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Assez rapidement après son apparition à la fin des années 1980, la Microscopie à Force Atomique (AFM) a démontré des perspectives prometteuses d’applications biomédicales. À l’heure actuelle, elle permet l’étude d’échantillons biologiques allant de la molécule unique à la cellule vivante proche des conditions physiologiques. Bien qu’étant applicable aux cellules eucaryotes et procaryotes, elle est entravée par son faible débit. Alors qu’elle peut être fortement automatisée sur certains échantillons bien caractérisés en air, l’automatisation de l’AFM en liquide reste rare, en particulier en multi-échantillon. Lors de ce projet doctoral, une approche automatisée a été développée pour l’étude des cellules en milieu liquide. Après une introduction du système et des développements nécessaires, nous démontrons l’approche sur des bactéries fixées et vivantes, ainsi que sur des cellules épithéliales. L’utilisation d’automatisation multi-échantillon permet d’augmenter le nombre d’échantillons rassemblés tout en limitant les interactions avec l’utilisateur. Enfin, les développements ultérieurs sont discutés pour aller vers un système automatisé à plus grande échelle sur échantillons vivants. / Soon after its development in the late 1980s, atomic force microscopy (AFM) has shown promising applications in the biomedical field. It now allows investigating biological samples from single molecules to living cells under conditions close to physiological. Despite its applicability to both eukaryotic and prokaryotic cells, it is hampered by its low throughput. While heavily automated on some well-characterized samples in air, AFM automation in fluid is very scarce, especially at the multi-sample level. During this doctoral project, an automated approach was developed in fluid, on cells. After introducing the system and the developments required, we demonstrate the approach on fixed and living bacteria as well as on epithelial cells. The usage of multi-sample automation allows gathering a greater number of samples with limited user interaction. Finally, further developments are discussed to lead the path toward higher-scale AFM automation of live samples.

Holography has the ability to render three-dimensional information of a recorded scene by capturing both the amplitude and phase of light incident on the recording medium. The application of digital camera technology and high-speed computing means digital holograms can be analysed numerically and novel applications can be found for this technology. This thesis explores the potential for both inline and off-axis digital holographic microscopy to study the three-dimensional swimming behaviour of bacteria. A high-magnification (225x) digital holographic microscope was designed and constructed with the ability to switch easily between inline and off-axis imaging modalities. Hardware aspects, in particular the illumination source, the choice of camera and data transfer rates, were considered. Novel strategies for off-axis holography combining dark field microscopy were designed and implemented. The localisation accuracy of the inline imaging modality was assessed by studying samples of polystyrene microspheres. The microscope is sensitive to stage drift on the order of angstroms per second and can successfully localise microspheres in dilute suspensions at least 100μm from the objective specimen plane. As a simple test of the capabilities of the microscope, the diffusion coefficient of a 0.5μm microsphere was found to be isotropic and consistent with the theoretical value. Amplitude and phase image reconstructions from the off-axis modality are demonstrated. High-magnification dark field off-axis holographic microscopy is shown to be superior to inline microscopy in localising 100nm gold nanoparticles. An artifact from our method of dark-field imaging, however, restricts the depth range to 15μm. A lower-magnification (45x) configuration of the microscope was used to study the 3D swimming behaviour of wild type Escherichia coli as a qualitative demonstration of the potential for this instrument in microbiological applications.

La microscopie par cohérence optique (OCM) est une technique d'imagerie tomographique basée sur l'interférométrie en lumière blanche permettant d'imager les milieux biologiques à l'échelle microscopique. L'OCM est une méthode particulièrement adaptée à l'imagerie dermatologique, en particulier pour le diagnostic du cancer de la peau, car elle permet d'obtenir des images similaires aux images histologiques sans nécessiter d'effectuer de biopsie.Ces travaux de thèse portent sur le développement de la microscopie par cohérence optique pour l'imagerie de la peau, dans le but de fournir au dermatologue un outil d'imagerie compact, adapté à l'imagerie dermatologique in vivo, et permettant d'obtenir des images à la fois structurelles et fonctionnelles.Un dispositif de microscopie par cohérence optique plein champ (FF-OCM) compact, à éclairage par LED blanche, a tout d'abord été développé, permettant d'obtenir des images tomographiques à très haute résolution (0.7 μm × 1.8 μm) jusqu’à ∼200 μm de profondeur dans la peau. En utilisant une LED de haute puissance, des images de peau in vivo ont pu être obtenues.A partir de ce dispositif de FF-OCM, des méthodes d'imagerie fonctionnelle permettant de cartographier les écoulements sanguins (angiographie) ont été mises en oeuvre. Quatre méthodes, basées sur une analyse du signal interférométrique (temporelle ou fréquentielle), d'images de phase ou d'images d'amplitude ont permis d'imager de l'intralipide s'écoulant dans un modèle de capillaire sanguin.L'imagerie fonctionnelle polarimétrique a aussi été explorée en FF-OCM. Une optimisation du contraste des images polarimétriques a été obtenue en modifiant les composants polarisants d'un montage conventionnel de FF-OCM polarimétrique en fonction de l'échantillon imagé. Cette méthode a été testée sur un échantillon polarisant simple.Finalement, une nouvelle méthode d'OCM, la microscopie par cohérence optique confocale à éclairage « ligne » (LC-OCM) a été étudiée, dans le but de développer un système permettant d'imager la peau in vivo, avec une plus grande profondeur de pénétration dans les tissus que la FF-OCM. Ce système, combinant un filtrage interférométrique et un filtrage confocal, a permis d'obtenir des images de peau in vivo en coupe verticale et en coupe en face, avec une résolution spatiale similaire à celle de la FF-OCM, mais à une profondeur supérieure atteignant 300 μm. / Optical coherence microscopy (OCM) is a technique for tomographic imaging based on white light interferometry, making it possible to image biological media with micrometer-scale spatial resolution. OCM is particularly well-suited to dermatological imaging, especially skin cancer diagnosis, since it provides images that are similar to histological images without the need for biopsy.This PhD thesis focuses on the development of OCM for skin imaging, with the aim of providing a compact, in vivo imaging tool for the dermatologist, capable of acquiring structural and functional images of the skin.A compact, full-field OCM (FF-OCM) system illuminated by a white LED was first developed, making it possible to obtain tomographic images at an ultra-high resolution (0.7 μm × 1.8 μm), up to ∼200 μm in depth within the skin. Using a high power LED, in vivo skin images could be obtained.Using this FF-OCM setup, functional imaging methods for blood flow mapping (angiography) were implemented. Four methods, based on temporal or frequency analysis of the interferometric signal, phase images or amplitude images, have been shown to be able to image intralipid flow within a model blood capillary.Functional polarimetric imaging has also been explored in FF-OCM. Contrast optimization in polarimetric images has been obtained by modifying the polarizing components of the conventional polarization sensitive FF-OCM setup depending on the sample to be imaged. This method has been tested on a simple polarizing sample.Finally, a new OCM method, line-field confocal OCM (LC-OCM), has been studied. The goal here was to develop a system capable of imaging the skin in vivo, with a tissue penetration depth greater than what is possible for FF-OCM. This system, which combines interferometric filtering and confocal filtering, makes it possible to obtain in vivo skin images in vertical and en face slices, with a spatial resolution similar to that of FF-OCM, but with a greater penetration depth of 300 μm.

La microscopie non linéaire a transformé le domaine de la neurobiologie depuis les années 1990, en permettant d'acquérir des images tridimensionnelles de tissus épais avec une résolution subcellulaire. Cependant, les profondeurs d'imagerie accessibles sont limitées à quelques centaines de micromètres dans des tissus diffusants tels que le tissu cérébral. Au cours des dernières années, plusieurs stratégies ont été développées pour dépasser cette limitation de profondeur et accéder à de plus grands volumes de tissu. Ces avancées récentes ont jusqu'à présent été limitées en terme de modes de contrastes accessibles, et ont souvent été réduites à des approches monochromes. Ce travail de thèse vise à développer des techniques d'imagerie non linéaires de grands volumes et de grande profondeur dotées de diverses possibilités de contrastes, indispensables pour l'étude de tissus complexes tels que le tissu cérébral. Dans un premier chapitre, nous présentons les difficultés associées à l'imagerie de grand volume de tissu cérébral, avec une emphase particulière sur les puissantes stratégies de marquages génétiques dont l'usage à jusqu'à présent été limité à des faibles étendues. Ensuite, nous introduisons la microscopie Chrom-SMP (chromatic serial multiphoton), une méthode développée au cours de cette thèse et consistant à combiner l’excitation deux-photon multicouleurs par mélange de fréquences avec une technique d'histologie automatisée (i.e découpe sériée) pour accéder à plusieurs contrastes non linéaires à travers de grands volumes de tissus ex vivo, allant de plusieurs mm3 à des cerveaux entiers, avec une résolution micrométrique et un coalignement intrinsèque des canaux spectraux. Dans un troisième chapitre, nous explorons le potentiel de cette nouvelle approche pour la neurobiologie. En particulier, nous démontrons l'histologie multicouleur de plusieurs mm3 de tissu "Brainbow" avec une résolution constante dans l’ensemble du volume imagé. Nous illustrons le potentiel de notre approche à travers l'analyse de la morphologie, des interactions et du lignage des astrocytes du cortex cérébral de souris. Nous explorons également l’apport du Chrom-SMP pour le suivi multiplexé de projections neuronales marquées par des traceurs de couleurs distinctes sur de grandes distances. Enfin, nous présentons dans un quatrième chapitre le développement de la microscopie à trois photons multimodale, approche permettant d’augmenter la profondeur d’imagerie sur tissus vivants. / Multiphoton microscopy has transformed neurobiology since the 1990s by enabling 3D imaging of thick tissues at subcellular resolution. However the depths provided by multiphoton microscopy are limited to a few hundreds of micrometers inside scattering tissues such as the brain. In the recent years, several strategies have emerged to overcome this depth limitation and to access larger volumes of tissue. Although these novel approaches are transforming brain imaging, they currently lack efficient multicolor and multicontrast modalities. This work aims at developing large-scale and deep-tissue multiphoton imaging modalities with augmented contrast capabilities. In a first chapter, we present the challenges of high-content large-volume brain imaging, with a particular emphasis on powerful multicolor labeling strategies which have so far been restricted to limited scales. We then introduce chromatic serial multiphoton (Chrom-SMP) microscopy, a method which combines automated histology with multicolor two-photon excitation through wavelength-mixing to access multiple nonlinear contrasts across large volumes, from several mm3 to whole brains, with submicron resolution and intrinsic channel registration. In a third chapter, we explore the potential of this novel approach to open novel experimental paradigms in neurobiological studies. In particular, we demonstrate multicolor volumetric histology of several mm3 of Brainbow-labeled tissues with preserved diffraction-limited resolution and illustrate the strengths of this method through color-based tridimensional analysis of astrocyte morphology, interactions and lineage in the mouse cerebral cortex. We further illustrate the potential of the method through multiplexed whole-brain mapping of axonal projections labeled with distinct tracers. Finally, we develop multimodal three-photon microscopy as a method to access larger depths in live settings.