Entendre quin és el cribratge al que estan sotmesos els pèptids abans de poder-se unir a les molècules del complex major d’histocompatibilitat classe II o major histocompatibility complex class II en angles (MHC classe II o HLA classe II en humans) per a més tard ser presentats als limfòcits T és especialment rellevant per les seves implicacions en salut, a l’estar involucrats en diferents processos relacionats amb la defensa de l’organisme, des de la resposta davant d’infeccions a les reaccions autoimmunitàries, passant pel reconeixement de les cèl·lules cancerígenes. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat desenvolupar diferents estratègies usant tècniques bioinformàtiques per a identificar els patrons que reconeixen les diferents molècules del HLA alhora de seleccionar els pèptids que més tard presentaran els diferents al·lels i, per extensió, poder arribar a predir si un determinat pèptid tindrà la capacitat d’unir-se a una determinada molècula d’HLA. Un cop desenvolupat l’algoritme de determinació i predicció de patrons es va construir una plataforma web per poder-hi analitzar grans quantitats de pèptids i/o proteïnes mitjançant diferents funcionalitats. Per a poder assolir aquests objectius, el treball es va dividir en tres fases diferents. La primera fase va consistir en construir una base de dades relacional en postgesql per a poder-hi emmagatzemar tant la informació requerida per al correcte funcionament de l’algoritme com les dades resultants de l’anàlisi d’aquesta informació. La informació requerida per al correcte funcionament de l’algoritme està formada per epítops per als quals es coneix si són o no presentats per les diferents molècules d’HLA classe II i diferents proteomes de patògens humans, així com el proteoma humà. A més a més, s’hi ha inclòs una secció privada on els usuaris registrats poden pujar-hi dades d’epítops derivades de les seves pròpies investigacions per poder-los analitzar en combinació amb les dades públiques del sistema per a una mateixa molècula. En la segona fase d’aquest treball es varen desenvolupar dos predictors, el primer usant un sistema basat en matrius de puntuació específiques de posició (position-specific scoring matrices en anglès, també conegudes com a PSSM) i el segon usant màquines d’aprenentatge de vectors de suport (Suport vector machines en anglès o SVM). Les PSSM varen ser desenvolupades usant un protocol iteratiu d’optimització, on es comença usant la informació proporcionada per l’alineament de segments de 9 residus en epítops, identificats com a possibles regions d’interacció amb les molècules d’HLA objectes de estudi, i posteriorment es va afegint informació tant de pèptids que no s’uneixen a la molècula com del grau de conservació dels diferents al·lels. Per a la construcció de la SVM, els segments d’unió dels pèptids a cada una de les molècules d’HLA es van definir a partir les PSSM construïdes per a cada una d’elles i els paràmetres per a la SVM amb una funció de base radial (Radial-basis function o RBF) com a nucli (kernel) varen ser fixades individualment per a cada cas a fi i efecte d’assolir els millors resultats possibles. En la tercera i última fase d’aquest projecte, es van construir dos pàgines web, una per cada predictor. Aquests predictors tenen en comú que els usuaris en general poden introduir-hi llistats de pèptids i/o proteïnes en format FASTA per a ser analitzades. Aquestes anàlisi tornen com a resultat els possibles motius d’unió detectats i la seva localització en els proteomes seleccionats. Una característica particular del predictor basat en PSSM és que els usuaris registrats poden pujar seqüències resultants de la seva pròpia investigació per trobar nous patrons d’unió a molècules d’HLA noves o millorar els existents i fer prediccions amb ells. / Understanding how peptides are selectively bound and presented by major histocompatibility complex class II molecules (MHC class II or HLA class II in humans) is of outmost importance for its broad implications in human health, from infection to autoimmunity or cancer. The aim of this thesis was to develop a computational strategy to identify HLA class II binding patterns for a variety of alleles and use this knowledge to predict their capacity to bind specific peptide sequences. To make an effective use of the prediction algorithm, a web-based platform for the analysis of large peptide or protein sets, including various functionalities, was also devised. In order to accomplish these objectives, the work was divided into three different stages. The first stage consisted in the construction of a postgresql relational database to store all the information required for and generated by the algorithms developed. The required, uploaded information (subject to updates) consisted of known HLA class II epitopes and the translated genomes of a list of pathogenic bacterial species and human. In addition, the database was designed to include a private section for the upload of user-owned epitope information, which the owner may use in combination with the public data. In a second stage two predictors were developed, one using position-specific scoring matrices (PSSMs) and the other one using a support vector machine (SVM). PSSM development was performed using an iterative optimisation protocol, starting from the alignment of known epitopes to identify HLA class II binding cores (9-residue segments) and incorporating additional information such as allele conservation and non-binders at different phases of the refinement. For SVM construction, the epitope core was defined using the corresponding PSSM and the parameters for the SVM with a radial-basis-function (RBF) kernel were set up individually for each molecule to get the best performance. In the third stage, two web pages were constructed, one for each predictor. The servers share a common part in which the user can introduce peptide or protein sequences in Fasta format to perform an analysis that delivers both putative epitopes and their localization in a selected proteome. In addition, the PSSM-based server allows the user to upload his/her own sequences to elucidate new HLA class II binding patterns and perform predictions with them.

Estudios previos de nuestro grupo demostraron que la hipertensión portal causa una importante inhibición de RNA mensajeros y proteínas implicadas en neurotransmisión adrenérgica, acompañada de una marcada atrofia simpática de los nervios que rodean la vasculatura mesentérica. Esta atrofia simpática local podría estar contribuyendo a la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal. La hipótesis que se estableció a partir de los resultados obtenidos asumía que durante la hipertensión portal, los cambios de presión detectados en la vasculatura esplácnica podrían promover una señal a través de la vía sensitiva aferente hasta los núcleos de regulación cardiovascular del tronco cerebral, donde se desencadenaría una respuesta eferente responsable de provocar la atrofia simpática. Los resultados de la primera parte del trabajo confirman esta hipótesis y apoyan el papel de la atrofia simpática en la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal, demostrando que mediante el bloqueo de la señal aferente con la neurotoxina capsaicina, de ratas con ligadura de la vena porta (PVL), se consigue evitar la atrofia simpática y las alteraciones hemodinámicas simultáneamente. Además, en ratas PVL, en el ganglio mesentérico superior (SMG) que contiene los somas de las neuronas adrenérgicas que inervan el mesenterio, se demostró un aumento en la expresión de neuromoduladores tales como el factor de crecimiento neuronal NGF y su precusor proNGF y la molécula quimiorepelente Semaforina 3A (Sema3A). Sema3A se localizó en el espacio interneuronal, alrededor de las neuronas adrenérgicas colocalizando con fibras positivas a VAChT. Este aumento en la expresión de moduladores neuronales también se evitó en ratas PVL tratadas con capsaicina. En la segunda parte del trabajo, con el objetivo de confirmar la vía neuronal en la hipertensión portal, se estudiaron dos estructuras intermediarias: el ganglio nodoso donde se confirmó un aumento de la señal aferente sensitiva, vía el nervio vago en animales con hipertensión portal y las neuronas simpáticas colinérgicas preganglionares del núcleo intermediolateral de la médula espinal donde se observó presencia de Sema3A, sugiriendo el origen del aumento de la expresión de Sema3A del SMG en las neuronas colinérgicas preganglionares. Por otro lado, se profundizó en el estudio de alteraciones en la expresión de neuromoduladores implicados en las vías de crecimiento/regresión axonal y supervivencia/muerte neuronal en el SMG de ratas PVL. La expresión de la forma activa del receptor de NGF, la tirosina quinasa A (TrkA), que conduce a la activación de las vías de supervivencia y crecimiento neuronal, se reveló disminuida en ratas PVL comparando con sham. Sin embargo, las vías de apoptosis y de retracción axonal se encontraron estimuladas en ratas PVL, exhibiendo una sobreexpresión significativa de Sema3A y de su receptor Neuropilina1, junto con un aumento en la expresión del receptor de proNGF, el receptor de neurotrofinas p75, la caspasa7 activa, la poli(ADP-ribosa) polimerasa inactiva y Rho kinasa. Finalmente, se probó la administración de un agonista de TrkA, la amida gambógica, en ratas PVL con el fin de estimular la vía de crecimiento y proliferación en detrimento de la vía apoptótica. Los resultados mostraron una mejora de las alteraciones hemodinámicas y de la atrofia simpática, a través de la activación de las vías de supervivencia y la inhibición de la cascada apoptótica y regresión axonal mediada por Rho kinasa. En conclusión, estos resultados indican que la alteración adrenérgica y la atrofia simpática en la vasculatura mesentérica durante la hipertensión portal tiene su origen en alteraciones de la neuromodulación que conducen a regresión simpática post-ganglionar y a apoptosis que contribuyen a la vasodilatación esplácnica. / We have previously demonstrated that portal hypertension causes an important inhibition of messenger RNA and proteins implicated in adrenergic neurotransmission and a marked atrophy in the sympathetic nerves surrounding mesenteric vasculature. This sympathetic atrophy could be contributing to the splanchnic vasodilation of portal hypertension. Our hypothesis assumed that during portal hypertension, pressure changes detected in the splanchnic vascular área could promote a signal through the visceral afferent sensitive pathway to the cardiovascular regulatory nuclei of the brainstem, triggering from there an efferent response resulting in sympathetic atrophy. The present results confirm this hypothesis and support the role for sympathetic atrophy in splanchnic arterial vasodilation of portal hypertension, showing that by blocking the sensitive afferent signal with capsaicin, the splanchnic sympathetic atrophy can be prevented in those animals where, simultaneously, the hemodynamic alterations were normalized. Indeed, in the superior mesenteric ganglia (SMG) of PVL, which contains the somas of adrenergic neurons that innervate the mesenteric vasculature, an increase in neuronal modulators such as nerve growth factor (NGF), its precursor proNGF and the chimiorepelent Semaphorine 3A (Sema3A) molecule was demonstrated. Sema3A localized in the interneuronal space surrounding adrenergic neurons and colocalizing with VAChT positive fibers. This increment in neuronal modulators was also avoided in capsaicin treated PVL. In the second part of the study, the neural pathway of portal hypertension was confirmed through the analysis of two intermediate structures. An increase in neuronal afferent activity was demonstrated in the vagal nodose ganglia of PVL rats and presence of Sema3A in the cholinergic sympathetic preganglionic neurons of the intermediolateral nucleus of the spinal cord suggested that it was the origin of the increased expression of Sema3A in the SMG. We also investigated alterations on neuromodulators and signaling pathways that, in the SMG of PVL rats, lead to axonal regression or apoptosis. We found that the active form of tyrosine kinase receptor A (TrkA), leading to proliferation and survival signaling was decreased in PVL compared to sham rats. In contrast, the apoptotic and axonal retraction pathways were stimulated in PVL, demonstrated by a significant overexpression in Sema3A and its receptor Neuropilin1, together with an increase in the neurotrophic receptor p75, the active caspase7 and the inactive poly(ADP-ribose) polymerase kinase expression. Finally, we tested the administration of a TrkA agonist, gambogic amide, in PVL rats. Our results showed an amelioration of hemodynamic alterations and sympathetic atrophy, through the activation of survival pathways and the inhibition of the apoptotic cascade and axonal regression mediated by Rho kinase. In conclusion, these results suggest that the adrenergic alterations and sympathetic atrophy observed in mesenteric vessels during portal hypertension is caused by alterations on neuromodulation leading to postganglionic sympathetic regression and apoptosis contributing to splanchnic vasodilation.

La susceptibilitat individual a l’autoimmunitat pot estar determinada per una combinació de polimorfismes específics de gens que codifiquen per a múltiples citocines, per al complex principal d'histocompatibilitat (MHC) , molècules d'adhesió i proteïnes cel·lulars. En aquest treball ens hem volgut centrar en l’associació d’al·lels del MHC amb les malalties immunitàries. L'explicació actual per a aquest tipus d'associacions proposa que les molècules del MHC que s'han trobat associades, uneixen de manera eficient als autoantígens lligats a la malaltia, la qual cosa dóna lloc a una resposta immune perifèrica contra els autoantígens. En aquest treball hem volgut aprofundir en la caracterització dels repertoris de pèptids presentats per molècules de classe II associades a autoimmunitat en humans i en ratolí, a partir dels pèptids naturals associats. Els mètodes de predicció de la unió d’un pèptid a un determinat MHC són importants per poder identificar aquells segments d’una proteïna que seran presentats a les cèl·lules T, i per tant ens poden ser útils a l’hora de generar vacunes peptídiques o pel desenvolupament de teràpies antigen-específiques. En humans, l’al·lel HLA-DR3 és conegut per la seva associació a malalties com la diabetis tipus 1 o la malaltia de Graves-Basedaw (GB) i en ratolíns el complexe H-2d s’associa a malalties tipus th2, entre elles també la malaltia GB, i diversos càncers. En aquest estudi s’ha fet servir el mètode establert al nostre laboratori basat en l’aïllament dels pèptids per immunoafinitat i l’anàlisi per espectròmetria de masses d’alta resolució. / SUMMARY: Individual susceptibility to autoimmunity may be determined by a combination of specific polymorphisms of genes encoding multiple cytokines by the major histocompatibility complex (MHC) proteins and cell adhesion molecules. In this study we wanted to focus the association of MHC alleles with immune diseases. The current explanation for these associations suggests that the MHC molecules that have been associated autoantigens bind efficiently linked to the disease, which leads to a peripheral immune response against those autoantigens. In this study, we wanted to characterize the repertoire of peptides presented by class II molecules associated with autoimmunity in humans and mice from natural peptides. The methods for predicting peptide binding to a particular MHC is important to identify those segments of a protein that will be presented to T cells, and therefore it can be useful in generating peptide vaccines or the development of antigen-specific therapies. In humans, the allele HLA-DR3 is known for its association with type 1 diabetes and Graves disease (GD) and the complex H-2d mice is associated with Th2 type disease as GD and various cancers. For this characterization, we used a method established in our laboratory based on the isolation of peptides by immunoafinity and analysis by high resolution mass spectrometry

Dinoflagellates are one of the most abundant and diverse groups of microalgae. Many dinoflagellates are covered with cellulose plates, whereas others lack these plates and are hence referred to as athecate or unarmoured. Unarmoured species have been historically poorly characterized because they deform when fixed with traditional methods. Most unarmoured genera are included within the order Gymnodiniales and are differentiated by morphological characters, but the recent combination of morphological observations with phylogenetic data concludes that molecular phylogenies do not support the "classical" morphological criteria used to distinguish the genera. It is also known that the order Gymnodiniales is not monophyletic. Consequently, the taxonomy of dinoflagellates has shifted to a combination of morphology and molecular information. The widespread use of molecular techniques has enabled detailed studies on the systematics of a lot of groups. Although many dinoflagellates are not easily cultivable and cannot be sequenced by standard techniques, the single-cell PCR technique has allowed obtaining sequences from a single cell by taking advantage of the large copy number of the ribosomal genes. Extensive identifications of dinoflagellates present in the NW Mediterranean Sea were carried out between the 1960s and 1980s. However, the diversity of unarmoured dinoflagellates was not suitably characterized because of the use of fixed samples and the lack of molecular tools. This thesis studies the diversity of dinoflagellates belonging to the Gymnodiniales order from the Catalan coast, as a representative site of the NW Mediterranean Sea. This thesis presents a revision of their taxonomy by combining morphological studies of live specimens with the respective phylogenetic information. Given that the phylogeny of most of the studied organisms had not been previously determined and the evidence that Gymnodiniales is not monophyletic, a secondary objective was to study the phylogenetic relationships of species. The D1-D2 region of the LSU rDNA sequence was selected to conduct the SC-PCR, but SSU rDNA sequences were obtained when necessary. The combination of morphological and molecular data has led to the identification of 58 unarmoured species belonging to the order Gymnodiniales. Ten morphospecies are detected for the first time in the Mediterranean Sea, and eight, for the first time along the Catalan coast (Chapter 1 and 2). Additionally, the application of single-cell PCR has resulted in the sequencing of 43 unarmoured species, 25 of them for the first time (Chapters 1 and 2). It has also allowed the detection and characterization of species previously undescribed, resulting in the erection of two new species: Gymnodinium litoralis (Chapter 3) and Polykrikos tanit (Chapter 4). Additionally, the toxic species Cochlodinium polykrikoides was detected for the first time along the Catalan coast. Most populations formed a newly differentiated ribotype, but others were included within a previously known one, demonstrating their coexistence in the Mediterranean Sea (Chapter 5). Finally, a Ceratoperidinium specimen was sequenced for the first time and a new phylogenetic clade was obtained, along with other unarmoured dinoflagellates, including Ceratoperidinium margalefii, Gyrodinium falcatum, which was transferred to the genus Ceratoperidinium, three Cochlodinium species, and two Gymnodinium-like organisms. This resulted in the emendation of the Ceratoperidiniaceae family and the genus Ceratoperidinum (Chapter 6). The correct identification of the species has allowed to conclude that there is a high diversity of unarmoured dinoflagellates in the Catalan coast, and to discuss the implications on the distribution and biogeography of the species at a Mediterranean level, as C. polykrikoides (Chapter 5), or globally, as for Gyrodinium spirale (Chapter 2) / Les dinoflagel•lades són un dels grups més abundants i diversos de microalgues. Moltes espècies estan cobertes amb plaques de cel•lulosa, mentre que d’altres que no en tenen són conegudes com a atecades o nues. Les espècies atecades han estat generalment mal caracteritzades ja que es deformen quan són fixades amb mètodes tradicionals. La majoria de gèneres atecats s'inclouen dins l’ordre Gymnodinials i es distingeixen per caràcters morfològics, però la combinació recent d'observacions morfològiques amb dades filogenètiques conclou que les filogènies moleculars no suporten els criteris morfològics clàssics utilitzats per distingir els gèneres. També es coneix que l’ordre Gymnodinials no és monofilètic. Per tant, la correcta taxonomia de dinoflagel•lades requereix una combinació d’informació morfològica i molecular. L'ús generalitzat de tècniques moleculars ha permès estudis detallats sobre la sistemàtica de molts grups. Tot i que moltes dinoflagel•lades no són fàcilment cultivables i no es poden seqüenciar mitjançant tècniques estàndards, la tècnica de single-cell PCR ha permès obtenir seqüències a partir d'una sola cèl•lula, aprofitant el gran nombre de còpies dels gens ribosòmics que les dinoflagel•lades contenen. Entre els anys 1960 i 1980 es van dur a terme identificacions extensives de les dinoflagel•lades existents al litoral català. Tanmateix, no es va caracteritzar adequadament la diversitat de dinoflagel•lades atecades degut a l’ús de mostres fixades i la manca d'eines moleculars. Aquesta memòria presenta l'estudi de la diversitat d'espècies de l’ordre Gymnodinials a la costa catalana com a representativa del NO del Mar Mediterrani, entre els anys 2010-2013. L'estudi presenta una revisió de la seva taxonomia pel que s'han combinant estudis morfològics d’exemplars vius amb la corresponent informació filogenètica. Atès que la filogènia d’alguns dels organismes estudiats no s'havia determinat amb anterioritat i l'evidència que l’ordre Gymnodinials no és monofilètic, el segon objectiu ha estat estudiar les relacions filogenètiques de les espècies. Es va seleccionar la regió D1-D2 del 28s rDNA per dur a terme els anàlisis amb SC-PCR, però també es van obtenir seqüències del 18s rDNA quan ha estat necessari. La combinació de les dades morfològiques i moleculars ha permès la identificació inequívoca de 58 espècies atecades pertanyents a l’ordre Gymnodinials. D’aquestes, es detecten deu morfoespècies per primera vegada a la mar Mediterrània, i vuit per primera vegada al litoral català (Capítols 1 i 2). A més, l'aplicació de la SC-PCR ha permès seqüenciar 43 espècies atecades, 25 de les quals per primera vegada (Capítols 1 i 2). També ha permès la detecció i caracterització d’espècies no descrites prèviament, que ha resultat en la descripció de les noves espècies Gymnodinium litoralis (Capítol 3) i Polykrikos tanit (Capítol 4). A més, es va detectar per primera vegada l'espècie tòxica Cochlodinium polykrikoides al litoral català. La majoria d’aquests organismes pertanyien a un nou ribotip, però d’altres quedaren inclosos en un ribotip ja conegut, demostrant la seva coexistència al Mar Mediterrani (Capítol 5). Finalment, es va seqüenciar per primera vegada un espècimen del gènere Ceratoperidinium i es va obtenir un nou grup filogenètic, juntament amb d’altres dinoflagel•lades atecades, incloent Ceratoperidinium margalefii, Gyrodinium falcatum, que va ser transferit al gènere Ceratoperidinium, tres espècies de Cochlodinium, i dos organismes semblants a Gymnodinium. Això va donar lloc a l'esmena de la família Ceratoperidiniaceae i del gènere Ceratoperidinum (Capítol 6). La correcta identificació de les espècies ha permès concloure que la costa catalana presenta una gran diversitat de dinoflagel•lades atecades, i discutir les implicacions en la distribució i biogeografia de les espècies a nivell de la Mediterrània, com el cas de C. polykrikoides (Capítol 5), o global, com el cas de Gyrodinium spirale (Capítol 2)

La calidad de los oocitos es sinónimo de competencia oocitaria y se define como la capacidad de un oocito para reanudar la meiosis, dividirse después de la fertilización, desarrollarse hasta la etapa de blastocisto, inducir la preñez y conseguir el nacimiento de un animal sano. La selección de los oocitos más competentes es un punto clave en los programas de producción in vitro de embriones (PIVE). El test de Azul de Cresol Brillante (BCB) es un método no invasivo que separa los oocitos que han finalizado su crecimiento (BCB+: citoplasma azul) de los oocitos con la enzima G6PDH activa o oocitos en proceso de crecimiento (BCB-: citoplasma incoloro). En esta tesis, hemos llevado a cabo 3 estudios para probar la capacidad del BCB en seleccionar los oocitos más competentes para la producción in vitro de embriones utilizando corderas como donantes de oocitos. Además se estudiará la competencia oocitaria en relación con el citoplasma y factores moleculares, sus respuestas a las diferentes técnicas de fecundación y nuevos medios de maduración para mejorar la PIVE. En el Experimento 1, se analizaron diferentes concentraciones del BCB (13, 26, 39 y 52 µM) y los oocitos fueron MIV-FIV y CIV. Se evaluó: diámetro de los oocitos, actividad mitocondrial, actividad del factor promotor de la maduración (MPF), la expresión de genes relacionados con el metabolismo (ATP1A1 y COX1) y la función constitutiva de la célula (CPEB y S100A10) y el desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Los resultados mostraron que 13 µM de BCB es una concentración adecuada que diferencia los oocitos más grandes (BCB+: 123,66 µm), competentes para desarrollar hasta blastocisto (21%) y con más células (69,71±6,19) que los BCB- (106,82 µm, 9% y 45,91±3,35, respectivamente). La actividad mitocondrial fue mayor en los BCB+ que en los BCB- (3369 y 1565 unidades arbitrarias, respectivamente) y también la actividad de MPF (1,479±0,09 y 1,184±0,05 densidad óptica, respectivamente). La expresión de genes no mostró correlación con la calidad de los oocitos. El objetivo del experimento 2 fue mejorar la producción in vitro de los oocitos BCB- mediante la adición de insulina transferrina selenio y ácido ascórbico durante 12 y 24 h de la MIV. El MPF y el contenido de ATP se midieron antes y después de la MIV. Los resultados no mostraron diferencias en la producción de blastocistos entre los oocitos BCB-. El MPF y el ATP aumentaron en todos los grupos (P <0,001) después de la MIV. En el Experimento 3 se estudiaron técnicas de fecundación como la FIV, ICSI y la activación partenogénetica (AP) en los oocitos BCB+ y BCB-. Se analizó el contenido del ATP intracelular. Los oocitos BCB+ tuvieron un desarrollo hasta blastocito significativamente mayor tras la FIV y la AP (31,7% y 20,5%, respectivamente) que los BCB- (6,7% y 8,8%, respectivamente). Sin embargo los oocitos inyectados (ICSI) no mostraron diferencias en los blastocistos producidos entre los BCB+ y BCB- (14,3% vs 11,8%, respectivamente). Los oocitos BCB+ mostraron tener mayor concentración de ATP que los BCB-. Finalmente podemos concluir que el test del BCB es una metodología fácil, rápida y adecuada para seleccionar los oocitos de corderas más competentes. Los oocitos BCB+ mostraron una mayor producción de blastocistos, actividad mitocondrial y del MPF y mayor contenido de ATP que los BCB-. El test de BCB es un método útil para ser incorporado en los protocolos de PIVE cuando se trabaja con un gran y heterogéneo número de oocitos. Sin embargo este test es menos interesante cuando se trabaja con un pequeño número de oocitos, como en laparoscópica o ICSI. / The oocyte quality is used as synonymous of oocyte competence defined as the ability of an oocyte to resume meiosis, cleave following fertilization, develop to the blastocyst stage, induce a pregnancy and bring the offspring to term in good health. The selection of more competent oocytes is an important point in in vitro embryo production programs. The Brilliant Cresyl Blue (BCB) test has been successfully used as a non invasive methodology to classify oocytes according to their cytoplasm coloration as grown (BCB+: blue cytoplasm) or growing (BCB-: colorless cytoplasm) oocytes. To our knowledge there are no previous reports using this test to select competent oocytes in sheep. We have carried out 3 studies to test the ability of the BCB to select the most competent prepubertal sheep oocytes for in vitro blastocyst embryo production. Furthermore, we pretend to improve the knowledge about oocyte competence related to their cytoplasmic and molecular performances, their responses to different techniques of fertilization and to test new maturation media to improve the blastocyst production. In Experiment 1, different concentrations of the BCB test (13, 26, 39 and 52 µM) were analyzed. After BCB culture all of oocytes were IVM-IVF and IVC. The parameters assessed in this study were: oocyte diameter, mitochondrial activity, maturation-promoting factor (MPF) activity, mRNA relative expression (RE) of genes related to metabolism (ATP1A1 and COX1) and constitutive function of the cell (CPEB and S100A10) and the blastocyst development. The results showed that 13 µM BCB during 60 min could be a suitable concentration to differentiate largest (BCB+, 123.66 µm) and most competent oocytes to develop to the blastocyst stage (21%) and with a higher number of cells (69.71±6.19 S.E.M.) compared with non-stained BCB- oocytes (106.82 µm, 9% and 45.91±3.35 S.E.M., respectively). Mitochondrial activity, assessed by MitoTracker Orange CMTMRos probe, was significantly higher in BCB+ than in BCB- oocytes after in vitro maturation (3369 and 1565 Arbitrary Units, respectively) and the MPF activity, assessed by CDC2 kinase activity assay, showed significantly higher activity at metaphase II stage in BCB+ than in BCB- oocytes (1.479±0.09 and 1.184±0.05 optical density, respectively). The mRNA RE of the different genes analyzed in this work did not show a correlation with the oocyte quality. In Experiment 2, the objective was to improve blastocyst production of small (BCB-) oocytes by addition of Insulin Transferrin Selenium and Ascorbic Acid during 12 and 24 h of IVM. MPF and ATP content were measure before and after IVM. Results showed no differences in blastocyst production between BCB oocytes. The MPF and ATP increased in all groups (P<0.001) after the IVM. In Experiment 3, the aim was to test the blastocyst production after IVF, ICSI and PA of BCB+ and BCB- oocytes. ATP content was analyzed. BCB+ oocytes developed significantly higher up to the blastocyst stage after IVF and PA (31.7% and 20.5%, respectively) than BCB- (6.7% and 8.8%, respectively) oocytes. However, ICSI treated oocytes did not show these differences between BCB+ and BCB- oocytes (14.3% vs 11.8%, respectively). BCB+ oocytes had significantly more ATP content than BCB- oocytes. Finally we can conclude that the BCB test is an easy, fast and suitable methodology to select the more competent sheep oocytes. Good quality oocytes (BCB+) showed higher blastocyst production, mitochondrial and MPF activity and ATP content than BCB- oocytes. The BCB test is a useful method to be incorporated in the embryo production protocol where a large and heterogeneous number of oocytes are use to be in vitro fertilized. However, BCB test is less interesting when working with a small number of oocytes such as in Laparoscopic Ovum Pick Up (LOPU) or ICSI.

En aquesta tesi interdisciplinar desenvolupem eines algebraiques per a problemes en filogenètica i genòmica. Per estudiar l'evolució molecular de les espècies sovint s'usen models evolutius estocàstics. L'evolució es representa en un arbre (anomenat filogenètic) on les espècies actuals corresponen a fulles de l'arbre i els nodes interiors corresponen a ancestres comuns a elles. La longitud d'una branca de l'arbre representa la quantitat de mutacions que han ocorregut entre les dues espècies adjacents a la branca. Llavors l'evolució de seqüències d'ADN en aquestes espècies es modelitza amb un procés Markov ocult al llarg de l'arbre. Si el procés de Markov se suposa a temps continu, normalment s'assumeix que també és homogeni i, en tal cas, els paràmetres del model són les entrades d'una raó de mutació instantània i les longituds de les branques. Si el procés de Markov és a temps discret, llavors els paràmetres del model són les probabilitats condicionades de substitució de nucleòtids al llarg de l'arbre i no hi ha cap hipòtesi d'homogeneïtat. Aquests últims són els tipus de models que considerem en aquesta tesi i són, per tant, més generals que els de temps continu. Des d'aquesta perspectiva s'estudien els problemes més bàsics de la filogenètica: donat un conjunt de seqüències d'ADN, com decidim quin és el model evolutiu més adequat? com inferim de forma eficient els paràmetres del model? I fins i tot, tal i com també hem provat en aquesta tesi, és possible que les espècies no hagin evolucionat seguint un sol arbre sinó una mescla d'arbres i llavors cal abordar aquestes preguntes en aquest cas més general. Per a models evolutius a temps continu i homogenis, s'ha proposat solucions diverses a aquestes preguntes al llarg de les últimes dècades. En aquesta tesi resolem aquests dos problemes per a models evolutius a temps discret usant tècniques algebraiques provinents d'àlgebra lineal, teoria de grups, geometria algebraica i estadística algebraica. A més a més, la nostra solució per al primer problema és vàlida també per a mescles filogenètiques. Hem fet tests dels mètodes proposats en aquesta tesi sobre dades simulades i dades reals del projectes ENCODE (Encyclopedia Of DNA Elements). Per tal de provar els nostres mètodes hem donat algoritmes per a generar seqüències evolucionant sota un model a temps discret amb un nombre esperat de mutacions prefixat. I així mateix, hem demostrat que aquests algorismes generen totes les seqüències possibles (per la majoria de models). Els tests sobre dades simulades mostren que els mètodes proposats són molt acurats i els resultats sobre dades reals permeten corroborar hipòtesis prèviament formulades. Tots els mètodes proposats en aquesta tesi han estat implementats per a un nombre arbitrari d'espècies i estan disponibles públicament. / In this thesis we develop interdisciplinary algebraic tools for genomic and phylogenetic problems. To study the molecular evolution of species one often uses stochastic evolutionary models. The evolution is represented in a tree (called phylogenetic tree) whose leaves represent current species and whose internal nodes correspond to their common ancestors. The length of a branch of the tree represents the number of mutations that have occurred between the two species adjacent to the branch. Then ,the evolution of DNA sequences in these species is modeled with a hidden Markov process along the tree. If the Markov process is assumed to be continuous in time, it is usually assumed homogeneous as well and, if so, the model parameters are the instantaneous rate of mutation and the lengths of the branches. If the Markov process is discrete in time, then the model parameters are the conditional probabilities of nucleotide substitution along the tree and there is no assumption of homogeneity. The latter are the types of models we consider in this thesis and are therefore more general than the homogeneous continuous ones. From this perspective we study the basic problems of phylogenetics: Given a set of DNA sequences, what is the evolutionary model that best fits the data? how can we efficiently infer the model parameters? Also, as we also checked in this thesis, it is possible that species have not evolved along a single tree but a mixture of trees so that we need to address these questions in this more general case. For continuous-time, homogeneous, evolutionary models, several solutions to these questions have been proposed during the last decades. In this thesis we solve these two problems for discrete-time evolutionary models, using algebraic techniques from linear algebra, group theory, algebraic geometry and algebraic statistics. In addition, our solution to the first problem is also valid for phylogenetic mixtures. We have made tests of the methods proposed in this thesis on simulated and real data from ENCODE Project (Encyclopedia Of DNA Elements). To test our methods, we also provide algorithms to generate sequences evolving under discrete-time models with a given expected number of mutations. Even more, we have proved that these algorithms generate all possible sequences (for most models). Tests on simulated data show that the methods are very accurate and our results on real data confirm hypotheses previously formulated. All the methods in this thesis have been implemented for an arbitrary number of species and are publicly available.

El presente trabajo se centra en el estudio comparativo de distintos aspectos de la respuesta frente a la exposición tóxica de cadmio de diferentes poblaciones de Artemia pertenecientes a las especies Artemia parthenogenetica, Artemia salina, Artemia franciscana y Artemia persimilis. La primera parte de este estudio, pone de manifiesto la variabilidad fenotípica de la respuesta letal a la exposición a cadmio que presentan los nauplios. En este sentido, la utilización de Modelos Lineales Generalizados ha sido de gran utilidad ya que ha permitido poner de manifiesto, a través de los parámetros que definen cada curva de mortalidad, diferencias en sensibilidad al tóxico y en la uniformidad de respuesta entre las distintas poblaciones de Artemia estudiadas. Además ha permitido conocer la influencia de factores genéticos (especie, nivel de ploidía), ambientales (población) así como el modo de reproducción (bisexual y partenogenética) en la sensibilidad al cadmio, destacando entre las demás poblaciones la alta tolerancia de las poblaciones pertenecientes a A. persimilis (A) y A. parthenogenetica (de la laguna de Pétrola) (P). La segunda parte, aborda el estudio comparado del proceso de acumulación de cadmio en individuos adultos de las diferentes poblaciones. Estos procesos han sido cuantificados aplicando un modelo toxicocinético con cinética de primer orden basado en un sistema de dos compartimentos, con el que se han conseguido ajustes relativamente buenos, teniendo en cuenta la complejidad de los procesos implicados. Hemos encontrado un comportamiento cadmio-regulador en Artemia, una eliminación relativamente rápida del metal, y un patrón de acumulación de cadmio bastante conservado en el género, siendo A. persimilis la única población que presenta un modelo diferente a las demás, caracterizado por una menor constante de acumulación y factor de bioconcentración (BCF). Por último en la tercera parte se analizó la presencia de metalotioneína (MT) en individuos adultos de Artemia y su incremento ante la exposición a cadmio, estudiando la influencia de la población y el sexo. Los mayores niveles de MT basal se encontraron en hembras de A. persimilis, que junto con las hembras de A. franciscana procedentes de San Francisco (SF) alcanzaron los mayores niveles de MT tras la exposición al metal. Las hembras de la población de A. salina procedentes de la laguna de La Mata (LMT(B)) fueron las que presentaron una mayor relación molar MT/Cd. La influencia del sexo fue muy coherente en todas las poblaciones estudiadas, siendo las hembras las que mayores contenido de cadmio y niveles de MT alcanzaron tras el tratamiento con metal. Estos resultado considerados en su conjunto demuestran una alta variabilidad fenotípica inter. e intraespecífica y de ahí la importancia de conservar la biodiversidad dentro del género que se ha visto disminuida en los últimos años por la inoculación artificial de especies alóctonas en lagunas que poseen poblaciones naturales y por el cambio climático que ha modificado la dinámica poblacional en salinas de interés comercial. / The aims of this work are to compare the response of the different species and populations in terms of cadmium sensitivity of nauplii, cadmium accumulation and elimination in adults and the basal content of metallothionein (MT) and the induction after cadmium exposure. The statistical procedure (Generalized Linear Models) used to assess the differences in cadmium tolerance of nauplii among populations has shown to be especially useful for this purpose. The results reveal besides a genetic basis for the different susceptibility to cadmium, that there are other factors such as reproductive mode, ploidy and habitat particularities that may account for the response of each of the populations. A first order bicompartimental toxicocinetic model was used in order to assess cadmium accumulation. We have found Artemia to be a cadmium-regulator organism. The consistency in the kinetic accumulation model indicates a well-conserved cadmium accumulation mechanism among studied species and populations. Artemia persimilis was the only one to show a statistically different model, which presents a lower cadmium accumulation rate and bioconcentration factor. Finally, the metallothionein content in adult individuals of Artemia showed a significant effect of cadmium exposure, sex and population origin. For all the studied populations females presented higher molar MT/Cd ratio. The conservation of all existing species and populations of Artemia will help maintain variability in the genus, which includes a broad spectrum of cadmium tolerance responses.

El trips occidental de las flores, Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae), es una de las plagas más importantes en los cultivos hortícolas de nuestro país, ya que se trata de uno de los principales vectores en la transmisión del virus del bronceado del tomate. De forma general, los medios químicos son los más ampliamente utilizados en su control, aunque presenta serias dificultades ya que se requieren aplicaciones reiteradas y, además, la gama de materias activas y formulados para el control de esta plaga es bastante reducida. En España se han documentado fallos en su control desde el año 2001, como consecuencia del desarrollo de resistencia a los insecticidas comúnmente empleados. En este contexto, en este trabajo se estudiaron los mecanismos responsables de la resistencia frente a los insecticidas en poblaciones españolas de F. occidentalis. Se evaluaron tanto mecanismos de destoxificación, como modificaciones de los puntos diana. En lo que respecta a los mecanismos de destoxificación se realizó un estudio cualitativo y cuantitativo de la actividad esterasa como posible mecanismo implicado en la resistencia en poblaciones procedentes de diferentes invernaderos comerciales y experimentales. Los resultados obtenidos indicaron que las esterasas se encontraban implicadas en la resistencia a los insecticidas acrinatrina y metiocarb en los estados iniciales de la resistencia. Concretamente, un grupo de tres isoenzimas, con baja movilidad electroforética y elevada intensidad en la tinción, se asoció con la resistencia a estos insecticidas. Además, se determinó que los insectos que presentaban dicho grupo de bandas mostraban, a su vez, una mayor actividad esterasa frente al sustrato &#61537;-naftil acetato, ratificando la relación entre tales bandas y la resistencia mostrada por los insectos. Por otro lado, se realizó un análisis in vitro e in vivo del efecto producido por diversos compuestos sinergistas sobre la actividad esterasa en poblaciones seleccionadas en el laboratorio, para poder determinar con mayor precisión lo que ocurre en el interior del insecto cuando estos compuestos son aplicados junto con los insecticidas, ya que la especificidad de los sinergistas es relativa y ha de ser estudiada para cada especie. Los resultados de estos estudios indicaron que los tres sinergistas utilizados, DEF, PBO y metiocarb, inhibían la actividad esterasa cuando eran aplicados in vitro, aunque en diferente grado, siendo el PBO considerablemente menos efectivo. Sin embargo, en las condiciones utilizadas en los estudios in vivo, tan solo el DEF resultó ser efectivo, y máxime al cabo de una hora tras su aplicación. Después de los sistemas de destoxificación, la modificación de las dianas es el segundo mecanismo más común como responsable de la resistencia. En este sentido, se llevó a cabo un estudio cualitativo y cuantitativo de la actividad colinesterasa, como posible diana modificada causante de la resistencia. El estudio se realizó en insectos recogidos en campo y seleccionados en laboratorio, ya que en ambos casos se encontraron poblaciones cuya resistencia no podía ser explicada únicamente por efecto de las enzimas de destoxificación. De los resultados obtenidos se cuestiona la presencia de la enzima butirilcolinesterasa en los trips (como se apunta en algunos trabajos) y, por otro lado, se sugiere que una modificación en las acetilcolinesterasas de F. occidentalis podría ser un mecanismo implicado en la resistencia frente al insecticida metiocarb. Del mismo modo, un aumento de la actividad de esta enzima también parecía conferir resistencia, aunque en mucho menor grado. / In this work we have studied the mechanisms responsible for resistance to insecticides in Spanish populations of Frankliniella occidentalis, one of the most important pest in vegetable crops in our country.Regarding to the mechanisms of detoxification, a study of the esterase activity was performed to evaluate its implication in the resistance. Our results indicated that a group of three isoenzymes esterase was involved in the early resistance to acrinathrin and methiocarb insecticides. Moreover, it was found that insects with this group of electrophoretic bands presented increased esterase activity to &#61537;-naphthyl acetate substrate, suggesting a relationship between such bands and resistance. Furthermore, it was performed an in vitro and in vivo analysis of the effect of various synergist compounds on the esterase activity. The three synergists used, namely DEF, PBO and methiocarb, inhibited the esterase activity when they were applied in vitro; the PBO was the less effective compound. However, only DEF proved to be effective in the in vivo studies, in particular one hour after its application. Besides detoxification systems, target sites modifications are also a common resistance mechanism. In this sense, we performed a qualitative and quantitative study of cholinesterase activity. Our findings questioned the presence of a butirilcholinesterase in thrips (as outlined by some other authors) and, on the other hand, suggested a change in acetylcholinesterase enzyme of F. occidentalis as a mechanism involved in resistance to methiocarb insecticide. Similarly, an increase in the acetylcholinesterase activity also appeared to confer resistance, although to less degree.

En ratolins existeixen certes feromones no volàtils i de caràcter sexual contingudes en la borumballa embrutada per mascles i que resulten innatament atractives per a les femelles. Els senyals volàtils emanats de la borumballa de mascles, en canvi, no resulten atractius en la primera experiència amb els mateixos, però poden adquirir propietats atractives de manera secundària després de l'exposició reiterada a aquests volàtils i als no volàtils innatament atractius de manera conjunta. Els dos primers objectius fonamentals d'aquesta tesi han estat estudiar si les feromones sexuals de mascle són detectades per l'òrgan vomeronasal, o si pel contrari, constitueixen un estímul olfactiu, i comprovar, igualment, si l'atracció induïda per volàtils depèn de la integritat del sistema vomeronasal.Per abordar aquests objectius es va comparar la preferència cap a senyals químics de mascle que mostren les femelles amb la funció vomeronasal interrompuda (mitjançant la lesió electrolítica del bulb olfactiu accessori), amb la què mostren les femelles amb la funció vomeronasal intacta (se'ls practicà una lesió simulada) en diferents situacions experimentals. Els resultats d'aquests experiments mostraren que les feromones contingudes en la borumballa embrutada per mascles intactes que resulten innatament atractives per a les femelles de ratolí són detectades per l'òrgan vomeronasal. També confirmaren que per tal que els volàtils puguen adquirir propietats atractives de manera secundària és necessària la seua associació amb un estímul detectat a través del sistema vomeronasal. A continuació comprovàrem si a més de ser innatament atractives, les feromones sexuals de mascle són reforçants per a les femelles, per a la qual cosa realitzàrem una sèrie d'experiments seguint un paradigma comportamental anomenat test d'adquisició de preferència de lloc, utilitzar per comprovar les propietats reforçants dels estímuls.Els resultats mostraren que les femelles de ratolí són capaces de detectar el gènere i l'estat de dominància dels conespecífics a través de senyals químics continguts en la borumballa embrutada pels mateixos. A més, revelaren que les feromones sexuals de mascle són reforçants per a les femelles de ratolí, però els senyals continguts en la borumballa embrutada per mascles castrat o altres femelles no.Per últim estudiàrem la via de transducció del reforç degut a feromones sexuals. Amb aquest objectiu, i donat que prèviament havíem comprovat que les feromones sexuals són detectades a través del sistema vomeronasal, analitzàrem l'expressió del proto-oncogen c-fos en distints nuclis vomeronasal (el nucli posteromedial de la amígdala cortical, els Illots de Calleja i l'Àrea de transició amígdalo-hipocàmpica). Aquesta expressió la comparàrem entre dos grups experimentals, un al què les femelles solament tenien accés a borumballa neta, i un altre en què les femelles eren exposades a borumballa de mascle. Els resultats indicaren que la via responsable de mitjançar aquest reforç no és la via dopaminèrgica tegment-estriatal clàssica, sinó que es la via que va des del nucli posteromedial de la amígdala cortical i l'àrea amígdalo-hipocàmpica als Illots de Calleja més ventromedials.En resum els resultats d'aquesta tesis mostren l'existència d'un nou estímul reforçant en ratolins, les feromones sexuals de mascle, que són detectades a través de l'òrgan vomeronasal. A més, hem vist que existeixen altres regions de l'estriat ventral, a part de les clàssiques, implicades en la codificació de les propietats reforçants dels estímuls naturals. / Male mice soiled bedding contains non volatile sexual pheromones that are innately attractive to females. Male volatile signals are, in contrast, not attractive to females in their very first contact with them, but can acquire secondary attractive properties by its association with the non volatile and innately attractive signals. In this work we analysed whether male sexual pheromones are detected through the accessory olfactory system, and if the association between non-volatiles and volatile signals is also dependent on the integrity of vomeronasal system. To do so, we carried out a battery of experiments in a group of females with a lesion in their accessory olfactory bulb (AOB) comparing their behaviour with that from another group of animals with a sham lesion in their AOB. In addition, we also analysed if male sexual pheromones are rewarding to female mice, using a behavioural paradigm named place preference test. Finally, we studied which would be the neural system that mediates these reinforcing properties. To do so, we compared c-fos expression in different vomeronasal nuclei in animals exposed to male-soiled bedding and animals exposed to clean bedding.The results of our experiments show that male sexual pheromones are detected through the vomeronasal organ and that the acquisition of secondary attractive properties by male volatile signals depends on its association with non volatiles signals also detected through the vomeronasal system. Furthermore we have demonstrated that male sexual pheromones have reinforcing properties to female mice, ant that the neural system that mediates these reinforcing properties is not the classical dopaminergic tegmento-estriatal projection, but the projections from some regions of the posteromedial cortical nucleus of the amygdala and the amygdalo-hypocampal area to the most ventromedial Islands of Calleja.The results from these experiments show the existence of a new reinforcing stimulus in mice, the sexual pheromones. In addition, these pheromones are detected through the vomeronasal organ. Moreover, we have shown that there are more regions a part from the classical ones in ventral striatum involved in mediating reinforcing properties of natural stimuli.

El ozono troposférico es el contaminante atmosférico más fitotóxico conocido. El ozono provoca estrés oxidativo en las plantas y sus concentraciones actuales causan importantes disminuciones del rendimiento agrícola en cultivos sensibles. El objetivo general de esta tesis doctoral es el estudio de los efectos de una exposición crónica a ozono durante todo el período de cultivo en plantas de patata (Solanum tuberosum L. cv. Agria). La metodología de cultivo empleada han sido las cámaras de techo abierto (OTC), realizando tres tratamientos: aire filtrado de ozono (CF), aire con concentraciones ambientales de ozono (NF) y aire ambiental enriquecido con ozono (NF+). El primer objetivo ha sido el estudio del efecto del ozono sobre el rendimiento agrícola: se ha encontrado que el tratamiento NF provoca una disminución de un 9-24 %, y el tratamiento NF+ una disminución de un 25-73 %; además existe una alta correlación entre la disminución del rendimiento agrícola y los índices de exposición acumulada a ozono AOT40 y AOT00. En segundo lugar se ha aplicado difenilamina y citrulina a cultivos en campo para evaluar su acción protectora frente al ozono ambiental. Con ambos compuestos químicos, especialmente con la citrulina, se ha encontrado un aumento en el rendimiento agrícola de las patatas comerciales; el mecanismo de acción de ambos agentes parece estar basado en la disminución del estrés oxidativo. El tercer objetivo ha consistido en el estudio de la respuesta del antioxidante glutatión a la exposición crónica a ozono. Como resultado, la concentración de GSSG y, en mayor proporción, la de GSH, han aumentado, de manera que las plantas aumentan la capacidad amortiguadora del glutatión frente al estrés oxidativo; una de las causas del aumento de la concentración de GSH es una mayor síntesis regulada por la expresión de la enzima &#947;-GCS. El cuarto objetivo ha sido la cuantificación de radicales libres formados por la exposición a ozono mediante espectroscopía ESR en banda X y banda Q. Se ha detectado una señal perteneciente a uno o varios radicales libres permanentes. Además, se ha desarrollado un método de análisis de imagen para cuantificar el área de hoja con síntomas visibles inducidos por ozono. Las técnicas empleadas han permitido encontrar una estrecha relación entre la intensidad de la señal del(de los) radical(es) libre(s) y el porcentaje de superficie foliar con síntomas visibles por ozono. Por último, se ha realizado el estudio de las alteraciones histológicas producidas por la exposición crónica a ozono, así como la detección histoquímica de las especies reactivas del oxígeno radical superóxido y peróxido de hidrógeno. El ozono provoca una degeneración de la lámina media y de la pared celular, además de una pérdida de turgencia de la vacuola, dando como resultado una pérdida de contacto entre las células y finalmente el colapso celular; las células más afectadas han sido las del parénquima lagunar próximas a los estomas. Se ha encontrado un taponamiento del floema debido a la acumulación de calosa, y una acumulación de almidón en las células dañadas del parénquima, fenómenos que podrían ser la principal causa de la disminución del rendimiento agrícola. El radical superóxido se ha detectado principalmente en el parénquima lagunar, concretamente en la pared y/o membrana celular y en membranas intracelulares como el tonoplasto, membrana de los cloroplastos y grana. El peróxido de hidrógeno se ha detectado principalmente en la pared celular, y en los peroxisomas, que se revelan como una fuente importante de esta especie reactiva del oxígeno en condiciones de estrés por ozono; se ha encontrado peróxido de hidrógeno de manera abundante en las paredes del floema, y se discute una posible relación con la acumulación de calosa. / Tropospheric ozone is considered the most phytotoxic air pollutant. The general aim of this thesis is to study the effects of a chronic ozone exposure during the entire growing season on potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Agria). Plants were grown in open-top chambers (OTC), and treatments consisted of charcoal-filtered air (CF), ambient air (NF) and ambient air enriched with ozone (NF+). The first aim was to study the effects of ozone on crop yield: the result was a 9-24 % decrease, and a 25-73 % decrease in NF and NF+ treatments, respectively. A strong correlation was found between yield decrease and accumulated ozone exposure indexes AOT40 and AOT00. Secondly, diphenylamine and citrulline were applied to crops in field conditions to test their protective role against ambient ozone. Both chemical compounds, specially citrulline, caused a yield increase in commercial tubers; these compounds seemed to alleviate oxidative stress. Furthermore, glutathione response to chronic ozone exposure was studied. There was an increase in GSSG and GSH concentrations. An enhanced &#947;-GCS enzyme expression was observed, being a cause for the increase in GSH concentration. Another aim was the quantification of free radicals generated by ozone exposure employing X- and Q-band ESR spectroscopy. A signal belonging to one or several permanent free radicals was detected. Also, an image analysis method was developed to quantify leaf area exhibiting visible ozone symptoms. A strong relationship between free radical(s) signal intensity and percentage of visible ozone-induced damage was found. Finally, research into ozone stress effects on foliar histology was conducted. Ozone caused cell wall degeneration and loss of vacuolar turgence, resulting in the loss of contact between cells and cell collapse. Phloem was blocked by callose, and starch accumulated in injured cells of parenchyma. Superoxide radical was mainly detected in the spongy parenchyma, specifically in the cell wall and/or plasmalemma, tonoplast, chloroplast membrane and grana. Hydrogen peroxide was principally observed in the cell wall, and in peroxisomes, which became an important source of this reactive oxygen species under ozone stress; hydrogen peroxide was abundant in phloem walls, and a possible relationship with callose accumulation is discussed.