Tesis por compendio de publicaciones / El objetivo fundamental de esta tesis fue ahondar en los procesos de evolución molecular de algunas de las distintas familias de ADN repetido que se usan de forma rutinaria en los trabajos de taxonomía, filogeografía y filogenética de plantas, para con herramientas de biología molecular (PCR, clonación, secuenciación…) y citogenética molecular (FISH) poner a prueba las teorías generalmente aceptadas sobre los procesos de variación y homogeneización de tales secuencias repetidas. En el primer trabajo de esta tesis como compendio de artículos, utilizando la secuencia de ADN satélite E180 previamente descrita para el género Medicago, diseñamos primers específicos para (1) evaluar la robustez y sensibilidad tanto de la PCR como del FISH para detectar familias de ADN repetido, (2) obtener nuevos datos sobre la evolución genómica (cariotípica) del género Medicago usando ADNsat como marcador, y (3) evaluar el rastro filogenético dejado por una familia de ADNsat en un género tan particular como Medicago, donde se tiene la evidencia de que complejos patrones de hibridación han jugado un papel fundamental en su historia evolutiva. Nuestros resultados demuestran que la detección tanto por técnicas moleculares como citogenéticas de la familia repetida E180 es altamente reproducible a través del género, y que los patrones cromosómicos sirvieron para diferenciar complejos de especies estrechamente relacionados (son taxón-específicos). El segundo trabajo de esta tesis vino motivado por las continuas referencias bibliográficas que usaban las secuencias de la familia de ADN ribosomal nuclear 5S como marcador genético en la práctica de concatenar partes diferentes de dos genes seguidos para usarlas como pertenecientes a un mismo gen, en la creencia de que la homogeneización de secuencia dentro de la familia era completa. En consecuencia comparamos la integridad de la secuencia (longitud, motivos universales conservados y estructura secundaria) y el comportamiento filogenético de zonas 5S codificantes completas en comparación con las quiméricas (concatenadas) de un grupo de genes de ADNrn 5S obtenido de varias especies estrechamente relacionadas. Los resultados que se desprenden sugieren que la homogeneización de secuencias no está operando, ni siquiera dentro de un mismo tándem, en la región codificante del ADNrn 5S, la cual había sido tradicionalmente considerada como un ejemplo de secuencia altamente conservada. De esta manera, la generalizada práctica de concatenar secuencias de genes 5S puede incrementar la diversidad haplotípica, distorsionando los patrones de evolución génica y conduciendo a relaciones haplotípicas incorrectas en algunas reconstrucciones evolutivas. En el tercer y último trabajo de la tesis, estudiamos la secuencia del espaciador intergénico (IGS) del ADNr 45S de Ginkgo biloba y Medicago arborea respectivamente. En el caso de G. biloba, y basándonos en trabajos previos, intentamos discernir si las familias de ADNrn 45S y 5S estaban o no combinadas en el mismo locus. Usando técnicas de citogenética molecular y secuenciación de ADN mostramos que la única organización existente en esta especie es la asociada (primera vez que se demuestra en gimnospermas), donde el gen 5S aparece insertado dentro del IGS 45S.

OBJETIVOS: El objetivo de esta tesis es mejorar la precisión en el diagnóstico de las posibles alteraciones del ritmo circadiano de la presión arterial evaluada de forma ambulatoria (MAPA) y/o detectar otras patologías del sistema cardiovascular como la hipertensión mediante el registro combinado de termometría de la piel de la muñeca y de actimetría. Con este fin se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar simultáneamente los patrones de temperatura, posición y actividad de sujetos normotensos, analizando las relaciones de la presión arterial con el resto de variables. 2. Determinar simultáneamente los patrones de temperatura, posición y actividad de sujetos hipertensos analizando las relaciones entre la presión arterial y el resto de variables. 3. Evaluar el efecto de la administración de melatonina en los patrones de presión arterial, y el comportamiento de los ritmos de temperatura, posición y actividad de sujetos normotensos frente a la administración de placebo. METODOLOGÍA En esta tesis, se evaluó simultáneamente el ritmo de presión arterial, temperatura periférica, actividad motora y posición corporal. El ritmo circadiano de presión arterial se determinó mediante una MAPA con un holter de PA (Spacelabs®, USA), durante 24 horas. La monitorización ambulatoria de PA y FC se realizó siguiendo la práctica habitual con una medida cada 20 minutos durante el periodo de actividad (de 08:00 h a 23:00) y cada 40 minutos durante el periodo de descanso (de 23:00 h a 08:00 h). El ritmo de temperatura se evaluó mediante un sensor de temperatura (iButton, Maxim, USA) incorporado a una muñequera de modo que la superficie del sensor quedara en contacto con la arteria radial de la muñeca de la mano no dominante. Los ritmos de actividad motora y posición corporal se evaluaron mediante un actímetro (Hobo®, USA) colocado en el brazo no dominante utilizando un brazalete deportivo. De la información proporcionada por el actímetro, se definieron 2 variables: actividad motora, expresada como grados de cambio de posición por minuto y posición corporal, definida como el ángulo entre el eje X y el plano horizontal. Procesamiento de los datos: Cada variable se normalizó entre 0 y 1 después de haber eliminado los artefactos mediante inspección visual de los datos. Además, los datos de temperatura se invirtieron de modo que los valores máximos de todas las variables coincidieran en el mismo momento. Después, calculamos la media de las variables normalizadas para cada sujeto obteniendo la variable TAP cuyos valores varían entre 0 (para periodos de reposo) y 1 (para periodos activos). CONCLUSIÓN GENERAL: Es necesaria la incorporación de la variable posición por ser mejor determinante que la actividad motora para una mejora en la precisión del diagnóstico de posibles alteraciones del ritmo circadiano de la presión arterial. A falta de analizar grupos más numerosos de población, los índices no paramétricos de la presión arterial podrían ser también usados como diagnóstico. Además, la temperatura periférica y su ritmo circadiano pueden ser usados como cribado para la detección de patrones anómalos de presión arterial y patologías del sistema cardiovascular como la hipertensión. / OBJECTIVES: The aim of this thesis was to improve the diagnostic accuracy of the possible disturbances of circadian rhythm of blood pressure evaluated by ABPM (Ambulatory Blood Pressure Monitoring) and/or to detect other diseases of the cardiovascular system such as hypertension by Thermometry and Actigraphy. To this end the following objectives were proposed: 1. To determine the relationship between arterial blood pressure and the rhythms of skin temperature, body position and activity in normotensive subjects. 2. To determine temperature, position, activity and blood pressure patterns in hypertensive subjects analyzing the relationship between blood pressure and the other variables simultaneously. 3. To assess the effect of melatonin administration on blood pressure, temperature, activity and position patterns versus placebo treatment. METHODOLOGY In this thesis, the simultaneous monitoring of blood pressure, skin temperature, body position and motor activity was evaluated. Circadian rhythm of blood pressure was measured by ABPM with a holter (Spacelabs®, USA) during 24 hours. Ambulatory BP and HR monitoring was performed following the usual practice with a measurement every 20 minutes during the activity period (08:00 to 23:00) and every 40 minutes during the rest period (from 23:00 to 08 : 00 h ) . Temperature was assessed using a temperature sensor (Thermochron®, Maxim, USA) sewn into a wristband so that the surface of the sensor remains in contact with the radial artery in the wrist of the nondominant hand. The rhythms of motor activity and body position were evaluated by an actimeter (Hobo®, USA) placed in the nondominant arm by a sports armband. Motor activity was expressed as degrees of change of position and body position was defined as the angle between the X axis and the horizontal plane. Data processing: Each variable was normalized between 0 and 1 after removing the artefacts by visual inspection of the data. Moreover, the temperature data is reversed so that the maximum values of all variables at the same time coincide. Next, we calculate the average of the standardized variables for each subject TAP obtaining the variable whose values range from 0 (for periods of rest) and 1 (for active periods). The measurements were performed in three groups of patients: normotensive, hypertensive and normotensive differentiating week with melatonin and placebo. GENERAL CONCLUSION: body position can be considered as a better determinant than motor activity on blood pressure, thus this variable should be incorporated to improve the accuracy of diagnosis of possible disturbances of circadian rhythm of blood pressure.. Although it is necessary to confirm our results in larger populations, nonparametric indices of blood pressure could also be used to define the circadian patterns of blood pressure. Furthermore, the peripheral temperature circadian rhythm can be used as screening for detecting abnormal patterns of blood pressure and disorders of the cardiovascular system such as hypertension.

Tesis por compendio de publicaciones / La contaminación difusa procedente de la agricultura contribuye significativamente al incremento de la concentración de nitrógeno (N) y fósforo (P) en los ecosistemas acuáticos continentales, siendo éste un grave problema en la gestión del agua. En las regiones mediterráneas más áridas, como el sureste ibérico, este problema se ve agravado debido a los escasos caudales de los cursos de agua, que disminuyen su capacidad de dilución de solutos y los hace especialmente sensibles a la eutrofización. Está globalmente reconocido que los humedales reducen el flujo de nutrientes desde los ecosistemas terrestres a los acuáticos, siendo así utilizados en el tratamiento de la contaminación difusa en zonas agrícolas, urbanas e incluso mineras. Sin embargo, la diversidad de procesos implicados en la retención de nutrientes determina que la eficiencia de retención de los humedales pueda variar en función del clima y la hidrología. En este sentido, la funcionalidad de los humedales mediterráneos del sureste ibérico para la retención de nutrientes en paisajes agrícolas es en gran medida desconocida. En este contexto, en la presente tesis se plantean cuatro objetivos generales: 1. Conocer la eficiencia de retención de N y P de los humedales asociados a sistemas de drenaje, así como su variación temporal en un ciclo hidrológico. 2. Conocer si existen diferencias en la retención de N y P entre el compartimento superficial y subsuperficial de estos humedales. 3 Analizar los factores ambientales que afectan a la retención de N y P. 4. Analizar la variabilidad espacial, a lo largo del eje longitudinal de los humedales, de la eficiencia de retención de N y P en ambos compartimentos. En base a estos objetivos, se seleccionaron 2 humedales (Taray y Parra) asociados a sistemas de drenaje de cuencas agrícolas del sureste ibérico. En ambos, se tomaron mensualmente muestras de agua superficial y subsuperficial a lo largo de un ciclo hidrológico y se midió la concentración de las diferentes fracciones de N y P. Además, se midieron distintas variables físico-químicas e hidrológicas. Tras ello, se analizó la variabilidad espacial y temporal de la retención de N y P en ambos compartimentos, y con la aplicación de diversos test estadísticos, se llegó a las siguientes conclusiones generales: 1. Los humedales mostraron altas eficiencias de retención de N en ambos compartimentos y frente a elevadas concentraciones de N. El clima cálido parece constituir una ventaja para la retención de N en los humedales mediterráneos. 2. El NO3- fue la fracción mayoritaria del N y mostró los mayores porcentajes de retención. Su variabilidad temporal fue menor en el c. subsuperficial. 3. Las mayores eficiencias de retención de NO3- se registraron en verano. 4. Las eficiencias de retención de NH4+ y de NOT fueron muy inferiores y más variables en el tiempo que las de NO3-. Ningún factor ambiental de los estudiados explicó su variabilidad temporal. 5. El c. subsuperficial mostró una mayor eficiencia de retención de NO3- que el superficial, pero el escaso caudal subsuperficial de los humedales determinó que la carga de NO3- retirada en este compartimento fuese muy inferior a la del superficial. 6. A escala de humedal, el Taray retuvo P mientras la Parra lo exportó. 7. La eficiencia de retención de N y P en los humedales estudiados no mostró un carácter lineal, es decir, el incremento en la longitud del humedal, no generó un incremento proporcional en la retención de nutrientes. 8. La mayor eficiencia de retención de NT y NO3- (99.9% del NT) se observó en los primeros 100 m de humedal. La retención de NH4+ en el c. superficial fue mayor en el último tramo del humedal, donde las altas concentraciones de NH4+ pudieron estimular su asimilación microbiológica. La retención de NOT, PT y PRS no mostró ningún patrón de variación espacial estadísticamente significativo entre tramos. 9. La protección y/o restauración de los humedales asociados a sistemas de drenaje podría ser una herramienta útil para controlar la contaminación difusa en cuencas agrícolas. / Nonpoint source pollution from agriculture areas contributes significantly to increase nitrogen (N) and phosphorus (P) concentrations in freshwater ecosystems, being this a major problem in water management. In the most arid areas of Mediterranean region, such as the Iberian southeast, this problem is specially accused because the majority of aquatic ecosystems have low discharges that diminish their solute dilution capacity, and this make them especially sensitive to eutrophication It is globally recognised that wetlands reduce the flow of nutrients from terrestrial to aquatic ecosystems, being used in the diffuse pollution treatment in agricultural, urban and even mining zones. However, the diversity of processes involved in nutrient retention determines that retention efficiency in wetlands can vary in function of climatic conditions and hydrological regimes. In this sense, the functionality of Mediterranean wetlands, in the Iberian southeast, for nutrient retention in agricultural landscapes is largely unknown. In this context, in the present thesis four general objectives were established: 1. To know the N and P retention efficiency of wetlands associated to drainage systems, as well as, its temporal variability over a hydrological cycle. 2. To know if exist differences in the N and P retention efficiency between the surface and subsurface compartments of these wetlands. 3. Analyse the environmental factors that affect to N and P retention. 4. Analyse the spatial variability, along the longitudinal axis of wetlands, of the N and P retention efficiency in both compartments. Basing on these objectives, we selected two wetlands associated to drainage systems of agricultural catchments in the Iberian southeast (Taray and Parra). In both wetlands, surface and subsurface water samples were collected once a month during a hydrological period and the concentration of the different N and P forms were analysed. In addition, different physicochemical and hydrological variables were measured. Thus, the spatial and temporal variability for N and P retention efficiency was analysed in both wetlands components and next conclusions were established: 1. The wetlands showed high N removal efficiencies at both surface and subsurface components, even for high inflow N concentrations. The warm temperature in the Mediterranean wetlands can be an advantage for N removal. 2. NO3- was the main N form and showed the highest retention percentages. Its temporal variability was lower in the subsurface component. 3. The highest NO3- retention efficiency was observed in summer. 4. The NH4+ and TON retention efficiencies were much lower and more variable through the study period than the NO3- efficiency. The studied environmental factors did not explain their temporal variability. 5. The subsurface component showed a higher NO3- retention efficiency than the surface component, but the lower subsurface discharge defined that the NO3- load removed at the subsurface was much lower than at the surface. 6. At the wetland scale, P was retained in Taray wetland but it was exported in Parra wetland. 7. The N and P retention efficiency in the study wetlands did not show a linear nature, that is, the increase in the wetland length did not cause a proportional increase in the nutrient retention. 8. The highest TN and NO3- (99.9% of TN) removal within wetlands was observed in the first 100 m. The NH4+ retention efficiency at the wetland surface was higher in the last wetland reach, where the high inflow NH4+ concentrations could stimulate the microbial immobilization. TON, TP and SRP retention efficiencies did not show any consistent spatial pattern. 9. The conservation and/or restoration of wetlands associated to drainage systems could be an appropriate tool for the control of non-point pollution in agricultural catchments.

La raza bovina Murciano Levantina (ML) se utilizaba para labores agrícolas por su aptitud de trabajo. Hoy se encuentra en peligro de extinción por pérdida de utilidad ante la aparición de maquinaria agrícola. Los escasos criadores que la mantienen, no se dedican a la producción de ganado bovino, siendo los aspectos del folclore regional los que la hacen acorde con su aptitud de tracción. El Banco de Germoplasma de la raza se inició en el año 2000 y en la actualidad hay 7280 dosis seminales congeladas y almacenadas en N2L, pertenecientes a 13 toros ML, todos ellos muy emparentados. Con estas dosis se atiende tanto a la conservación in vivo, por cesión a los ganaderos y obtención de nuevos reproductores, como a la conservación ex situ in vitro para la futura reconstrucción de la raza en caso necesario; aunque el número de toros es insuficiente, puesto que se requiere semen de 25 toros conservados in vitro. El almacenamiento de dosis seminales es costoso por el aumento continuo de los precios del N2L y actualmente existen métodos para disminuir las necesidades de gametos masculinos; el sexado espermático disminuiría a la mitad estos gastos, aunque posteriormente sería necesaria la recongelación de los gametos. Los objetivos del presente trabajo son conseguir eficacia y eficiencia en el semen recongelado, disminuyendo el número de dosis seminales almacenadas, que serían descongeladas del Banco de Germoplasma, y a las que se les aplicaría un tratamiento similar al requerido por la tecnología de sexado espermático; siendo un objetivo derivado el estudio con técnicas convencionales del semen recongelado y relacionar los parámetros de calidad seminal del semen recongelado con aquellos toros que alcancen mejores valores de fertilidad con semen solamente congelado. Otro objetivo es poner a punto una técnica de recongelación que permita almacenar dosis seminales de forma más eficiente. En este trabajo se han utilizado los datos procesados de dosis seminales de 12 toros de esta raza y los espermatozoides congelados pertenecientes a 6 de esos toros. Los métodos de estudio del eyaculado y de las dosis seminales son los convencionales para la especie bovina. Las técnicas de congelación y recongelación utilizadas son las mismas que para el Banco de Germoplasma. En las experiencias de aplicación de frío, el semen descongelado fue sometido a una recongelación después de haber sufrido un tratamiento (CT), o bien recongelado sin tratamiento (ST). Para conocer el valor de los parámetros estudiados han sido utilizadas técnicas de microscopía óptica y fluorescencia, resistencia en baño de agua termostático, tinciones de E-N, IP, lectinas, azul de toluidina e IA con semen redescongelado a siete novillas de la raza Frisona. En el ganado Murciano Levantino existe variabilidad en los valores promedio de calidad seminal entre los sementales, aunque esto no es debido a la edad. Además, no existen diferencias reseñables en los valores promedio de los parámetros de semen procedente del primer y segundo eyaculado de cada toro. El análisis de los resultados permite conocer el daño en los espermatozoides durante la recongelación, siendo la calidad seminal en el semen descongelado superior a la del redescongelado; con gran variabilidad entre toros. Un semental presentó mejores valores para los parámetros tras la congelación y redescongelación, aunque en algún parámetro no hubo diferencias en ningún toro. Las anomalías espermáticas frecuentemente encontradas fueron las “colas en látigo”, pero ligeramente inferiores en el semen recongelado CT. La inseminación de 7 novillas Frisonas proporcionó un porcentaje de fertilidad del semen recongelado ST del 57’1%, lo que concluye que la recongelación espermática se puede utilizar como técnica de predicción de la fertilidad y ser utilizada para la conservación in vitro. / The Murciano Levantina (ML) bovine breed used to be employed for farming purposes because of their work aptitude. Nowadays, it is an endangered breed because it is no longer used for the mentioned purposes due to the arrival of technology and farming equipment. In addition, there are few ML bovine breeders and this is not their main occupation. This breed is mainly used during popular celebrations and festivals for transport. The Germplasm Bank breed has been carried out since 2000 and currently, there are 7280 seminal doses of 13 ML bulls with high consanguinity among them. With these doses it is possible to carry out both in vivo conservation, cession to the breeders and new breeding males; and ex situ in vitro conservation for the future reconstruction of the race -if necessary. Although the number of seminal doses may seem enough for the recovery of the breed in the future, the number of bulls is not sufficient, because the in vitro cryopreservation of spermatozoa belonging to, at least, 25 bulls is necessary. The storage of seminal doses implies more maintenance costs because of the continued increase in prices; currently there are some methods to reduce the male gametes necessities; the sexing sperm could reduce in the middle these expenses, although, afterwards could be necessary the gametes refreezing. The objectives of the present work are to obtain effectiveness and efficiency in refrozen semen, diminishing the number of frozen seminal doses stored at the Germplasm Bank, which would receive a treatment similar to that required by sexing technologies; being a derivative objective to study the usage of conventional technologies of refrozen semen, connecting the refrozen seminal quality parameters with the best fertility parameters in frozen semen. Another goal is the development of a refreezing technique that allows the storage of seminal doses more efficiently. In this work we have used the processed data of seminal doses belonging to 12 bulls of that breed and the frozen spermatozoa of 6 of those bulls. The methods to study the ejaculates and seminal doses are the conventional ones employed in bovine species. The freezing and refreezing techniques used are the same than those used for the Germplasm Bank. In the experiences with the application of cold, the thawed semen was refrozen after undergoing a certain treatment (CT), or it was refrozen without any treatment (ST). In order to know the value of the studied parameters the following methods have been used: the optical and fluorescent microscopy techniques, resistance in thermostatic water bath study, eosine-nigrosine, PI, lectins (PNA) and toluidine blue stainings and artificial insemination using refrozen semen in 7 Frisone breed heifers. In the ML livestock there is variability in the seminal quality average values among the studs, although this is not due to the bulls’ age. Additionally, there are not important differences regarding the average values between the first and the second ejaculation in each bull. Statistical results permit to know the damage in spermatozoa during recryopreservation, and it was observed that the seminal quality is higher in frozen semen than in refrozen semen, with a high variability among bulls. Among the bulls, one of them presented the best results in each parameter studied after cryopreservation and recryopreservation, although there were no differences among the bulls regarding some parameters. The most frequent sperm abnormalities were the “tails in whip”, but they were slightly lower in CT refrozen semen. The artificial insemination of 7 Frisone heifers showed a percentage of fertility with ST refrozen semen of 57’1%. These results conclude that the re-frozen semen can be used as a predictive technique of fertility, and thus, it can be used for the in vitro conservation of the studied bovine breed.