finally, the appendix lists the publications resulting from the work carried out.

Degut a la necessitat d’estudis sistemàtics per a l’establiment de mètodes eficaços per a la determinació d’espècies de mercuri en matrius ambientals i biològiques complexes, que assegurin la inalterabilitat de les mateixes durant la seva manipulació, aspectes que són avui dia els punts més febles en l’especiació analítica, l’objectiu de la present Tesi es basa en l’optimització de mètodes analítics per a estudiar l’especiació de mercuri en mostres del medi aquàtic mitjançant la tècnica acoblada HPLC-UV-CV-AFS. Dins d’aquest marc, la Tesi aborda uns objectius específics que es descriuen a continuació: - Optimització de totes les condicions experimentals implicades en la determinació de mercuri inorgànic i metilmercuri mitjançant CV-AFS establint, en primer lloc, les condiciones òptimes de detecció i, a continuació, estudiant la separació de les espècies mitjançant cromatografia de líquids en fase inversa; tot establint els paràmetres de qualitat per al mètode analític proposat. - Modificació i/o optimització del mètode analític per tal de determinar altres espècies de mercuri que de manera poc habitual es puguin trobar en mostres ambientals i/o biològiques. - Desenvolupament d’un mètode de preconcentració on-line per a l’especiació de mercuri en aigües. - Establiment dels efectes de pretractament en la determinació de mercuri en mostres de sediments. - Aplicació de la metodologia analítica desenvolupada a mostres ambientals i biològiques (aigües, sediments i biota) prèviament estudiant diferents mètodes d’extracció d’espècies emprant materials de referència. Els resultats obtinguts dins del tres primers objectius es mostren i es discuteixen al Capítol 3 de la present memòria; els estudis realitzats per a l’avaluació dels efectes de pretractament de mostra en sediments es descriuen al Capítol 4, i l’últim capítol descriu l’aplicació a mostres ambientals i biològiques del medi aquàtic. Als annexos I i II s’inclouen els articles científics publicats fins al moment. L’Annex I consta d’un article sobre la determinació de Hg2+ i MeHg+ en aigües contaminades mitjançant HPLC-UV-CV-AFS, mentre que a l’Annex II es troba un review sobre materials de referència certificats per a l’especiació de mercuri en matrius biològiques i ambientals. / In the present thesis, analytical methodology has been developed for mercury speciation in aquatic samples. The first part of the work consists of the optimization of the method for the separation of the species by the technique HPLC-UV-CV-AFS, another part focuses on the effects of sample pretreatment for the determination of total mercury and its species in sediments, and finally the last part consists of the application of the developed methodology to environmental and biological aquatic matrices (water, sediment and biota). Obtained results in the first part of the work are shown and discussed in Chapter 3; studies about sample pretreatment in sediments are described in Chapter 4; and the last part of the work is described in Chapter 5. Appendix I includes an article about the determination of Hg2+ and MeHg+ in polluted waters by HPLC-UV-CV-AFS, while Appendix II includes a review of certified reference materials for mercury speciation in environmental and biological matrices.

La tesi està dividida en tres parts diferenciades: una primera part on es desenvolupa un nou mètode cromatogràfic per determinar el coeficient de partició 1-octanol/aigua (log Po/w) de fàrmacs, una segona part on s’avaluen diversos descriptors de l’acidesa de l’enllaç d’hidrogen del solut per estimar el log Po/w i, finalment, una tercera part que descriu l’avaluació de la partició de fàrmacs en liposomes. En la primera part s’ha establert un mètode cromatogràfic per determinar el log Po/w de substàncies d’interès farmacèutic. En primer lloc, s’han optimitzat les condicions experimentals (columna, tipus i fracció de modificador orgànic a la fase mòbil) utilitzant substàncies d’estructura senzilla. S’ha demostrar que qualsevol columna amb fase estacionària C18 és apta i que les fases mòbils que contenen un 40-50% d’acetonitril proporcionen els resultats més acurats. El mètode s’ha validat per comparació entre els valors determinats i els valors de referència. Un cop fet això, s’ha estudiat la lipofilicitat de compostos bàsics demostrant la validesa del mètode per determinar el seu log Po/w si es treballa amb els tampons i columnes adients. En un tercer estadi s’ha avaluat la capacitat del mètode per determinar el log Po/w de fàrmacs d’estructura complexa. Els compostos han estat cedits per l’empresa Laboratoris Dr. Esteve S.A., que va mostrar interès en un mètode cromatogràfic robust per aplicar-lo en els seus procediments interns. Els compostos estudiats presenten una major complexitat estructural i provenen d’una selecció representativa de la biblioteca de compostos d’Esteve S.A.. Els resultats obtinguts demostren la capacitat del mètode per determinar el log Po/w de fàrmacs d’estructures molt diverses i la seva aplicabilitat per procediments de rutina en la indústria farmacèutica. Un cop s’ha establert el mètode cromatogràfic, s’ha seguit amb l’avaluació de diversos descriptors de l’acidesa de l’enllaç d’hidrogen dels soluts, atès que els descriptors utilitzats en la part anterior es calculen amb un programa, CODESSA, que no està a l’abast de la indústria farmacèutica ja que té un ús estrictament acadèmic. S’han considerat quatre descriptors, tres d’ells calculats a partir de la representació tridimensional de la molècula i el restant a partir de l’estructura en 2D. Els models generats a partir dels descriptors 3D depenen de la esteroisomeria i de la conformació de la molècula, i per tant, el descriptor 2D presenta una major simplicitat. Això fa que el seu ús sigui recomanable, doncs els resultats obtinguts en tots els casos són molt similars. La darrera part de la tesi ha servit per estudiar la lipofilicitat anisotròpica, mesurada com el coeficient de partició en liposomes/aigua per fàrmacs fluorescents. S’ha aplicat un nou mètode, basat en la polarització de la radiació fluorescent. Aquesta polarització depèn de la fracció de fàrmac que s’ha incorporat als liposomes, i permet calcular el coeficient de partició a partir de mesures de la polarització o anisotropia en solucions amb concentracions creixents de liposomes mantenint la concentració de fàrmac constant. Els resultats obtinguts s’han comparat amb els valors determinats aplicant les tècniques de referència (diàlisi en equilibri i potenciometria) i s’han observat algunes desviacions, possiblement degudes a la dispersió de la radiació per la presència dels liposomes en la solució. Malgrat aquests inconvenients, el procediment pot ser útil en el cas de compostos fluorescents que no es puguin estudiar amb les tècniques de referència. / Evaluation of the Lipophilicity of Drugs The study is focused to the lipophilicity assessment of drugs with diverse structures, functionalities and acid-base properties. The chromatographic method is based on a quantitative structure-property relationship method (QSPR), which permits the estimation of the log Po/w from the chromatographic retention complemented with several molecular descriptors calculated from the structure of the compound. The method was set up with a collection of ben-zene, phenol and aniline derivates and then, the experimental conditions of the chromatographic measurement were optimized. Later, the performance of the method was extended with the study of basic compounds, including several commercial drugs. This involved the use of alkaline mobile phases and, hence, columns prepared for working with them. Finally, the proposed method was used to assess the lipophilicity of drugs which showed a very complex structure and the structural descriptors were again evaluated because these drugs showed significantly different descriptor values compared to those from the substances used to establish the method. The performance of the new UHPLC systems to obtain the chromatographic data was also considered. As a consequence of the study of the structural descriptors involved in the proposed chromatographic method, the ability of several hydrogen bond acidity descriptors to complement the chromatographic retention in order to predict the log Po/w is studied. Four QSPR models are proposed, which are based on the chromatographic retention and a hydrogen bond descriptor. The four proposed models show similar statistical parameters among them, although the model which is based on the calculated Abraham hydrogen bond acidity parameter shows some advantages. This is because this parameter is easier to calculate. In the third part of the Dissertation, the evaluation of lipophilicity in liposomal systems is assessed. First, the lipophilicity of several drugs is determined by means of the reference techniques and, in a second part, a new approach is established, based on the measurement of the fluorescent anisotropy of drug-liposome solutions.

La tesi titulada Determinació de Substàncies amb Diferents Hidrofobicitats mitjançant Cromatografia Líquida Micel·lar, mostra com esta tècnica de separació pot ser aplicada per a la determinació de diversos grups de fàrmacs, que diferixen molt en el seu valor del coeficient de repartiment octanol aigua.Està estructurada de la següent forma:- El Capítol I correspon a la Introducció de la Tesi. En ell es descriuen les característiques generals de la cromatografia líquida micellar i de com aquesta tècnica pot ser útil per a separar i determinar aquells grups de substàncies que degut a la seua estructura química, difereixen en la seua hidrofobicitat. La primera part del Capítol I, ens introdueix en el coneixement dels mecanismes que actuen per aconseguir la separació de les substàncies quan s'utilitza la CLM, i en la segona part s'estudia la forma de mesurar la hidrofobicitat de les substàncies, mitjançant el càlcul del log Po/w.- En el Capítol II es detalla l'objecte i el pla de treball utilitzat per a elaborar la Tesis.- Els capítols III a VII es dediquen a la determinació de substàncies en formulacions farmacèutiques o en mostres d'aigua.- El Capítol III tracta la determinació de vitamines del grup B mitjançant derivatització, fent ús de la reacció de König. Este capítol es divideix en dos apartats: en el primer, s'optimitza un procediment d'anàlisi per injecció en flux (FI), per a la derivatització de l'àcid nicotínic en un sistema, i en la segona part, es mostra l'acoblament d'este sistema FI al cromatògraf.- El Capítol IV també tracta la determinació de vitamines del grup B, però ara la detecció es du a terme en la UV. S'ha optimitzat un mètode cromatogràfic que permet la determinació de les vitamines hidrosolubles del grup B en preparats farmacèutics multivitamínics.- El Capítol V oferix un procediment de CLM per a la determinació de carbamats en mostres d'aigua.- Si fins ara, en els anteriors Capítols, les substàncies que s'han utilitzat són relativament hidrofíliques, en el Capítol VI s'analitzen corticosteroids, caracteritzats tots ells per la seua elevada hidrofobicitat. A més, la determinació es fa en cremes, és a dir, una matriu altament hidrofòbica.- Al Capítol VII es dissenya un protocol per aconseguir la separació i determinació d'un gran nombre de substàncies, pertanyents als grups de les fenetilamines i dels antihistamínics, que habitualment es formulen conjuntament en medicaments per al constipat.- Els Capítols VIII a l'XI tracten l'anàlisi de compostos en matrius biològiques. En els tres primers, els estudis s'han fet en mostres de sèrum, i a l'últim en orina.- En el Capítol VIII es realitza la determinació de tres antiepil·lèptics en mostres de sèrum realitzant una injecció directa en CLM.- El Capítol IX està dedicat a la determinació de diversos barbitúrics en sèrum.- En el Capítol X es determinen diverses benzodiazepines en sèrum fent l'optimització en columnes C18 i C8.- I finalment, el Capítol XI es basa en realitzar la determinació de diversos estimulants mitjançant la cromatografia líquida micel·lar en mostres d'orina.- El capítol XII recull les conclusions que se'n deriven dels estudis fets en els capítols anteriors.- La tesi acaba amb un annex dedicat a les publicacions, l'estructura del qual es fa coincidir amb la dels capítols anteriors.

The present study exploits two different molecules as biorecognition elements for biosensing. In the first case, a protein biosensor was performed using maltose-binding protein (MBP). The ability to manipulate protein function rationally also offers the possibility of creating new proteins of biotechnological value. Our design has been used to test the understanding of allosteric transitions in proteins. Here we examined a simple conformational change that can represent the biorecognition principle for a reagentless biosensor. Previously, modular strategies for transducing ligand-binding events into fluorescent and electrochemical responses have been reported. Starting with a study of the conformational changes of MBP this research will further develop electrochemical maltose biosensors. The responses of four individual mutations (K46C-MBP-MT, N282C MBP-MT, Q72C-MBP-MT; and K25C-MBP-MT) were evaluated using square wave voltammetry. The possibility of using this type of transduction mechanism for sensor configurations and analyte specificity is discussed.The second part of this work involves SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) and aptamers as biorecognition molecules. As a result of the SELEX method, we can obtain oligonucleotide sequences (aptamers) with recognition properties similar to antibodies. These synthetic elements play an important role in molecular recognition because of their capability for specifically binding of a target molecule. A new approach for the separation step has been performed, termed Soluble-SELEX. This new SELEX method uses hybridization as partitioning mechanism for separating the bound and unbound DNA members from the target-molecule. Hybridization procedure has been evaluated by fluorescence studies as partitioning mechanism for SELEX method. Herein, we exploited the incorporation of an aptamer for biosensing detection of a specific target molecule. Three different transduction methods such as fluorescence, electrochemistry and surface plasmon resonance (SPR) were evaluated. In all three cases, the biosensing procedure was successful.In conclusion, this research has evaluated the translation of a fluorescent biosensor into an electrochemical biosensor using maltose-binding protein as biorecognition element. On the other hand, a new SELEX method has been developed. However, future improvements are required in order to optimize the method. As result of SELEX a new avidin-aptamer was selected and three different transduction systems were employed to construct fluorescent, surface Plasmon resonance and electrochemical biosensors. / El presente estudio utiliza dos moléculas diferentes como elementos de bioreconocimiento. En el primer caso, un biosensor basado en proteínas fue desarrollado utilizando la proteína periplasmica de unión a maltosa (MBP = maltose-binding protein). La habilidad para manipular racionalmente la función de una proteína también ofrece la posibilidad de crear nuevas proteínas con valor biotecnológico. Nuestro diseño proteico ha sido usado para evaluar cambios alostéricos en proteínas. Este estudio evalúa un simple cambio conformacional el cual puede ser usado como el principio transductivo para un biosensor. Diferentes estrategias de transducción usando fluorescencia y electroquímica en eventos de reconocimiento entre la proteínas periplasmicas de unión y el ligando, han sido previamente reportadas. Esta investigación inicia con el estudio de los cambios conformacionales de MBP, continuando con el desarrollo de un biosensor electroquímico para maltosa. La señal de cuatro diferentes mutantes (K46C-MBP-MT, N282C MBP-MT, Q72C-MBP-MT; y K25C-MBP-MT) fue evaluada usando voltimetría de onda cuadrada. La posibilidad de usar este tipo de transducción mecánic (distancia) para la configuración de biosensores y la respectiva especificidad analítica es discutida. La segunda parte de este trabajo incluye el método SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) y aptameros como moléculas de bioreconocimiento. Como resultado de el método SELEX, podemos obtener secuencias de oligonucleótidos (aptameros) con propiedades de reconocimiento similares a los anticuerpos. Estos elementos sintéticos, tienen un importante rol en el reconocimiento molecular por su capacidad de unión específica a la molécula blanco. Un nuevo mecanismo para el paso de separación ha sido realizado, y llamado SELEX-Soluble. Este nuevo método SELEX usa la hibridización como mecanismo de separación para dividir los oligonucleótidos de DNA que no se unen y los que se unen a la molécula blanco. El procedimiento de hibridización y su uso como mecanismo de separación en el método SELEX ha sido evaluado a través de estudios de fluorescencia. Este estudio también explora la incorporación de un aptamero como elemento de reconocimiento en un biosensor. Tres diferentes mecanismos de transducción has sido evaluados: fluorescencia, electroquímica y resonancia de plasmon superficial (SPR). En los tres casos una excelente señal fue reportada. En conclusión, esta investigación ha evaluado la transferencia de una biosensor de fluorescencia a un biosensor electroquímico, utilizando la proteína periplásmica de unión a maltosa como elemento de bioreconocimiento. De otro lado, un nuevo método SELEX ha sido desarrollado. Sin embargo, futuras mejoras son requeridas para optimizar el método. Como resultado del método SELEX realizado un nuevo aptamero para avidita ha sido seleccionado y tres diferentes sistemas de transducción ha sido empleado para construir tres diferentes biosensores (fluorescencia, electroquímica y SPR).