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Estudios in vitro e in vivos sobre la actividad de nuevos antifúngicos frente a hongos filamentosos oportunistas

Capilla Luque, Javier 06 November 2003 (has links)
DE LA TESIS DOCTORAL"ESTUDIOS IN VITRO E IN VIVO SOBRE LA ACTIVIDAD DE NUEVOS ANTIFÚNGICOS FRENTE A HONGOS FILAMENTOSOS OPORTUNISTAS"Javier Capilla LuqueEn los últimos años se ha experimentado un incremento en la frecuencia y gravedad de micosis sistémicas causadas por hongos filamentosos oportunistas. Algunos de estos hongos, los que han sido objeto de estudio en la presente tesis, presentan una elevada resistencia a los antifúngicos convencionales utilizados en clínica. El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue realizar estudios sobre la eficacia de nuevos compuestos con el fin de que éstos puedan ser útiles a nivel clínico. En la presente tesis doctoral se han desarrollado modelos experimentales de infecciones causadas por hongos filamentosos oportunistas en ratones, cobayas y conejos que reproducen las manifestaciones clínicas observadas en humanos. El desarrollo de estos modelos nos ha permitido evaluar la eficacia de nuevos compuestos.Hemos realizado modelos reproducibles de infecciones sistémicas ocasionadas por Aspergillus fumigatus, Scedosporium prolificans, Scedosporium apiospermum, Paecilomyces lilacinus y Fusarium spp. Se ensayaron terapias experimentales con antifungicos clásicos tales como anfotericina B (desoxicolato y liposomal), terbinafina o itraconazol y antifungicos de reciente síntesis como son micafungina, ravuconazol, nikomicina Z y voriconazol. Los modelos de scedosporiosis sistémica en conejos y cobayas así como de paecilomicosis o de aspergilosis cerebral en ratones han sido descritos por primera vez en la presente tesis doctoral. Hemos demostrado la eficacia de voriconazol en el tratamiento de la infección sistémica por S. apiospermum en ratones y cobayas así como la de albaconazol frente a S. prolificans en conejos. También hemos demostrado la eficacia de la micafungina administrada sola o en combinación con anfotericina B, itraconazol o nikomicina Z en el tratamiento de la aspergilosis sistémica en ratones. / OF THE DOCTORAL THESIS"IN VITRO AND IN VIVO ESTUDIES ABOUT THE ACTIVITY OF NEW ANTIFUNGALS AGAINST FILAMENTOUS OPPORTUNISTIC FUNGI"Javier Capilla LuqueIn the last decades the frequency and severity of systemic infections by filamentous opportunistic fungi have increased dramatically. Some of these fungi, such as Aspergillus fumigatus, Scedosporium prolificans, Scedosporium apiospermum, Paecilomyces lilacinus and Fusarium spp., are usually refractory to the conventional antifungical therapy. The principal aim of this work was to evaluate the efficacy of new antifungal agents in different animals model in order they can be use as new alternative for the treatment of these severe infections. We developed models of systemic infection in mice, guinea pigs and rabbits which reproduced human infection. We tested experimental therapies with conventional compunds such as amphotericin B (deoxycolate and liposomal), terbinafine or itraconazol and with new compounds such as micafungin, ravuconazole, nikomicin Z or voriconazole.The models of systemic scedosporiosis in rabbits and guinea pigs and paecylomicosis or cerebral aspergillosis in mice, have been described for the first time in this thesis.We demonstrated the efficacy of voriconazole against S. apiospermum in mice and guinea pigs and the efficacy of albaconazole in the treatment of systemic scedosporiosis by S. prolificans in rabbits. It was also demonstrated the high efficacy of micafungin alone or in combination with amphotericin B, itraconazole or nikomicin Z in the treatment of systemic aspergillosis in mice.
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Estudio de metales pesados en suelos bajo cultivos hortícolas de la provincia de Castellón.

Peris Mendoza, Mónica 16 November 2005 (has links)
La contaminación de los suelos por metales pesados es un problema ambiental que desde hace tiempo preocupa a los científicos, ya que desde el suelo los metales pueden ser transferidos a otras partes del ecosistema (p. ej. cultivos, aguas subterráneas,.) entrando en la cadena trófica. En este trabajo se estudian los metales pesados (Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb y Zn) en suelos sobre los que se desarrollan cultivos hortícolas en la provincia de Castellón y se analiza la posible transferencia de los metales en el sistema suelo-planta. Para llevar a cabo este estudio se determinaron características edáficas, así como la concentración de metales pesados en los suelos (método USEPA 3051A y extracción con EDTA). También se analizó la concentración de metales en dos tipos de cultivos (cultivos de hoja y cultivos de inflorescencia).Los suelos hortícolas de la provincia de Castellón son generalmente básicos y carbonatados, no presentan problemas por salinidad y el contenido de materia orgánica es elevado e, incluso, muy elevado en algunas parcelas. La capacidad de intercambio catiónico de los suelos es desde muy baja a elevada y la textura es mayoritariamente Franca, Franco-Arcillosa o Franco-Limosa.Las concentraciones medias de metales totales (mg/kg) en el área de estudio son: 0,328 para el Cd, 7,7 para el Co, 33,3 para el Cr, 36,6 para el Cu, 16.915 para el Fe, 385 para el Mn, 19,3 para el Ni, 55,8 para el Pb y 78,5 para el Zn. Estos resultados reflejan, mayoritariamente, niveles normales para suelos agrícolas en base a la comparación realizada con otros estudios descritos en la bibliografía. Sin embargo, un análisis individualizado de las parcelas refleja la existencia de niveles elevados de Cr, Cu, Pb y Zn en algunas parcelas, que probablemente son consecuencia de algún proceso puntual de contaminación.Los resultados de los análisis multivariantes muestran la existencia de dos grupos de metales pesados que se diferencian en cuanto a su origen en las parcelas analizadas. Así, el primer grupo está formado por Fe, Ni, Co, Cr y Mn, que su origen es mayoritariamente consecuencia de la alteración del material originario, mientras en el segundo grupo se agrupan el Cd, Cu, Pb y Zn por tener generalmente un origen antrópico. Además, los porcentajes medios de la fracción extraíble con EDTA respecto a su contenido total indican que el Cd, Cu, Pb y Zn son los metales en el área de estudio que presentan una mayor potencialidad de transferencia, probablemente, debido a su origen antrópico.Los contenidos de Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni y Pb son mayores en los cultivos de hoja que en los cultivos de inflorescencia, a pesar de que para algunos metales la concentración es mayor en los suelos con cultivos de inflorescencia. Así, las distintas concentraciones entre los dos tipos de cultivos para la mayoría de metales parecen ser mayoritariamente consecuencia de diferencias fisiológicas, ya que los cultivos de hoja son acumuladores de metales.Finalmente, a partir de las concentraciones de metales totales, tras derivar mediante distintos métodos estadísticos niveles de fondo y valores de referencia, se realizó una propuesta de niveles de fondo y valores de referencia para suelos con cultivos hortícolas de la provincia de Castellón. Estos valores permitirán evaluar la existencia de procesos de contaminación por metales pesados y, siguiendo los criterios establecidos en el Real Decreto 9/2005, declarar un suelo como contaminado en el área de estudio. / Heavy metals can be transferred from soils to other ecosystem parts, and affect ecosystems and human health through the web chain. Since several years, this environmental issue concerns scientists. In this context, heavy metal concentrations were studied in agricultural soils devoted to vegetable crops in the province of Castellón (East Spain), where an intensive agriculture takes place. Furthermore, heavy metals bioavailability and their influence on vegetable crops are studied, as starting point for developing adequate strategies to prevent soil contamination. Soil properties, total and extractable heavy metal contents in soils (USEPA 3051A method and EDTA 0,05M extraction) and heavy metal contents in crops (leaf and inflorescence crops) were determined to carry out this study.Total concentrations (mg/kg) of heavy metals (0,328 for Cd, 7,7 for Co, 33,3 for Cr, 36,6 for Cu, 16.915 for Fe, 385 for Mn, 19,3 for Ni, 55,8 for Pb and 78,5 for Zn) reflect normal levels for agriculture soils. However, high levels have been found in some samples, where probably contaminated associated to inadequate practices are acting. Two groups of heavy metals were obtained by multivariate analysis, which may indicate source of the heavy metals. Furthermore, mean percentages of extractable fraction relative to total content reflect that Cd, Cu, Pb and Zn are more bioavailability. This can be due to their human-induced origin.The comparison of heavy metal contents between the two crop types and soils, which were grouped by crop types, shows that heavy metal contents (Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni and Pb) were higher in leaf crops than in inflorescence crops, except for Zn. The higher contents of heavy metals in leaf crops seem to be due to metabolic processes as these crops are accumulators.Finally, total concentrations were considered to establish background and reference values for agricultural soils with vegetable crops in Castellón. These values were derived by applying several statistic approaches, and one of them were selected as a proposal of reference values. This proposal will allow assessing contaminated processes by heavy metals and, following Spanish Royal Decree 9/2005, to declare a soil as contaminated.
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Marine aerosols, their precursors and their influence on clouds over the global ocean

Lana Celaya, María Aránzazu 10 February 2012 (has links)
Marine aerosols have a large potential to influence the Earth¿s climate through their effects on cloud properties. The CLAW hypothesis goes further, and suggests that marine aerosols formed by the sulphur cycle of the ocean and the atmosphere act as a mechanism for regulating the Earth's climate. This effect is produced through the influence of plankton emissions of sulphur compounds on cloud formation. Phytoplankton produces dimethylsulphide (DMS), a highly volatile sulphur compound. Once in the atmosphere, DMS is oxidized and becomes the main source of natural atmospheric sulphates. These sulphates act as condensation nuclei, particles that are essential for the formation of clouds. Those marine particles in the atmosphere play an important role in the Earth's radiation budget. Indirectly they produce a greater amount of cloud droplets. Higher cloud condensation nuclei imply smaller cloud droplets. The efficiency of smaller droplets in reflecting incident solar radiation is greater, resulting in an increase in cloud albedo, producing a cooling effect on the Earth's surface. To properly study the marine aerosols we need accurate knowledge of the global seawater distribution of the aerosol precursors. Our work focused on the ocean-to-atmosphere emissions of DMS and other biogenic gases that can have an impact on cloud microphysics. During the thesis we updated the monthly global DMS climatology taking advantage of the three-fold increased size and better resolved distribution of the observations available in the DMS database. The emerging patterns found with the previous versions of the database and climatology were explored with the updated version. The statistical relationships between the seasonalities of DMS concentrations and solar radiation doses and chlorophyll a concentrations were here re-examined. Analyses of nine years of satellite data suggested that there is a natural inverse correlation between the spatial cover of low marine clouds and the cloud droplet size, which is related to the presence of small aerosols. This coupled seasonality pushes cloud albedo to contribute higher negative radiative forcing in summer and lower in winter. This relation is disrupted in the marine atmosphere regions heavily impacted by anthropogenic aerosols. Consequently, the potential influence the aerosol precursors have on marine clouds was next analysed over unpolluted and polluted ocean, separately. The 9 years of global satellite data and ocean climatologies were used to derive parameterizations of the production fluxes of secondary aerosols formed by oxidation of DMS and other biogenic organic volatiles. Further, the emission fluxes of biogenic primary organic and sea salt aerosols ejected by wind action on sea surface were also globally studied. Series of weekly estimates of these fluxes were correlated to series of cloud droplet effective radius. The outcome of the statistical analyses indicated that sulphur and organic secondary aerosols might be important in seeding cloud nucleation and droplet activation over mid and high latitude unpolluted oceanic regions. Conversely, primary aerosols (organic and sea salt) showed that, despite contributing to large shares of the marine aerosol mass, they do not seem to be major drivers of the variability of cloud microphysics. Our results provide partial support for the feasibility of the CLAW hypothesis at the seasonal scale. Despite that DMS has drawn much of the attention on the links between marine biota and climate regulation, the implication of other biogenic precursors on cloud formation provides and suggests a wider scope on the formulation of such hypothesis. / Los aerosoles marinos tienen un gran potencial para influir en el clima de la Tierra a través de sus efectos en las propiedades de las nubes. La hipótesis de CLAW va más allá y sugiere que los aerosoles marinos formados por el ciclo del azufre en océanos y atmósfera actúan como un mecanismo para la regulación del clima de la Tierra. Este efecto se produce a través de la influencia de las emisiones de plancton de compuestos de azufre en la formación de nubes. El fitoplancton produce sulfuro de dimetilo (DMS), un compuesto de azufre altamente volátil. Una vez en la atmósfera, el DMS se oxida y se convierte en la principal fuente de sulfatos naturales atmosféricos. Estos sulfatos actúan como núcleos de condensación, partículas esenciales para la formación de nubes. Estas partículas presentes en la atmósfera marina juegan un papel importante en el ciclo radiativo de la Tierra. Indirectamente, producen una mayor cantidad de gotas de las nubes. Mayor número de núcleos de condensación en las nubes implica gotas de nubes más pequeñas. La eficacia de las pequeñas gotas en reflejar la radiación solar incidente es mayor, lo que resulta en un aumento del albedo de las nubes, produciendo un efecto de enfriamiento en la superficie de la Tierra. Para estudiar adecuadamente los aerosoles marinos necesitamos tener un correcto conocimiento de la distribución oceánica global de los precursores de aerosoles. Nuestro trabajo se ha centrado en las emisiones del océano a la atmósfera de DMS y otros gases biogénicos que puede tener un impacto en la microfísica de nubes. Durante la tesis se ha actualizado la climatología mensual global de DMS, aprovechando el aumento en tres veces del número de observaciones y una mejor distribución global de las mismas, en la base de datos de DMS. Los patrones emergentes encontrados con las versiones anteriores de la base de datos y de la climatología se han re-evaluado con la versión actualizada. Las relaciones estadísticas encontradas entre la evolución temporal de las concentraciones de DMS y las dosis de radiación solar y concentraciones de clorofila han sido re-examinadas. Los análisis de nueve años de datos de satélite sugieren que existe una correlación inversa entre la cubierta espacial de nubes marinas bajas y el tamaño de las gotas de nubes, relacionado con la presencia de aerosoles pequeños. Esta estacionalidad acoplada conduce al albedo de las nubes a contribuir a un forzamiento radiativo negativo superior en verano, y más bajo en invierno. Esta relación se interrumpe en las regiones de la atmósfera marina con un alto impacto de los aerosoles antropogénicos. En consecuencia, la posible influencia de los precursores de aerosoles marinos en las nubes se ha analizado en una atmósfera marina limpia y contaminada, por separado. Los 9 años de datos satelitales globales y climatologías oceánicas se han utilizado para derivar las parametrizaciones de los flujos de producción de aerosoles secundarios, formados por la oxidación de DMS, y otros compuestos volátiles orgánicos biogénicos. Además, los flujos de emisiones biogénicas de aerosoles primarios orgánicos y aerosoles de sal marina expulsados por acción del viento sobre la superficie del mar se ha estudiado también a nivel global. Las series semanales de las estimaciones de estos flujos se han correlacionado con las series temporales de los radios de las gotas de nubes. El resultado de los análisis estadísticos ha indicado que el azufre orgánico y otros aerosoles secundarios pueden ser importantes en la nucleación y la activación de sus gotas sobre las regiones oceánicas no contaminadas en latitudes medias y altas. Por el contrario, aerosoles primarios (orgánico y la sal del mar) han mostrado que, a pesar de que contribuyen a una gran proporción de la masa de aerosol marino, no parecen ser los principales motores de la variabilidad de la microfísica de nubes. Nuestros resultados proporcionan un apoyo parcial a la viabilidad de la hipótesis de CLAW a escala estacional. A pesar de que el DMS ha llamado mucho la atención sobre los vínculos entre la biota marina y la regulación del clima, la implicación de otros precursores biogénicos en la formación de nubes ofrece y sugiere un mayor alcance en la formulación de esta hipótesis.
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Estrés oxidativo endógeno en la levadura Schizosaccharomyces pombe: su papel en la regulación del envejecimiento cronológico y en la activación de la quinasa STY1

Zuin, Alice, 1978- 15 October 2009 (has links)
En Schizosaccharomyces pombe, la ruta de la MAP quinasa Sty1 se activa por peróxido de hidrógeno extracelular para inducir una respuesta celular antioxidante. Sin embargo, también puede activarse por otras condiciones de estrés, como la transición a la fase estacionaria de crecimiento. Nuestro trabajo de tesis se ha centrado en la caracterización de este proceso, y en averiguar cómo las condiciones medioambientales y genéticas modulan los niveles de estrés oxidativo endógeno. Por ultimo, entender cómo estos diferentes factores nutricionales y genéticos regulan el envejecimiento cronológico de la levadura de fisión, y cuál es el papel de Sty1 en dicha regulación, han constituido gran parte de nuestro trabajo de tesis. / In Schizosaccharomyces pombe, MAP kinase pathway Sty1 is activated by extracellular hydrogen peroxide to induce an antioxidant cellular response. However, Sty1 can be activated by other stress situations, like transition to stationary growth phase. We focused our thesis work on the characterization of this process and on finding out how environmental and genetic conditions regulate endogenous oxidative stress. Finally, to find out how these different nutritional and genetic factors modulate fission yeast chronological aging and which is Sty1 function in the mentioned modulation, represented a large part of our work.
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Health benefits of olive oil: contribution of phenolic compunds and transcriptomic response in humans

Khymenets, Olha, 1974- 21 June 2010 (has links)
The evaluation of olive oil antioxidants, hydroxytyrosol and tyrosol, in vivo biological activities is challenged due to scarce data on their metabolic disposition and activities of their glucuronides, main metabolites found in humans in different biological matrices after olive oil consumption. In addition, the in vivo gene expression activity of virgin olive oil (VOO) as a dietary component has been never investigated in humans.Therefore, this Thesis was focused on three main aspects: (i) analysis of bioavailability of hydroxytyrosol and tyrosol glucuronides in humans; (ii) evaluation of the impact of glucuronidation on antioxidant activities of olive oil phenolics; and (iii) identification mechanisms underlying beneficial action of VOO analyzing induced in vivo transcriptome response in humans. To complete with the objectives, the glucuroconjugated standards, required for bioavailability and antioxidant activities studies were synthesized, and the preparative methodological studies for VOO-transcriptomic experiment were carried out. As a result of experimental work performed within this Dissertation, the glucuronidation was shown to account for 75% of recovered in urine olive oil phenols, and to have negative impact on their antioxidants activities, diminishing their free radical and inhibitory against LDL oxidation activities. The transcriptome studies revealed 10 genes as potential targets of VOO action against atherosclerosis.La avaluació in vivo de les activitats biològiques dels polifenols del oli d'oliva (OVV) hidroxitirosol i tirosol es un repte degut a les dades molt limitades que tenim de la seva depuració metabòlica i de les activitats biològiques dels seus principals metabòlits en matrius biològiques: els seus glucuronoconjugats. A més a més s'ha avaluat l'expressió gènica induïda en humans per la ingesta de OOV. Així la present tesi doctoral s'ha focalitzat en els següents aspectes: l'avaluació de la biodisponibilitat del hidroxitirosol i tirosol en humans; l'impacte de la glucuronoconjugació sobre les activitats antioxidants dels polifenols del OOV; i la identificació dels mecanismes subjacents a las accions benèfiques per la salut humana, analitzant la resposta transcriptòmica in vivo resultant de la ingesta OOV. Per complir amb els objectius de la tesi, ha estat necessari, sintetitzar patrons dels glucurònids i realitzar diversos estudis metodològics per tal d'estandarditzar l'avaluació de l'expressió gènica. S'ha demostrat que la glucuronoconjugació es un 75% dels polifenols recuperats en orina i que aquesta comporta la pèrdua de la capacitat bescanviadora de radicals i de la seva capacitat antioxidant (test ex-vivo d'oxidació de la LDL i DPPH). Els estudis transcriptòmics han detectat 10 gens rellevants pels efectes antiateroscleròtics induïts per OVV.
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Ethnicity, linguistics, and genetic diversity in native Mexicans : reconstructing the population history of Mesoamerica

Sandoval Mendoza, Karla 25 April 2010 (has links)
Mesoamerica is one of the main centers of New World civilization. It represents today a large geographical area exhibiting one of the highest genetic, cultural, and archeological diversity in the Americas. Moreover, its geographic position has been a key factor for acting as a natural corridor between North and Central-South America, thus becoming a direct witness not only of the initial and subsequent human migration waves but also of the many civilizations that flourished later on. Therefore, Mesoamerica deserves special attention in the study of American history. Following a molecular anthropological approach, this thesis evaluates the genetic diversity of a representative sample of the extant Native American gene pool within Mexico, and by constructing continental datasets, it also intends to contribute to the reconstruction of Mesoamerican history and the peopling of the Americas. For that purpose, this work focuses on the study of uniparental markers located in the human mitochondrial DNA and Y-chromosome, which constitutes the main part of the analyses. Additionally, autosomal STR variation, linguistic diversity, and ethnographic data were also investigated. Our results, based on both mtDNA and Y-chromosome, show a clear differentiation of the Native Mexican groups that belong to Mesoamerica, suggesting that population dynamcs occurring within this cultural area were unique during the America's colonization process and thus uniquely shaped the native Mexican genome. / Mesoamerica merece especial atención dentro del estudio de la historia del Nuevo Mundo debido a que es una de las principales áreas geográficas con mayor diversidad genética, cultural y arqueológica en América. Un factor clave es su posición geográfica, ya que ha actuado como un corredor natural de unión entre Norte y Centro-Suramérica, convirtiéndose en testigo directo no solo de las primeras y subsecuentes oleadas migratorias, sino también del posterior florecimiento de grandes civilizaciones mesoamericanas. Siguiendo un enfoque antropomolecular, la presente tesis doctoral evalúa la diversidad genética de una muestra representativa del pool genético actual de las poblaciones nativas de México. Asi mismo, por medio de la construcción de bases de datos a nivel continental, pretende contribuir a la reconstrucción de la historia Mesoamericana y del Poblamiento de América. Con este objetivo, se analizaron marcadores uniparentales localizados en el ADN mitocondrial y el cromosoma Y, lo cual constituye el principal componente del trabajo. Complementarianente, también se analizó la variabilidad observada a nivel de STRs autosómicos, clasificacion lingüística y caracterisitcas etnográficas, lo cual aporta un enfoque multidisciplinario a la investigación. Nuestros resultados, basados tanto en ADNmt como en cromosoma Y, muestran una clara diferenciacion de los grupos nativos pertenecientes a Mesoamerica en comparacion con el resto, sugieriendo la presencia de una dinámica poblacional única y enfatizando la relevancia de esta área cultural en el proceso de colonización de América.
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Utilización de biomarcadores para evaluar el estado fisiológico de la ostra en el Delta del Ebro

Ochoa Villalba, Victoria 31 October 2012 (has links)
La aplicación de pesticidas en el Delta del Ebro (NE de España) durante el periodo de cultivo de arroz se ha asociado a episodios de mortalidad de ostras (Crassostrea gigas) que ocurren anualmente durante la primavera. Sin embargo no hay estudios previos que hayan realizado una evaluación directa de los niveles de pesticidas en agua y efectos en las ostras cultivadas en las bahías del Delta del Ebro. En el presente trabajo de Tesis, se monitorizaron parámetros físico-químicos y contenido de pesticidas en agua, el contenido de metales pesados en ostras y hasta 19 marcadores bioquímicos en ostras transplantadas durante el periodo de máxima aplicación de pesticidas (de Mayo a Junio) en dos años consecutivos (2008 y 2009) con el objetivo de establecer posibles conexiones entre ellos y con los episodios de mortalidad de las ostras. Los resultados de los niveles de metales en las ostras son similares a los encontrados en zonas no contaminadas indicando que los metales presentes en el agua de las bahías son bajos. Los patrones de acumulación de metales diferenciaron dos fuentes de contaminación: una procedente de las actividades agrícolas dentro del propio Delta del Ebro para el As, Cu, Zn y otra procedente del río Ebro, relativa a las actividades industriales aguas arriba (Hg y Pb) o al plomo procedente de las actividades cinegéticas (Pb). Los niveles de pesticidas encontrados en el agua de las bahías, fueron elevados y similares a los encontrados en áreas impactadas por lo que se estudió su relación con las respuestas fisiológicas observadas en las ostras. Las actividades de las colinesterasas analizadas en branquias se mostraron invariables en el tiempo y puntos de muestreo lo que indicó una escasa sensibilidad a la presencia de pesticidas organofosforados y carbamatos en agua. Sin embargo la actividad de la carboxilesterasa en branquias se mostró correlacionada con los residuos de pesticidas organofosforados y carbamatos presentes en agua pudiéndose considerar un buen indicador de exposición a pesticidas anticolinérgicos en ostras. Las respuestas de los biomarcadores estudiados evidenciaron claras diferencias entre las ostras en los dos años de estudio. En el año 2009 las ostras mostraron sus defensas antioxidantes inalteradas desde principios de Mayo hasta finales de Junio y como consecuencia presentaron mayores daños en los tejidos (medidos como peroxidación de lípidos y niveles de liposfucina) y mayores tasas de mortalidad. Sin embargo las ostras en 2008, aumentaron sus defensas antioxidantes de Mayo a Junio y presentaron bajos niveles de peroxidación de lípidos, daños en el ADN y bajas tasas de mortalidad. Algunos pesticidas en agua como la bentazona y el propanil junto con las altas temperaturas y niveles de salinidad se relacionaron con los daños en los tejidos de ostras pero las grandes diferencias entre los dos años y la alta tasa de mortalidad registrada en el año 2009 parecen indicar que además de los factores abióticos podrían estar afectando otros factores como el uso de ostras sensibles a las enfermedades. Resultados obtenidos en el Institut de Recerca de Sant Carles de la Ràpita (IRTA) confirmaron una mayor incidencia de infecciones víricas en ostras en el 2009 lo que apoya la hipótesis de que la combinación de factores abióticos junto con una mayor propensión a las enfermedades fueron las causas de las mortalidades registradas en el 2009. / The use of pesticides in the Ebro Delta has been associated to Crassostrea gigas mortality. In the present Thesis physico-chemical parameter and pesticide levels in water, together with a battery of biomarkers and metal body burdens in oysters were monitored in oysters transplanted from May to June in 2008 and 2009 with the aim of establishing possible connections between them and the mortality of oysters. Metal accumulation patterns differed two sources: one from agricultural activities, (for As, Cu, Zn )and the another from industrial activities in the upper part of the Ebro River (Hg and Pb) or from hunting activities (Pb). Carboxylesterase activity in gills showed to be a good indicator of exposure to anticholinergic pesticides in oysters. Biomarkers responses evidenced clear differences between years. Oysters transplanted in 2008 increased their antioxidant defences from May to June and presented low oxidative damage and mortality rates. Conversely oysters transplanted in 2009 showed unaffected antioxidant defences from May to June and consequently increased levels of tissue damage and mortality rates. Bentazone and propanil together with high temperatures and salinity levels were related with tissue damage in oysters but the observed large differences between years and the high mortalities in 2009 suggest that in addition to abiotic factors, other factors such as the use of oysters susceptible to diseases could be affecting.
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Localized surface plasmon resonance for biosensing lab-on-a-chip applications

Acomovic, Srdjan S. 30 October 2012 (has links)
In recent times, metallic nanoparticle plasmonics coupled with applications towards biosensing has gathered momentum to the point where commercial R&D are investing large resources in developing the so-called localized surface plasmon resonance (LSPR) biosensors. Conceptually, the main motivation for the research presented within this thesis is achievement of fully-operational LSPR biosensor interfaced with the state-of-the-art microfluidics, allowing for very precise control of sample manipulation and stable read-out. LSPR sensors are specifficaly engineered by electron beam lithography nanofabrication technique, where nanoparticle interactions are optimized to exhibit increased sensitivity and higher signal-to-noise ratio. However, the overall performance of LSPR lab-on-a-chip device depends critically on the biorecognition layer preparation in combination with surface passivation. As an introduction, the principles of plasmonic biosensing are identified encompassing both Surface Plasmon Resonance (SPR) and Localized SPR. Being successfully implemented into commercial product, the governing physics of SPR is compared to LSPR in chapter 1, together with advantages and disadvantages of both. Chapter 2 describes methods necessary for LSPR biosensor development, beginning with nano-fabrication methods, the modelling tool (COMSOL Multiphisics), while the basics of micro-fabrication in microfluidics conclude this chapter, where passive and active microfluidics networks are discerned. Particularly attractive optical properties are exhibited by closely-coupled nanoparticles (dimers), with the dielectric gap of below tens of nm, which were theoretically predicted to be very suitable as LSPR biosensing substrates. Chapter 3 is subjected to optical characterization (dependence on the size of the dielectric gap) of nanofabricated dimer arrays. The acquired data demonstrate the advantages of the nanofabrication methods presented in chapter 2 and the technique for fast and reliable determination of nanoparticle characteristic parameters. The initial biosensing-like experiments presented in chapter 4 (no integration with microfluidics) proved for the first time, the theoretical predictions of higher sensitivity, yielding additionally the specific response as function of analyte size and dielectric gap between nanoparticles. The overall response of different dimer arrays (various gaps) provides information about adopted conformation of analyte protein once immobilized. Broad resonances of dimers feature higher noise when employing them for the real-time LSPR biosensing. As a way to circumvent such problem, the feasibility of employing far-field interaction within the nanoparticle array to spectrally narrow resonance is investigated in chapter 5 by optimizing the array periodicity and introducing thin waveguiding layers. Finally, the concluding chapter 6 is dedicated to a full assembly of a Lab-on-a-chip (LOC) LSPR biosensor, starting with interfacing plasmonic substrates with compatible active microfluidic networks, allowing the precise sample delivery and multiplexing. The prototype device consisting of 8 individual sensors is presented with typical modes of operation. The bulk refractive index determination of various samples demonstrates the working principle of such device. Finally, various strategies of biorecognition layer formation are discussed within the on-going research.
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Structural analysis of eythropoietin glycans

Llop Escorihuela, Esther 16 December 2008 (has links)
La eritropoyetina o EPO es una hormona glicoproteica. En los seres humanos adultos, se produce principalmente en el riñón, en respuesta a la reducción de oxígeno en los tejidos (hipoxia tisular). La EPO estimula la eritropoyesis, es decir, estimula a las células madre de la médula ósea para que aumenten la producción de eritrocitos. La molécula de EPO está formada por una cadena peptídica de 165 aminoácidos que contiene dos puentes disulfuro, un O-glicano (Ser-126), y tres N-glicanos (Asn-24, 38, 83). En conjunto, la glicosilación de esta proteína representa aproximadamente el 40% del peso total (29.4 kDa). La EPO sintetizada con tecnología recombinante (rEPO) se administra como fármaco, desde el año 1989, para el tratamiento de anemias, insuficiencia renal, cancer etc. También se ha observado la utilización de rEPO en deportistas con el fin de aumentar el suministro de oxígeno a los tejidos y así incrementar el rendimiento en deportes de resistencia. En el año 2001, se comercializó una "nueva proteína estimuladora de la eritropoyesis" llamada NESP. Esta proteína es un análogo hiperglicosilado de la EPO que posee dos N-glicanos adicionales (Asn-30, 88). El número y composición de los N-glicanos es muy importante para el metabolismo de estas glicoproteínas, ya que el contenido de carbohidratos (número de ácidos siálicos) determina su vida media. Los métodos que se utilizan actualmente para diferenciar la eritropoyetina endógena urinaria (uEPO) de sus análogos recombinantes (rEPO, NESP) están basados en las diferencias que existen entre sus perfiles isoelectroforéticos (IEF). Se cree que estas diferencias provienen de las células y/o especies en las que se expresan estas glicoproteínas. En este estudio, se llevo a cabo la caracterización estructural de diferentes preparaciones de EPO recombinante. Para ello, se utilizaron las técnicas más comunes en el campo de la glicoproteómica además de otras nuevas, desarrolladas para poder analizar los glicanos de muestras procedentes de geles 2-DE. Los perfiles de glicosilación total de cada una de estas glicoproteínas mostraron características estructurales que pueden facilitar la detección de rEPO y NESP en atletas que abusan de estas sustancias. Un ejemplo es la presencia de Neu5Gc únicamente en fármacos que han sido expresados en células CHO. La metodología desarrollada en este trabajo, podría emplearse también, para el control de calidad de estos fármacos y para el diagnóstico de ciertas patologías. / Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein hormone secreted primarily by adult kidneys in response to tissue hypoxia. It is involved in the maturation and ultimately regulation of the level of red blood cells. The EPO molecule comprises a single polypeptide chain of 165 aminoacids with two disulfide bonds, 1 O-linked (Ser-126), and 3 N-linked (Asn-24, 38, 83) glycans representing about 40% of the total mass (29.4 kDa). The recombinant analogue (rEPO), available since 1989 has found widespread use in the treatment of anaemia, renal failure, cancer etc. Besides, rEPO is illicitly used by athletes to boost the delivery of oxygen to the tissue and enhance performance in endurance sports. In 2001, a novel erythropoiesis-stimulating protein (NESP) was also marketed. NESP possesses two additional N-glycans (Asn-30, 88). The number and composition of the N-glycans is very important in the metabolism of this glycoprotein because the carbohydrate content (sialylation degree) determines its half-life time. Current tests to differentiate between urinary endogenous (uEPO) and its recombinant analogues (rEPO, NESP) are based on differences in their iso-electric focussing (IEF) profiles. Those differences are believed to stem from the cells/species in which they are expressed. In this study, the structural characterisation of different rEPO preparations was conducted using standard techniques in the field and developing new ones to address glycans from 2-DE sample preparations. Overall glycosylation profiling of each glycoprotein revealed structural features that may pave the way to the unambiguous detection of rEPOs and NESP abuse, such as the presence of Neu5Gc in CHO cell derived drugs only, and the developed methodology may be also employed for maintaining pharmaceutical quality control and for diagnosing pathologic conditions.
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Capture and identification of carbohydrate-binding proteins by SPR and CREDEX-MS

Jiménez-Castells, Carmen, 1982- 20 December 2010 (has links)
Carbohydrate-binding proteins of non-immunological origin -lectins- have been recognized over the last decades as decisive players in numerous biological processes, ranging from cellcell communication, fertilization, pathogen-cell adhesion to metastasis. Consequently, there is an increasing interest in finding powerful and nanosized tools to screen for these molecules and to study their carbohydrate interactions in detail. Here, two complementary approaches are described to characterize lectin-carbohydrate interactions with high sensitivity, low sample consumption, and without the need for sample labelling: SPR and CREDEX-MS. In SPR, we have developed an approach where the sugar is immobilized onto a sensor surface through a tailor-made peptide module that allows (1) to capture the lectin, (2) to characterize the interaction through kinetic and thermodynamic parameters, and (3) to identify the interacted protein by mass spectrometry. In CREDEX-MS, based on proteolytic excision of proteincarbohydrate complexes and mass spectrometric analysis, the peptides comforming the carbohydrate binding domain are identified. / Las lectinas (proteínas de origen no inmune capaces de reconocer azúcares) se han revelado en las últimas décadas como participantes cruciales en multitud de procesos biológicos, tales como la comunicación célula-célula, la fertilización, la adhesión del patógeno a la célula y la metástasis, entre muchos otros. Por lo tanto, existe un gran interés en el desarrollo de técnicas analíticas potentes para el estudio de las interacciones lectina-carbohidrato. En este trabajo, se describen dos aproximaciones complementarias mediante las cuales se pueden caracterizar las interacciones lectinas-azúcar con gran sensibilidad, poca utilización de muestra y sin la necesitad de ningún marcaje. En la técnica basada en resonancia de plasmón superficial (SPR), el azúcar es inmovilizado sobre una superficie a través de un módulo peptídico, lo cual permite (1) capturar la lectina, (2) caracterizar su interacción mediante parámetros cinéticos y termodinámicos y (3) identificar posteriormente la proteína mediante espectrometría de masas. Complementariamente, la técnica CREDEX-MS, basada en la excisión proteolítica del complejo proteína-azúcar y posterior análisis por espectrometría de masas, nos permite identificar los péptidos que forman parte del dominio de unión al azúcar.

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