Esta Tesis Doctoral es el resultado de un proceso de investigación que surge con el propósito principal de mejorar el conocimiento existente sobre la vegetación del Cuaternario en el sureste español. En relación a otros territorios más septentrionales de la Península Ibérica, esta zona constituye aún un territorio con una información paleobotánica escasa, aunque durante los últimos años la situación ha cambiado favorablemente. Partiendo de una revisión de evidencias paleobotánicas, fundamentalmente, pero también paleoambientales, otro de sus objetivos fue la contextualización dentro del ámbito peninsular de la dinámica vegetal durante el Holoceno en el sureste ibérico semiárido. La metodología empleada ha consistido en el análisis polínico de sedimentos procedentes de un depósito cuaternario de naturaleza paleolacustre localizado en el litoral de Mazarrón (Murcia, Sureste de España). Este análisis ha permitido la identificación taxonómica, mediante microscopía óptica, de una gran diversidad de granos de polen y esporas de plantas vasculares, así como de otros microfósiles no polínicos (esporas fúngicas, zigósporas algales, esporas de briófitos, partes del exoesqueleto de insectos, restos y mudas de ácaros, acritarcos y otros tipos palinológicos de afinidad biológica incierta). Sobre las mismas preparaciones para microscopía óptica se ha llevado a cabo, además, el recuento de microcarbones. Estos últimos han aportado información de gran utilidad acerca de la dinámica de paleofuegos. El posterior tratamiento gráfico y estadístico de los hallazgos obtenidos, a partir de estos análisis, ha permitido la obtención de una nueva secuencia paleopalinológica, la primera de origen paleolagunar para el litoral de la Región de Murcia, situada además en el piso bioclimático termomediterráneo y junto a un destacado yacimiento arqueológico, cuya secuencia ocupacional data de la Edad del Bronce y para el que disponemos de información antracológica. Los resultados de doce dataciones radicarbónicas basadas en el contenido de carbono orgánico total presente en muestras de sedimento procedentes del mismo testigo empleado para el análisis polínico, sitúan esta nueva secuencia paleopalinológica dentro de un intervalo temporal comprendido entre c. 7617 y 1569 años cal. BP. En esta tesis se ha ensayado también el análisis polínico en otro sistema paleolagunar litoral (Calblanque) y en tres yacimientos paleontológicos (Fonelas P-1, Mencal-9 y Cueva Victoria), todos emplazados en el sureste ibérico, pero que resultaron palinológicamente estériles. Junto al análisis polínico se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica que ha permitido situar la secuencia de Mazarrón en un contexto tanto regional como peninsular, constatándose un alto grado de correlación con otros registros polínicos regionales. Al igual que en muchas otras secuencias del sureste peninsular, podemos distinguir un óptimo termomesofítico durante el Holoceno medio seguido de un aumento progresivo de la aridez a lo largo del Holoceno superior con pérdida de biodiversidad vegetal, regresión, fragmentación e incluso extinción local de poblaciones de árboles, mayoritariamente mesófilos, cuyos efectos más acusados acontecen en períodos relativamente recientes. En relación a este proceso de deforestación se detectan importantes asincronías entre territorios próximos, lo que pone de manifiesto la importancia de otros condicionantes, además de los de naturaleza climática en la respuesta vegetal. Entre los rasgos a destacar de esta nueva secuencia se hallan: (a) una presencia continuada de Pinus a lo largo de todo el registro, (b) una extraordinaria abundancia de Pistacia, (c) una correlación positiva entre la variación de Pistacia y el grupo de Quercus perennifolios, (d) la presencia de taxa termoxerofíticos iberomagrebíes, (e) una gran diversidad de esporas de hongos saprófitos, (f) un notable incremento de Olea al final de la secuencia y (g) la aparición de indicadores de actividades antrópicas desde prácticamente el inicio de la secuencia. / The present PhD thesis is primarily aimed at improving our knowledge on the Quaternary vegetation in southeastern Spain, a region with relatively poor paleobotanical information in comparison with northernmost areas of Iberian Peninsula. In addition, here I provide a discussion of the semiarid southeastern vegetation dynamics in a peninsular framework over the Holocene. The methodology includes pollen analyses of sediments from a palaeolacustrine deposit situated at the Mazarrón littoral which has allowed the taxonomic identification of a great diversity of pollen grains and spores of vascular plants as well as non-pollen palynomorphs (fungal spores, algal zygospores, bryophyte spores, parts of exoskeleton of insects, remains and moults of dust mites, acritarchs and other palynological types of unknown biological affinity) by means of optical microscopy. Microcharcoals were also counted on the same pollen slides than pollen thus giving information of about fire dynamics. The palaeoecological sequence investigated here represents the first littoral, lacustrine record for the region. It is also worth mentioning that this sequence lies in the thermomediterranean belt and close to an outstanding archaeological site with an occupational sequence that dates from the Bronze Age and for which there is anthracological information available. The results of twelve radiocarbon datings based on total organic carbon (TOC) content of sediment samples from the same core used for palynological analysis have placed the Mazarrón sequence between c. 7617 and 1569 cal. years BP. Other pollen analyses have been essayed for this thesis, but the deposits became sterile after laboratory processing of sediments. The non-polleniferous sites include the peatlands of Calblanque, a coastal palaeolacustrine system, and three paleontological sites rich in vertebrate fauna, namely Fonelas P-1, Mencal-9 and Cueva Victoria. These sites date from late Pliocene to early Pleistocene. The Mazarrón palaeoecological record exhibits a mid-Holocene, thermo-mesophytic optimum followed by a progressive increase in aridity throughout late Holocene with a loss of plant biodiversity, retreat, fragmentation and even local extinction of tree populations, mainly broad-leaf trees. However, the more pronounced effects of this ecological depletion took place during relatively recent times. Regardless the general trend, this deforestation pattern shows asynchronies between relatively nearby territories thus suggesting the importance of ecological factors in the vegetation response to climatic change. The main characteristics of the Mazarrón sequence are: (a) a continuous presence of Pinus throughout the record, (b) an extraordinary abundance of Pistacia, (c) a positive correlation between the variation of Pistacia and evergreen Quercus, (d) the presence of Ibero-Maghrebian thermoxerophitic taxa, (e) a variety of saprophytic fungal spores, (f) an increase of Olea at the bottom of sequence and (g) the appearance of human activity indicators ever since the beginning of the sequence.

INTRODUCCIÓN La zona pelúcida (ZP) es una matriz traslúcida, glicoproteica y acelular que rodea los ovocitos de los mamíferos implicada en importantes procesos durante la fecundación. Se ha considerado que la ZP estaba constituida por tres glicoproteínas (ZP1, ZP2 y ZP3) teniendo en cuenta estudios realizados en el ratón. Sin embargo, estudios posteriores demostraron que la ZP de cerda y de vaca también presentaba tres glicoproteínas, pero no estando presente en estos casos ZP1, siendo la composición ZP2, ZP3 y ZP4. Además, en estos últimos años se ha descrito que diferentes especies presentan cuatro glicoproteínas en su ZP, como es el caso de la mujer, la rata, el macaco coronado, el hámster, la coneja y la gata. OBJETIVOS: En la presente Tesis Doctoral ahondamos en la composición de la ZP en varios grupos de mamíferos: marsupiales, roedores y carnívoros. Estudiamos la evolución de los distintos genes y se analiza el comportamiento de la ZP de varias especies con diferente composición proteica mediante estudios funcionales como la fecundación in vitro (FIV) y la digestión de la ZP mediante proteasas. METODOLOGÍA: En este estudio realizamos un análisis in silico de las distintas especies de marsupiales y carnívoros disponibles en distintas bases de datos (Ensembl y Pubmed); así como un análisis molecular en un marsupial australiano (wallaby de Bennett y koala), un marsupial sudamericano (zarigüeya común), tres roedores (Mastomys coucha, Mus mattheyi y Mus pahari) y dos carnívoros (perro y zorro). Para ello, se aisló ARNm de ovarios de las distintas especies con el que se sintetizó ADNc y en otros casos se obtuvo ADNg a partir de tejidos. El ADN se empleó en las amplificaciones por PCR usando cebadores diseñados a partir de las secuencias de las distintas ZPs. A continuación, realizamos análisis filogenéticos a partir de alineamientos múltiples de las secuencias empleando SEAVIEW. El modelo de evolución se eligió empleando iMOLDETEST y el árbol se construyó usando el método de máxima verosimilitud mediante el programa PHYLM. Por otro lado, se realizó un análisis por proteómica en los roedores analizados para determinar la composición proteica de su ZP. Por último, se realizaron análisis funcionales determinando el tiempo de digestión completa de la ZP usando tripsina en roedores y se realizan ensayos de FIV homólogos y heterólogos empleando roedores de diferentes especies. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Marsupiales: La composición de la ZP es diferente en los marsupiales australianos y sudamericanos, pudiendo estar formada por 4 a 6 glicoproteínas. En el orden Didelphimorphia de los marsupiales sudamericanos, la ZP podría estar formada por ZP1, ZP2, ZP3-b y ZP3-c y en los marsupiales australianos podría estar formada por ZP1, ZP2, ZP3-a, ZP3-b, ZP3-c y ZP4. Detectándose pseudogenización del gen ZP4 en los marsupiales del orden Didelphimorphia además de en dos xenartros, el armadillo y el perezoso. Roedores: En el ovario de Mastomys coucha, Mus mattheyi y Mus pahari se expresa el ARNm de ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4 demostrándose la presencia de estas proteínas mediante análisis proteómico. La pseudogenización de ZP4 en la subfamilia Murinae se estima que ocurrió hace 5-7 millones de años, afectando únicamente al subgénero Mus. La ZP de ratonas con 4 glicoproteínas se digiere antes que la ZP de ratonas con 3 glicoproteínas y los espermatozoides de ratones con 3 proteínas en su ZP pueden fecundar el ovocito de ratones con 4 proteínas en su ZP. Carnívoros: En el ovario de la hurona se expresa el ARNm de ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, mientras que en el ovario de la zorra se expresa el ARNm de ZP2, ZP3 y ZP4, estando ZP1 pseudogenizado. La pseudogenización de ZP1 parece afectar únicamente a la familia Canidae. / INTRODUCTION: The zona pellucida (ZP), a translucent, glycoproteic and acellular matrix that surrounds the mammalian oocytes, is involved in important steps during fertilization. Based on studies in mouse, it was long considered that the ZP is formed of three glycoproteins (ZP1, ZP2 and ZP3). However, later studies demonstrated that pig and cow ZP is also formed of three glycoproteins, although ZP1 is not present in these cases, the composition being ZP2, ZP3 and ZP4. Furthermore, in more recent years other species have been found to contain four glycoproteins in their ZP, e.g. human, bonnet macaque, hamster, rabbit and cat. OBJECTIVES: In the present thesis we take a deep look at the ZP composition in placental mammals (carnivores and rodents) and in metatherian mammals (marsupials). We also study the evolution of the different ZP genes and analyze the ZP behaviour in several species of different protein composition by means of functional studies, such as in vitro fertilization (IVF) and ZP digestion with proteases. METHODS: An in silico analysis was made of the marsupial and carnivore species for which information is available in the databases Ensembl and Pubmed. In addition we made a molecular analysis of two Australasian marsupials (Bennett’s wallaby and koala), one South American marsupial (Common opossum), three mice (Mastomys coucha, Mus mattheyi and Mus pahari) and two carnivores (dog and fox). For this, mRNA was isolated from the ovaries and cDNA was synthesized; in other cases, gDNA was obtained from tissues. The DNA was used in PCR amplifications and primers were designed according to the different ZP sequences. Next, a phylogenetic analysis was made using SEAVIEW from multiple alignments of the obtained sequences. The evolution model was chosen using iMOLDETEST and the phylogenetic tree was constructed using the maximum likelihood method with the PHYLM program. In addition, a proteomic analysis was conducted in the studied mice to determine the protein composition of their ZP. Finally, functional analyses were made, calculating ZP digestion time using tripsine and doing homologous and heterologous IVF analysis using different mice species. RESULTS AND CONCLUSIONS: Marsupials: ZP composition differs between Australasian and South American marsupials; since it may be formed of four to six glycoproteins. In the South American order Didelphimorphia, the ZP is probably formed of four glycoproteins (ZP1, ZP2, ZP3-b and ZP3-c), whilst in Australasian marsupials the ZP is probably formed of six proteins (ZP1, ZP2, ZP3-a, ZP3-b, ZP3-c and ZP4). A ZP4 pseudogenization was detected in the Didelphimorphia order of marsupials and also in two xenarthrans, the armadillo and the tree sloth. Rodents: In the ovaries of Mastomys coucha, Mus mattheyi and Mus pahari, the mRNA of ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4 is expressed and the presence of these proteins was demonstrated by proteomic analysis. The pseudogenization of ZP4 in the Murinae subfamily is estimated to date from around 5-7 million years, affecting only the subgenus Mus. The digestion of ZP from mice with 4 glycoproteins occurs before than the digestion from mice with 3 glycoproteins. Furthermore, mice with 3 ZP proteins can fertilize mice with 4 ZP proteins. Carnivores: The mRNA of ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4 is expressed in ferret ovaries, whilst in fox the mRNA of ZP2, ZP3 and ZP4 is expressed, ZP1 being a pseudogene. Such ZP1 pseudogenization seems to only affect the Canidae family.

arnaldo@um.es / La oreja de mar Haliotis tuberculata, cuya cría en cautividad se encuentra muy poco desarrollada en Europa, resulta ser una especie potencial para la diversificación de la acuicultura de moluscos. Sin embargo, existen dos principales factores que limitan su producción. En primer lugar, el abastecimiento en alimento de calidad constituye un gasto significativo para las empresas. Además, en los últimos años, tanto las poblaciones naturales como las de cría han soportado altas tasas de mortalidad debidas a la presencia del patógeno Vibrio harveyi. El primer objetivo de esta tesis es la valorización de la macroalga G. turuturu como alimento para la oreja de mar. Por su carácter proliferativo, el alga roja Grateloupia turuturu, presente en la costa atlántica, constituye una importante fuente de biomasa disponible. Efectivamente, la composición bioquímica de Grateloupia turuturu resulta interesante para el crecimiento de la oreja de mar, la cual muestra una clara preferencia por las algas rojas. En el presente estudio, las macroalgas rojas Grateloupia turuturu y Palmaria palmata han sido probadas durante cinco meses como alimento para la oreja de mar europea Haliotis tuberculata tuberculata. Lo individuos fueron alimentados ad libitum mediante tres dietas diferentes: 1) Palmaria palmata, 2) Grateloupia turuturu y 3) dieta mixta de Palmaria palmata y Grateloupia turuturu (1:1). El interés nutricional fue evaluado mensualmente siguiendo para cada lote la mortalidad y el crecimiento de los individuos mediante medidas biométricas (longitud, anchura, peso). No se observó mortalidad durante el tiempo del experimento en cualquiera de los tratamientos. La composición bioquímica (proteínas, glúcidos, lípidos y cenizas) del producto final (el molusco tras finalizar el ensayo), así como el de las algas utilizadas como alimento, ha sido analizada. El consumo de algas por parte de los diferentes lotes de orejas de mar se estimó cada vez que distribuía nuevo alimento. El crecimiento en longitud y peso fue mayor para los abulones alimentados con P. palmata y la dieta mixta. Los abulones exhibieron una preferencia por P. palmata y mostraron la mayor ganancia de peso con este macroalga (107,8 ± 7,2%). Se ha comprobado que G. turuturu no puede ser utilizada en fresco como alimento monoespecífico para H. tuberculata tuberculata. Este hecho está relacionado con la rápida degradación de los tallos del alga en las condiciones de un criadero. No obstante, esta alga podría constituir un complemento alimenticio interesante para el gasterópodo. De hecho, cuando G. turuturu es suministrada en dieta mixta, los moluscos presentan un contenido mayor en lípidos que cuando son alimentados en dieta monoespecífica con Palmaria palmata. Otro objetivo de esta tesis consistió en estudiar los efectos de los extractos solubles, polares y apolares de la macroalga nativa Palmaria palmata y de la macroalga proliferante Grateloupia turuturu. Este estudio tenía como objeto hallar metabolitos potencialmente bioactivos sobre el crecimiento de V. harveyi. Estos análisis se llevaron a cabo mediante técnicas con microplacas (Bioscreen) y, en paralelo, análisis con RMN fueron efectuados con el fin de identificar eventuales diferencias en la composición de los extractos. Nuestros resultados preliminares, con un porcentaje de inhibición de 16%, son prometedores y muestran que G. turuturu posee un potencial antibacteriano que podría ser utilizado en aplicaciones futuras en acuicultura. Así, G. turuturu podría aplicarse a criaderos de oreja de mar en forma de extracto en el tratamiento del agua, en forma de alimento artificial o en co-cultivo formando parte de un sistema integrado junto con Haliotis tuberculata, gracias a sus propiedades antibacterianas contra Vibrio harveyi. Sería interesante también profundizar en la caracterización del/los metabolito/s responsable/s de esta actividad antibacteriana y una vez identificado/s, purificado/s con el objeto de caracterizar su naturaleza química y poder eventualmente mejorar su nivel de actividad antibiótica. / Valorization of the proliferating macroalgae Grateloupia turuturu in the farming of the European abalone Haliotis tuberculata Abalone Haliotis tuberculata, which farm production is not well developed in Europe, seems a potential candidate for the diversification of shellfish aquaculture. However, its production faces two main limitations. First, the supply of livestocks in quality food are a major expense for enterprises. Second, in recent years, natural populations as well as livestocks have suffered high mortalities related to the pathogenic bacterium Vibrio harveyi. The first objective of this thesis is the valuation of the macroalgae G. turuturu as feed for abalone. Because of its proliferative nature, red seaweed Grateloupia turuturu, present on the Atlantic coast, constitute represent an available biomass that could be valorized in abalone aquaculture. Indeed, Grateloupia turuturu presents a biochemical composition that could be of interest for abalone’s growth. This species shows a clear preference for red seaweeds. The suitability of two red algae species, Grateloupia turuturu and Palmaria palmata, as feed for the culture of the European abalone H. tuberculata, was evaluated over a 5-month period. Three experimental diets were tested: 1) Palmaria palmata, 2) Grateloupia turuturu and 3) a mixed diet of Palmaria palmata and Grateloupia turuturu (1:1). Biochemical composition (proteins, carbohydrates, lipids, ashes) of algae was measured. No mortality was observed during the time of the experiment in any of the treatments. Biochemical composition (proteins, carbohydrates, lipids and ash) from abalone (at the end of the experiment) and the algae used for food has been analyzed. Seaweed consumption by of abalone was estimated whenever new food distributed. Growth in length and weight was highest for abalones fed with P. palmata and the mixed diet. Abalones exhibited a preference for P. palmata and showed the highest weight gain with this macroalgae (107.8 ± 7.2%). G. turuturu was fast in desintegrating in abalone rearing conditions and was not suitable for good growth of H. tuberculata in a monospecific diet. However, this could be an interesting alga food supplement for the gastropod. In fact, when it is provided in G. turuturu mixed diet, molluscs have a higher lipid content that when fed diet in Palmaria palmata monospecific. Another goal of this thesis was to study the effects of soluble, polar and apolar Palmaria palmata native seaweed and Grateloupia turuturu proliferative seaweed extracts. The aim of this study was finding potentially bioactive metabolites on growth of V. harveyi. These analyzes were carried out by microplates techniques (Bioscreen) and, in parallel, NMR analyzes were performed to identify any differences in the composition of the extracts. Our preliminary results, with and percentage of inhibition of 16%, are promising and they showed that G. turuturu has an antibacterial potential that could be used in future applications in aquaculture. Thus, G. turuturu could be applied to breeding of abalone extract as water treatment, in the form of artificial food or co-cultivation of an integrated system with Haliotis tuberculata, thanks to its antibacterial properties against Vibrio harveyi. It would be interesting also to deepen the characterization of the metabolite manager this antibacterial activity and once identified, purified in order to characterize their chemical nature and to eventually improve their level of antibiotic activity.

Objetivo: El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento del sistema circadiano de teleósteos. Para ello se han utilizado cuatro especies, una especie de interés en investigación básica, el pez cebra, y tres especies de interés en acuicultura, la lubina, la dorada y la trucha arcoíris. Metodología: A lo largo de diferentes experimentos, se estudió la influencia de las condiciones de iluminación y de disponibilidad de alimento sobre los distintos ritmos circadianos de teleósteos y sobre la expresión de los principales genes que forman parte de los relojes moleculares. Asimismo, se analizó a nivel molecular la maduración de los relojes moleculares de teleósteos durante las primeras etapas del desarrollo y la influencia de las condiciones lumínicas sobre la funcionalidad de dichas estructuras. Resultados y conclusiones: Los principales resultados y conclusiones obtenidas fueron: - El gen per1 de lubina ha sido clonado y secuenciado. La expresion de este gen mostró un patrón de expresión circadiano, con una acrofase o pico de expresión cercana al final de la noche. - En larvas del lubina, la expresión del gen reloj per1, comienza en etapas tempranas del desarrollo, adquiriendo un patrón circadiano robusto a partir del día 16 post-eclosión bajo un ciclo LD. - El inicio de un patrón rítmico en la expresión de per1 en larvas de lubina requiere de la presencia un ciclo luz/oscuridad durante el desarrollo, permaneciendo arrítmico bajo condiciones constantes de luz u oscuridad. La composición del espectral de la luz utilizada en el ciclo LD, también afecta al comienzo de la expresión rítmica de este gen. - El fotoperiodo afecta a la expresión de los genes reloj durante el desarrollo embrionario de la trucha arcoíris. Bajo un fotoperiodo 12L:12D, se detectó un patrón rítmico de expresión en los genes reloj (per1 y clock) a partir del día 8 post-fertilización, mientras que la expresión rítmica de aanat2 es detectable a partir del día 21. Por el contrario, bajo condiciones constantes de luz, la expresión de los genes reloj es alterada. - Los ritmos de expresión de genes reloj en trucha arcoíris, podrían iniciarse por fotorreceptores aún no identificados, ya que aparecen antes del desarrollo de los fotorreceptores clásicos (pineal y retina), y no se observan bajo condiciones constantes. - Los peces cebra sometidos a alimentación periódica muestran una actividad anticipatoria al alimento, que se manifiesta como un aumento de la actividad locomotora en las horas previas a la hora de alimentación. - En pez cebra, el oscilador sincronizado por el alimento parece localizarse fuera del cerebro. - La alimentación aleatoria afecta a los ritmos de comportamiento en dorada provocando un aumento de los niveles diarios de actividad locomotora, mientras que la alimentación periódica provoca un incremento de la actividad locomotora en la las horas previas a la hora de la alimentación (FAA), mostrando un nivel de actividad diaria total menor. - En Dorada, la alimentación periódica mejora el bienestar animal y el crecimiento. Cuando los animales no pueden predecir la llegada del alimento aumentan los niveles de indicadores de estrés, como el cortisol y glucosa plasmáticos. Además, esta situación afecta al crecimiento, al menos a corto plazo. Estos resultados contribuyen al avance del conocimiento sobre sistema circadiano de teleósteos y ponen de manifiesto la importancia de las condiciones ambientales para el correcto desarrollo y funcionamiento del sistema circadiano, así como la influencia de este sistema sobre la fisiología global del todo el organismo. / Aims: The aim of this Doctoral Thesis is to improve our knowledge on the circadian system in teleosts. To this end, four species have been used: one species of interest in basic research, the zebrafish, and three species of interest in aquaculture, the bass, the sea bream and the rainbow trout. Methods: Throughout the different experiments, the influence of lighting conditions and food availability on the different circadian rhythms in teleosts, and on the expression of the principal genes which form part of the molecular clock, was studied. The maturation of the molecular clock in teleosts during the initial stages of development and the influence of lighting conditions on the functionality of said structures were also analysed. Results and conclusions: - The clock gene, per1, was cloned in sea bass. This gene showed a circadian pattern of expression, with an acrophase or peak expression near the end of the dark phase. - In European sea bass larvae, per1 expression starts in the early stages of development, showing a circadian pattern of expression from day 16 post— - In sea bass lavae, the photoperiod induces the start of a rhythmic pattern in per1 expression during development, remained arrhythmic under constant conditions of light and dark. The spectral composition of light used in the LD cycle, also affect the onset of rhythmic expression of this gene. - The photoperiod affects the expression of clock genes during the embryonic development of rainbow trout. Under a 12L: 12D photoperiod, the rhythmic expression of the clock genes (Per1 and clock) are detectable from day 8 post-fertilization (dpf), while aanat2 rhythmic expression is detectable from day 21dpf. By contrast, under LL, the expression of clock genes is altered, - In rainbow trout embryos, the rhythmic expression of per1 starts before the development of the classical photoreceptors (pineal and retina), and is not observed under LL, suggesting that this cycle could be initiated by other as yet unidentified photoreceptors. - Zebrafish subjected to periodic feeding showed Food Anticipatory Activity, which is manifested by an increase in the locomotor activity in the previous hours prior to meal time. - In zebrafish, the oscillator synchronized by food could be located outside the brain. - In sea bream, random feeding affects behavioural rhythms, increasing the locomotor activity levels. In contrast, periodic feeding induced an increase in locomotor activity in the hours prior to meal time (FAA). - In sea bream, scheduled feeding improves animal welfare. When the animals cannot predict the arrival of the food, the levels of stress indicators, such as cortisol and plasma glucose, are increased. ). In addition, periodic feeding improves growth in sea bream, at least in the short term. The results contribute to the advancement of scientific knowledge on the circadian system in teleosts and highlight the importance of environmental conditions for proper development and functioning of the circadian system, as well as the influence of this system on the overall physiology of the whole organism.

Objetivos. 1. Caracterización de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) a lo largo de su ciclo de vida. 2. Caracterización de la línea de pez cebra deficiente en la subunidad catalítica de la telomerasa (tert). 3. Estudio de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) durante el proceso de regeneración de la aleta caudal del pez cebra salvaje y del pez cebra tert-deficiente. - Metodología. Para el primer objetivo, se han utilizado peces cebra de tipo salvaje, de diferentes estirpes y edades. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, el estudio de la actividad telomerasa mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica. La longitud telomérica se ha cuantificado por técnicas diferentes: TRF que consiste en una hibridación con una sonda telomérica radioactiva, Q-FISH y Flow-FISH que consisten en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. Para el cumplimiento del segundo objetivo, se han utilizado los genotipos, tert+/+, tert+/- y tert-/-. Además de las técnicas antes citadas, se han realizado curvas de supervivencia y un estudio histológico sobre diferentes tejidos (Hematoxilina/Eosina, PAS y TUNEL). El estudio de la G2 mutante se ha llevado a cabo con curvas de supervivencia, ensayo de apoptosis por TUNEL, y Q-FISH en núcleos metafásicos. Para el tercer objetivo, con los mismos genotipos y a diferentes edades. Se ha realizado un ensayo de detección de los círculos de ADN telomérico, un ensayo de regeneración en adultos con inhibición de un gen utilizando un morfolino seguido de electroporación o en larvas con inhibición de un gen por inmersión. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Los resultados de esta tesis han demostrado la estrecha relación de la expresión de la telomerasa y la longitud de los telómeros durante la vida del pez, concluyendo que estos dos parámetros pueden ser utilizados como biomarcadores de envejecimiento en el pez cebra. La línea de pez cebra deficiente en telomerasa ha mostrado signos de envejecimiento prematuro, como curvatura de la columna, infertilidad y reducción de la vida media de la G1, apoyando al pez cebra como un modelo prometedor para estudiar el envejecimiento inducido por el telómero. Además, la G1 muestra activación de p53 en respuesta al desgaste telomerico, reproduce el fenómeno de anticipación genética, ligado al acortamiento telomérico observado en humanos con DC, debido a haploinsuficiencia de la telomerasa. La G2 muere en las primeras etapas de desarrollo y la restauración de la actividad telomerasa rescata la longitud de los telómeros y la supervivencia, indicando que la dosis de telomerasa es crucial. La inhibición genética de p53 rescata los efectos adversos de la perdidad de telómeros, indicando que los mecanismos moleculares están conservados desde peces hasta mamíferos. El estudio de regeneración demuestra que los genotipos tert+/+ y tert-/- regeneran después de una o varias escisiones, aunque la eficiencia de regeneración disminuye con el envejecimiento en ambos. La línea tert-/- regenera con un ratio de regeneración menor que tert+/+, y mantiene la longitud telomérica. ALT está implicado en el mantenimiento de los telómeros durante la regeneración de la aleta caudal en el pez mutante, y se necesitan más estudios para determinar el papel de la telomerasa y posiblemente de ALT en el pez cebra salvaje durante este proceso. / Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Characterization of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) throughout its life cycle. 2. Characterization of the tert-deficient zebrafish line. 3. Study of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) during the caudal fin regeneration process in wild-type and tert mutant - Methodology. For approaching the first goal, wild-type zebrafish from different strains and different ages have been used. The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence called Q-TRAP, and also analyzed quantitatively by TRAP. The telomere length was quantified using three different techniques: by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH and Flow-FISH) or by hybridization using a radioactive telomeric probe (TRF assay). To address the second goal, three zebrafish genotypes: tert+/+, tert+/- y tert-/- have been used. Besides the above techniques, survival curves to estimate the mean lifespan of the first generation (G1) of tert mutant line, and a histological study of different tissues (Hematoxylin / Eosin, PAS and TUNEL staining) have been performed. To study the tert mutant line G2: survival curves, apoptosis by TUNEL assay, and Q-FISH on metaphasic nucleus. To achieve the third objective, we have used all three genotypes at different ages. Telomere length was analyzed by Flow-FISH, and the detection of telomeric DNA circles by CCassay. A caudal fin regeneration assay on adult with gene inhibition using morpholino following by electroporation was performed and finally a caudal fin regeneration assay on larvae with gene inhibition by immersion. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. The results of this tesis have shown that the expression of telomerase and telomere length are closely related during the entire life cycle of the fish and that these two parameters can be used as biomarkers of aging in zebrafish. Telomerase-deficient zebrafish characterization have shown premature aging and reduced lifespan in the first generation, as occurs in humans and may be considered as a promising model to study telomere-driven aging. Interestingly, this mutant line reproduced the genetic anticipation phenomenon, related to telomere shortening, observed in humans with DC. The second-generation embryos died in early developmental stages, and restoration of telomerase activity rescued telomere length and survival, indicating that telomerase dosage is crucial. Genetic inhibition of p53 rescued the adverse effects of telomere loss, indicating that the molecular mechanisms induced by telomere shortening are conserved from fish to mammals. The regeneration study showed that all genotypes regenerated after single or successive amputations and that regeneration efficiency decreased with aging. Tert mutant line showed a lower regeneration rate than its wild-type counterpart, and maintained telomere length in the regenerative tissue. ALT mechanism is implicated in telomere maintenance during caudal fin regeneration in telomerase-deficient fish. Further studies are necessary to definitively elucidate the role of telomerase and the possible ALT implication in telomere maintenance during caudal fin regeneration in wild-type animals.

Tesis por compendio de publicaciones / Esta investigación se ha centrado en analizar el impacto directo e indirecto de los tres mamíferos invasores más comunes en los ecosistemas insulares (el ratón casero Mus domesticus, la rata negra Rattus rattus y el gato Felis silvestris catus), sobre la pardela cenicienta (Calonectris diomedea borealis). El trabajo se ha desarrollado en Corvo, que es la isla más remota del Archipiélago de las Azores y la última en ser descubierta y colonizada, por lo que la introducción de mamíferos invasores ocurrió en una época relativamente más reciente (aproximadamente en el año 1600). Por este motivo, esta isla preserva una gran diversidad de especies de aves marinas y la población más importante de pardela. A pesar de que otras especies de aves marinas (por ejemplo, el paíño de Madeira Oceanodroma castro o la pardela chica Puffinus assimilis) formaban colonias numerosas en el pasado, hoy día las poblaciones de estas especies han sufrido un drástico declive debido, principalmente, a la depredación por los mamíferos introducidos. Hasta el momento se desconoce el impacto de estos mamíferos en el éxito reproductor de la población de pardelas, sin embargo, esta información es útil a la hora de adoptar medidas de conservación. El propósito de este trabajo ha sido evaluar el impacto de múltiples mamíferos invasores coexistiendo en la isla de Corvo sobre el éxito reproductor de las pardelas. Aunque este impacto nunca ha sido estudiado de forma conjunta para varios mamíferos exóticos, teóricamente se sabe que puede ser diferente al producido por cada especie de forma aislada. Para ello, se han abordado diferentes aspectos ecológicos de estos mamíferos así como también las interacciones establecidas entre los mismos. Combinando información sobre el comportamiento trófico con los datos de abundancia y actividad en las inmediaciones de las colonias de pardela, se pudieron dilucidar dos tipos de interacciones entre las especies depredadoras de pardelas, las cuales influyen en el éxito reproductor de las pardelas. A pesar de que únicamente las relaciones letales (depredador-presa) han sido evidenciadas en las poblaciones de aves marinas, esta investigación abordó, además, el impacto indirecto de los depredadores afectando la intensidad de ectoparásitos de las pardelas. Los cuatro estudios científicos que engloban esta investigación demuestran que los gatos son los principales responsables del bajo éxito reproductor de las pardelas en la isla de Corvo. En relación a los roedores, únicamente las ratas depredan huevos y crías de pardela aunque no se rechaza la posibilidad de que los ratones también actúen como depredadores en ausencia de mamíferos invasores de un nivel trófico superior. Si bien cuando las pardelas están presentes en la isla éstas son intensamente depredadas por gatos, en aquellas colonias donde la abundancia de ratas es elevada, los gatos podrían depredar más ratas, favoreciendo así el éxito reproductor de las pardelas. Los dos depredadores de pardela (gatos y ratas) podrían competir, parcialmente, por la misma presa (pardelas). Sin embargo, las ratas parecen tener un impacto pequeño sobre el éxito reproductor de las pardelas. Esto es probablemente debido al tamaño reducido de sus poblaciones y a la elevada tasa de mortalidad, ya que constituyen la fuente de alimento más importante para los gatos. Por tanto, existe la posibilidad de que el comportamiento depredador de las ratas este siendo moderado por este felino. Por último, la presencia de depredadores en las proximidades de los nidos, además, incrementa la intensidad de ectoparásitos de las pardelas. Este impacto indirecto de los depredadores y ectoparásitos sobre las pardelas merece una atención especial, ya que afecta a la condición corporal, a la supervivencia de la nidada y, por tanto, a la salud de los individuos. La información recogida en este trabajo sobre la ecología de los mamíferos invasores en un ecosistema insular, es importante para implementar medidas que aumenten el éxito reproductor de las pardelas. Dicho aumento puede ayudar a enfrentar las amenazas sobre la población de adultos (por ejemplo las capturas accidentales en las redes de pesca) y contribuir para la sobrevivencia de las pardelas, evitando así daños irreversibles como los sufridos por otras especies vecinas. / This research was focused on the direct and indirect impact of the three most common invasive mammals in insular ecosystems (house mouse Mus domesticus, black rat Rattus rattus and cat Felis silvestris catus) on Cory’s shearwater (Calonectris diomedea borealis). The work has been carried out on Corvo, the most remote island of the Azores Archipelago and the last to be discovered and colonized. Consequently, the introduction of invasive mammals occurred more recently (approximately 1600). Therefore, Corvo supports a high diversity of seabird species and the largest population of Cory's shearwater. Although colonies of other seabird species (e.g. Madeiran storm petrel Oceanodroma castro or little shearwater Puffinus assimilis) were numerous in a recent past, today their populations have strongly declined mainly due to predation by introduced mammals. The impact of these mammals on Cory’s shearwater breeding success is unknown, however, this information is required to develop needed conservation measures. For each of the three invasive mammal species targeted in this study, evidence of their individual negative effects on seabird populations can be found within the scientific literature. However, the purpose of this research was to evaluate the overall impact of all coexisting invasive mammals on Corvo Island on the breeding success of Cory’s shearwaters. To achieve this, different ecological aspects of these mammals were studied as well as their relationships. Combining data on trophic behavior with activity around the Cory’s shearwater colonies could be observed two interactions established between cats and rats, which influenced the Cory’s shearwater breeding success. Although only evidence for lethal relationships (predator-prey) has been demostrated in seabirds, this research also addressed the indirect impact of predators influencing the ectoparasite intensity of Cory’s shearwater. The four scientific studies that encompassed this research showed that cats are principally responsible for the low breeding success of Cory’s shearwaters on Corvo Island. Among rodent species, only rats prey upon Cory’s shearwater nests; however mice could act as predators in the absence of invasive mammals occupying a higher trophic level. Even if Cory’s shearwaters were intensely preyed upon by cats during the breeding season, the availability of rats could limit cat predation of Cory’s shearwater chicks. Both predators of Cory’s shearwater (cats and rats) can compete for the same prey (Cory’s shearwaters); however rats seem to have a little impact on Cory’s shearwaters. This is probably due to the low abundance of rats and a high level of predation by cats as rats are their most important food source. Therefore, the predator behavior of rats could be moderated by cats. Lastly, the presence of predators in the vicinity of the nests increased Cory’s shearwater ectoparasite intensity. This indirect impact of predators and ectoparasites on Cory’s shearwaters deserved special attention because it affects body condition, nest survival, and, hence, the health of individuals. The information included in this research about the ecology of invasive mammals in insular ecosystems, is important for developing measures than can contribute to increase breeding success. Such increases can help address threats to the adult population (for example, bycatch in fishing nets) and contribute to the survival of Cory’s shearwaters, thus avoiding irreversible damage as that suffered by neighboring species.

Tesis por compendio de publicaciones / El objetivo fundamental de esta tesis fue ahondar en los procesos de evolución molecular de algunas de las distintas familias de ADN repetido que se usan de forma rutinaria en los trabajos de taxonomía, filogeografía y filogenética de plantas, para con herramientas de biología molecular (PCR, clonación, secuenciación…) y citogenética molecular (FISH) poner a prueba las teorías generalmente aceptadas sobre los procesos de variación y homogeneización de tales secuencias repetidas. En el primer trabajo de esta tesis como compendio de artículos, utilizando la secuencia de ADN satélite E180 previamente descrita para el género Medicago, diseñamos primers específicos para (1) evaluar la robustez y sensibilidad tanto de la PCR como del FISH para detectar familias de ADN repetido, (2) obtener nuevos datos sobre la evolución genómica (cariotípica) del género Medicago usando ADNsat como marcador, y (3) evaluar el rastro filogenético dejado por una familia de ADNsat en un género tan particular como Medicago, donde se tiene la evidencia de que complejos patrones de hibridación han jugado un papel fundamental en su historia evolutiva. Nuestros resultados demuestran que la detección tanto por técnicas moleculares como citogenéticas de la familia repetida E180 es altamente reproducible a través del género, y que los patrones cromosómicos sirvieron para diferenciar complejos de especies estrechamente relacionados (son taxón-específicos). El segundo trabajo de esta tesis vino motivado por las continuas referencias bibliográficas que usaban las secuencias de la familia de ADN ribosomal nuclear 5S como marcador genético en la práctica de concatenar partes diferentes de dos genes seguidos para usarlas como pertenecientes a un mismo gen, en la creencia de que la homogeneización de secuencia dentro de la familia era completa. En consecuencia comparamos la integridad de la secuencia (longitud, motivos universales conservados y estructura secundaria) y el comportamiento filogenético de zonas 5S codificantes completas en comparación con las quiméricas (concatenadas) de un grupo de genes de ADNrn 5S obtenido de varias especies estrechamente relacionadas. Los resultados que se desprenden sugieren que la homogeneización de secuencias no está operando, ni siquiera dentro de un mismo tándem, en la región codificante del ADNrn 5S, la cual había sido tradicionalmente considerada como un ejemplo de secuencia altamente conservada. De esta manera, la generalizada práctica de concatenar secuencias de genes 5S puede incrementar la diversidad haplotípica, distorsionando los patrones de evolución génica y conduciendo a relaciones haplotípicas incorrectas en algunas reconstrucciones evolutivas. En el tercer y último trabajo de la tesis, estudiamos la secuencia del espaciador intergénico (IGS) del ADNr 45S de Ginkgo biloba y Medicago arborea respectivamente. En el caso de G. biloba, y basándonos en trabajos previos, intentamos discernir si las familias de ADNrn 45S y 5S estaban o no combinadas en el mismo locus. Usando técnicas de citogenética molecular y secuenciación de ADN mostramos que la única organización existente en esta especie es la asociada (primera vez que se demuestra en gimnospermas), donde el gen 5S aparece insertado dentro del IGS 45S.