No description available.

No description available.

The main objective of this thesis is to contribute to our understanding of the regulation of brown adipose gene expression by examining the transcriptional regulation of the two key brown adipogenic genes, UCPl and PGCla during the initial stage of differentiation in a model brown adipocyte cell line. The principal findings were that UCP land PGC 1 a expression was induced by both forskolin and rosiglitazone, and that combination of these drugs produced a synergistic increase which required the full length promoters. These effects on UCPl and PGCla expression were partially suppressed by PKA and PPARy antagonists and results suggested that there is a cross-talk between PKA and PPARy signalling pathways. C~anges in brown adipogenic gene expression similarly provided evidence of cross-talk between PKA and PPARy signalling pathways which may explain the mechanism responsible for the synergistic effects offorskolin and rosiglitazone on UCPl expression. PPARy and CIEBPP, but not PGC 1 a overexpression, increased basal and stimulated UCP 1 mRNA. Similar results were observed with the 3.lkb UCPl-Luc reporter and co-overexpression ofPPARy with PGC 1 a markedly upregulated UCP 1 transcription in response to either forskolin or rosiglitazone. PGCla mRNA was increased in response to C/EBPP, but not PPARy overexpression and these results were confirmed using the 2.6kb PGCla-Luc reporter. PGC 1 a transcription was further up-regulated by co-overexpression of C/EBPP with PPARy in response to either forskolin or rosiglitazone. RIPl40 overexpression inhibited the effect of PG Cl a on rosiglitazone stimulated 3.lkb UCPl-Luc promoter activity. The results suggests that there are differences in transcriptional regulation between UCP 1 and PGCla promoters which indicate that the synergistic effect of cAMP and PPARy ligand stimulation on UCPl expression is a direct results of control of the PPRE and CRE on the UCPl promoter rather than indirect control though the PGCla promoter. vi

The cold-inducible PPAR co-activator PGC-1α has been reported to play a pivotal role in the control of pre-adipocyte differentiation to brown adipose tissue (BAT) and mitochondriogenesis.  The overall aim of this study was to investigate the transcriptional control of PGC-1α gene in brown and white adipose tissue (WAT) precursor cells. Fragments up to 1.8kb of the rat PGC-1α proximal promoter were cloned into a pGL3 luciferase reporter vector and transfected into 3T3-L1 (WAT pre-adipocyte cell line) and HIB-1B (BAT pre-adipocyte cell line).  The phenotype of these cell lines was confirmed by histological and biochemical characterisation.  When cells were induced to differentiate, even the shortest (264bp) reporter construct supported luciferase expression in HIB-1B, but not in 3T3-L1 cells.  cAMP stimulation induced endogenous PGC-1α  expression only in HIB-1B cells. Putative transcription factor binding sites were identified in the 264bp proximal promoter using both EMSA and promoter analysis software.  Mutation of the cAMP response element at -183 to -175 abolished completely the cAMP response of the promoter in 3T3-L1 cells, but only attenuated this response in HIB-1B cells.  this suggested that other indirect pathways were acting for the cAMP stimulation of this promoter in HIB-1B cells. Additional pathways through which differential control of the proximal PGC-1α promoter region could occur were next considered.  A putative C/EBP site at -101 to -94 was also implicated in the transcriptional control of this promoter.  Over-expression of C/EBPβ increased the activity of the promoter and rescued the response of PGC-1α in the 3T3-L1 cells.  Similar to PGC-1α, C/EBPβ was cAMP induced only in HIB-1B cells.

L'obésité est aujourd’hui considérée comme une maladie inflammatoire chronique dite de « bas grade » principalement caractérisée par une augmentation de l’inflammation du tissu adipeux. Les adipocytes et les macrophages sont connus pour jouer un rôle clé dans l’établissement, la progression et le maintien de l'inflammation. Dans mon projet de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés aux mécanismes transcriptionnels impliqués dans l'inflammation chronique en décodant l'action du corégulateur transcriptionnel GPS2 (G protein pathway suppressor 2) dans les adipocytes et les macrophages du tissu adipeux. Dans un premiers temps, nous avons étudié la régulation et les actions de GPS2 (et ses partenaires SMRT et NCOR) dans le tissu adipeux humains de sujets obèses par rapport à des sujets minces. Dans cette première étude, nous avons identifié un mécanisme épigénomique qui participe à la régulation de la transcription des gènes inflammatoires dans les adipocytes lors de l’obésité. Nous avons démontré que la dérégulation de GPS2 contribuait à l'inflammation du tissu adipeux en permettant à la dérépression de certains gènes inflammatoires dont l’interleukine 6. Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé les conséquences de l’invalidation de GPS2 dans le phénotype inflammatoire des macrophages ainsi que les conséquences in vivo sur la progression de l’insulino-résistance. Pour ceci, nous avons généré un modèle de souris où GPS2 a été spécifiquement invalidé dans les macrophages (GPS2-MacKO). De manière intéressante, les souris GPS2-MacKO, présentent une expression accrue des gènes impliqués dans la voie de signalisation des TLR et des chimiokines dans les macrophages isolés. Par conséquent, une augmentation significative de l'infiltration des macrophages dans le tissu adipeux est observée dans un contexte d’obésité induisant une altération de l’homéostasie glucidique. Par nos approches génomiques, transcriptomiques et épigénomiques, nous avons pu révéler les voies de signalisations spécifiquement contrôlées par GPS2. Ces travaux démontrent également l’importance des régulations épigénomiques dans l'inflammation métabolique du tissu adipeux durant l'obésité. / Obesity is now considered a chronic low-grade inflammatory disease with increased levels of inflammatory mediators both in circulation and adipose tissue. Among adipose tissue cell types, adipocytes and macrophages are known to play key roles in the progression of inflammation by establishing and maintaining it. In this PhD project, we particularly focus on the transcriptional mechanisms behind the chronic low-grade inflammation by deciphering the action of GPS2 in adipocytes and adipose tissue macrophages. We initially studied the gene regulation and the actions of GPS2 and its partners in adipose tissue and adipocytes of human obese subjects compared to lean subjects. In this first study we identified a novel regulatory pathway that participates in the transcriptional control of inflammation associated with obesity, both in adipose tissue and adipocytes. We have shown that GPS2 and SMRT were differentially expressed and regulated in obese adipocytes. In addition, this dysregulation contributes to inflammation of the adipose tissue by allowing the derepression of specific inflammatory genes. In a second study, in order to go further in the characterisation of the in vivo function of GPS2, we generated a mouse model were GPS2 was specifically invalidated in macrophages. Models of diet-induced obesity were applied in these experiments. Interestingly, GPS2-MacKO mice showed an increased expression of inflammatory genes both in adipose tissue and isolated ATMs (F4/80+ cells) associated with a significant increase of macrophages infiltration in the adipose tissue. Finally, we observed that GPS2-MacKO mice had impaired glucose metabolism as they presented high glucose intolerance as well as an important insulin resistance.

Εισαγωγή: Η παιδική παχυσαρκία αποτελεί μία επιδημία του σύγχρονου δυτικού κόσμου και ορίζεται λειτουργικά ως η υπέρμετρη αύξηση του λιπώδους ιστού. Η παχυσαρκία αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη μίας πληθώρας συνοσηροτήτων όπως την αντίσταση στην ινσουλίνη, το σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, καρδιοαγγειακά νοσήματα και μεταβολικό σύνδρομο. Ο λιπώδης ιστός είναι ένα παρακρινές και ενδοκρινές όργανο, το οποίο μέσω της έκκρισης κυτταροκινών και φλεγμονογόνων παραγόντων έχει την ικανότητα να ρυθμίσει το ενεργειακό ισοζύγιο του οργανισμού. Η αντιπονεκτίνη μία από τις πιο σημαντικές κυτταροκίνες του λιπώδους ιστού, μέσω των υποδοχέων της AdipoR1 και AdipoR2, ενεργοποιεί την ινσουλινοεπαγώμενη πρόσληψη της γλυκόζης από το λιποκύτταρο, ενώ έχει αντι-φλεγμονώδης και αντι-αθηρωματική δράση σε άλλους ιστούς του οργανισμού. Ο PPAR-γ, ανήκει στην υπερ-οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων PPARs (peroxisome proliferative-activated receptors) και είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας, ο οποίος σε ανταπόκριση στα κυκλοφορούντα ελεύθερα λιπαρά οξέα, ενεργοποιεί τη διαφοροποίηση των προλιποκυττάρων σε ώριμα λιποκύτταρα μικρού μεγέθους με πολλά λιποσταγονίδια. Το PPAR-γ μέσω της ενεργοποίησης του από τους ενδογενείς υποκαταστάτες του, τις θειαζολιδινεδιόνες, επάγει την ινσουλινοευαισθησία και αυξάνει την έκφραση της αντιπονεκτίνης. Τα ενδοκανναβινοειδή, μέσω των υποδοχέων τους CB1 και CB2, ρυθμίζουν την όρεξη στο κεντρικό νευρικό σύστημα, ενώ μπορούν να ενεργοποιήσουν περιφερικά τη λιπογένεση και να μειώσουν τη γονιδιακή έκφραση της αντιπονεκτίνης. Τα ενδοκανναβινοειδή βρίσκονται υπερενεργοποιημένα σε ενήλικες παχύσαρκους, ενώ τα επίπεδα της αντιπονεκτίνης μειώνονται σημαντικά. Σκοπός: Να μελετηθούν τα επίπεδα έκφρασης του AdipoR1, του PPAR-γ, του CB1 και των ενζύμων των ενδοκανναβινοειδών FAAH και DAGL-α, σε λεπτόσωμα και παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά και να συσχετιστούν με τα κυκλοφορούντα επίπεδα της αντιπονεκτίνης και της ινσουλίνης. Μεθοδολογία: Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες προλιποκυττάρων και ώριμων λιποκυττάρων από βιοψίες κοιλιακού υποδόριου λιπώδους ιστού 17 παχύσαρκων (BMI>95%) και 36 λεπτόσωμων (BMI<85%) προεφηβικών παιδιών. Τα παιδιά χωρίστηκαν σε δύο ηλικιακές ομάδες, ομάδα Α: 2μηνών-7 ετών και ομάδα Β: 9-12 ετών. Η γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση του AdipoR1, PPAR-γ και CB1 μελετήθηκαν με τη μέθοδο RT-PCR και Western Immunoblotting. Επίσης, η γονιδιακή έκφραση των ενζύμων των ενδοκανναβινοειδών FAAH και DAGL-α, μελετήθηκαν με Real-Time PCR. Τα κυκλοφορούντα επίπεδα της ολικής και HMW αντιπονεκτίνης όπως και της ινσουλίνης μετρήθηκαν με ELISA, ενώ υπολογίστηκε ο δείκτης ινσουλινοαντίστασης HOMA-IR και μετρήθηκε η περίμετρος κοιλίας σε κάθε παιδί. Αποτελέσματα: Η πρωτεϊνική έκφραση του AdipoR1 βρέθηκε μειωμένη στα προλιποκύτταρα και ώριμα λιποκύτταρα των μικρότερων παχύσαρκων παιδιών της ομάδας Α, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λεπτόσωμά τους. To PPAR-γ βρέθηκε αυξημένο στα ώριμα λιποκύτταρα των λεπτόσωμων και παχύσαρκων παιδιών, σε σύγκριση με τα προλιποκύτταρά τους, ενώ ήταν και σημαντικά αυξημένο στα ώριμα λιποκύτταρα των μικρότερων παχύσαρκων παιδιών, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λεπτόσωμά τους. Ο υποδοχέας των ενδοκανναβινοειδών, CB1, ήταν σημαντικά μειωμένος στα ώριμα λιποκύτταρα των παχύσαρκων παιδιών και των δύο ηλικιακών ομάδων, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λεπτόσωμά τους, ενώ παρουσίασε μία σημαντική αύξηση με την ηλικία. Επιπρόσθετα, το ένζυμο αποδόμησης FAAH (για την ανανδαμίδη) μειώθηκε με την ηλικία στα μεγαλύτερα λεπτόσωμα παιδιά της ομάδας Β, ενώ στα μεγαλύτερα παχύσαρκα παιδιά ήταν αυξημένο σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λεπτόσωμά τους. Το ένζυμο βιοσύνθεσης DAGL-α (για το 2-AG) βρέθηκε αυξημένο στα μεγαλύτερα λεπτόσωμα και παχύσαρκα παιδιά της ομάδας Β σε σύγκριση με τα λεπτόσωμα και παχύσαρκα παιδιά της ομάδας Α. Η ινσουλίνη και το HOMA-IR ήταν σημαντικά αυξημένα στα μεγαλύτερα παιδιά, λεπτόσωμα και παχύσαρκα, σε σύγκριση με τα μικρότερα παιδιά. Η HMW αντιπονεκτίνη βρέθηκε μειωμένη στα λεπτόσωμα και παχύσαρκα παιδιά της ομάδας Β σε σύγκριση με τα αντίστοιχα παιδιά της ομάδας Α, ενώ ήταν σημαντικά αυξημένη στα μικρότερα παχύσαρκα παιδιά σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λεπτόσωμά τους. Η περίμετρος κοιλίας ήταν σημαντικά αυξημένη στα μεγαλύτερα παχύσαρκα αγόρια σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λεπτόσωμά τους. Συμπεράσματα: Η μειωμένη έκφραση του CB1 και η αυξημένη έκφραση του PPAR-γ στα μικρότερα παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά της ομάδας Α, σε συνάφεια με τα αυξημένα επίπεδα της HMW αντιπονεκτίνης, πιθανόν να αντικατοπτρίζουν έναν προστατευτικό μηχανισμό ελεγχόμενης λιπογένεσης και διατήρησης της ινσουλινοευαισθησίας στα παιδιά αυτά που ήδη παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα της αντιπονεκτίνης, AdipoR1. Επιπλέον, τα μειωμένα επίπεδα της HMW αντιπονεκτίνης και τα αυξημένα επίπεδα της ινσουλίνης στα μεγαλύτερα παιδιά πιθανόν απεικονίζει την προετοιμασία των παιδιών αυτών για την «φυσιολογική» ινσουλινοαντίσταση της εφηβείας. Η αύξηση των ενζύμων FAAH και DAGL-α στα μεγαλύτερα παχύσαρκα παιδιά της ομάδας Β, μπορεί έμμεσα να μας δείχνει ότι τα επίπεδα της ανανδαμίδης στα παιδιά αυτά είναι μειωμένα, ενώ τα επίπεδα του ενδοκανναβινοειδούς 2-AG αυξάνονται, θέτοντας πιθανόν τα παχύσαρκα παιδιά σε μεγαλύτερο κίνδυνο για λιπογένεση. Η μειωμένη έκφραση του CB1 στα μεγαλύτερα παχύσαρκα παιδιά όμως, μπορεί να απεικονίζει είτε την προσπάθεια του οργανισμού να περιορίσει την λιπογένεση στα παιδιά αυτά, που ήδη βρίσκονται σε κίνδυνο λόγω της παχυσαρκίας τους, είτε αντικατοπτρίζει τη μειωμένη ικανότητα του υποδόριου λιπώδους ιστού να αποθηκεύσει λίπος αυξάνοντας τον κίνδυνο εναπόθεσης λίπους ενδοκοιλιακά, το οποίο μπορεί να διαταράξει την ενεργειακή ισορροπία του οργανισμού τους προκαλώντας διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη. / Introduction: Childhood obesity is the new epidemic of the western world and reflects the excessive storage of body fat. Obesity is a risk factor for the development of metabolic comordities like insulin resistance, diabetes mellitus type 2, cardiovascular diseases and metabolic syndrome. Adipose tissue is an endocrine and paracrine organ, which through the secretion of adipokines and pro-inflammatory molecules it can regulate the body’s energy homeostasis. Adiponectin is one of the most important secreted adipokines of adipose tissue and through its AdipoR1 and AdipoR2 it can activate the insulin-dependent glucose uptake of adipocytes. In addition, adiponectin has anti-inflammatory and anti-atherogenic action in other peripheral tissues of the body. PPAR-γ belongs to the family of nuclear receptors PPARs (peroxisome proliferative-activated receptors) and it is a transcription factor, which responds to circulating Free Fatty Acids activating the preadipocyte differentiation into small multilocular mature adipocytes. PPAR-γ through its activation from its endogenous ligands, the thiazolidenidions, can regulate the body’s insulin sensitivity and can increase the transcription of adiponectin. The endocannabinoids, through their receptors CB1 and CB2, can regulate food intake via their central nervous system action, they activate lipogenesis in the periphery and reduce the gene expression of adiponectin. The endocannabinoids are found to be upregulated in adult obesity, whereas adiponectin levels are decreased. Aim: To study the expression of AdipoR1, PPAR-γ, CB1 and the endocannabinoid enzymes FAAH and DAGL-α, in prepubertal lean and obese children in relation to their adiponectin and insulin levels in their blood serum. Materials & Methods: Primary cultures of preadipocytes and mature adipocytes were developed from surgical biopsies of abdominal subcutaneous adipose tissue of 17 obese (BMI>95%) and 36 lean (BMI<85%) prepubertal children. The gene and protein expression of AdipoR1, PPAR-γ and CB1 were investigated by RT-PCR and western immunoblotting. The gene expression of the endocannabinoid enzymes FAAH and DAGL-α were studied by Real-Time PCR. Total and HMW adiponectin together with insulin were measured in blood serum by ELISA, whereas the insulin resistance index HOMA-IR was estimated and waist circumference was measured in every child. Results: The protein expression of AdipoR1 was significantly decreased in the preadipocytes and the mature adipocytes of the younger obese prepubertal children of group A when compared to their respective lean. PPAR-γ was increased in the mature adipocytes of all the children in comparison to their respective preadipocytes, whereas it was significantly increased in the mature adipocytes of the younger obese children compared to their respective lean. The endocannabinoid receptor, CB1, was significantly decreased in the mature adipocytes of the obese children in both age groups, when compared to their respective lean, whereas it increased with age in the older lean children. Furthermore, the degradation enzyme FAAH (for anandamide) decreased significantly with age in the older lean prepubertal children of group B, in comparison to the younger lean and it was significantly increased in the older obese children in comparison to their respective lean. The biosynthetic enzyme DAGL-α (for 2-AG) was found significantly increased in the older lean and obese prepubertal children of group B when compared to the younger children of group A. Insulin and the HOMA-IR were significantly increased in the older children, both lean and obese in comparison to their respective younger children. HMW adiponectin was decreased in the older prepubertal children of group B in comparison to group A, whereas it was significantly increased in the younger obese children of group A when compared to their respective lea. Waist circumference was significantly increased in the older obese boys when compared with their respective lean. Conclusions: The decreased expression of CB1 together with the increased expression of PPAR-γ and the increased levels of HMW adiponectin in the younger obese prepubertal children of group A, possibly reflects their body’s attempt to further limit their pathologic lipogenesis and to maintain normal insulin sensitivity in these obese children, who already have decreased AdipoR1 expression. In addition, the decreased HMW adiponectin levels and the increased insulin in the older children could be indicative of their “physiological” insulin resistance during puberty. The increased expression of the enzymes FAAH and DAGL-α in the older obese prepubertal children of group B, may indirectly demonstrate that anandamide is decreased and 2-AG is increased in these children, possibly pre-empting them for increased lipogenesis. The decreased expression of CB1 in the older obese children may also indicate either the body’s attempt to further limit lipogenesis since they are already at risk due to their obesity or it reflects their decreased ability of storing fat in their subcutaneous adipose tissue, increasing the risk of visceral fat disposition that can disrupt their energy homeostasis and could possibly lead to the development of glucose intolerance.