- / -

Οι υδατάνθρακες αποτελούν βασικά δομικά στοιχεία των κυτταροπλασματικών μεμβρανών, ως συστατικά των μορίων γλυκοπρωτεϊνών, γλυκοζαμινογλυκανών ή γλυκολιπιδίων. Είναι πλέον γνωστό ότι οι υδατάνθρακες δεν αποτελούν απλά ενεργειακά αποθέματα αλλά μόρια υψίστης λειτουργικής σημασίας, τα οποία δρουν ρυθμιστικά στον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων και συμμετέχουν σε διεργασίες όπως η κυτταρική αναγνώριση και προσκόλληση, η λειτουργία υποδοχέα, η λήψη και η μεταγωγή μηνυμάτων, ο καθορισμός της αντιγονικότητας, η αντιπρωτεολυτική και ανοσοδυναμική δράση κ.α. Οι λεκτίνες είναι πρωτεΐνικά ή γλυκοπρωτεΐνικά μόρια φυτικής ή ζωικής προελεύσεως, τα οποία έχουν την ιδιότητα της ειδικής και αναστρέψιμης συνδέσεως με υδατανθρακικές ομάδες της κυτταρικής επιφάνειας, της διάμεσης θεμέλιας ουσίας ή ελεύθερων γλυκολιπιδίων και γλυκοπρωτεϊνών, την χημική σύσταση των οποίων δεν αλλοιώνουν. Η χρήση ειδικά σεσημασμένων λεκτινών στα πλαίσια ιστοχημείας, ανοσοϊστοχημείας, ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, ραδιοαπεικονιστικών και άλλων μεθόδων, προσφέρει ένα θαυμάσιο εργαλείο για τη μελέτη και κατευθυνόμενη τροποποίηση της μεμβρανικής υδατανθρακικής συστάσεως. Παρά τα σημαντικά βήματα προόδου στην μοριακή ανατομία κατά τα τελευταία έτη, οι γνώσεις μας για τη μορφογένεση του ανθρώπινου δέρματος είναι σχετικά περιορισμένες. Η ιδιαίτερα σημαντική για την διαφοροποίηση αλλά και για την μορφογένεση, υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών της ανθρώπινης εμβρυϊκής επιδερμίδας, οι μεταβολές της αναλόγως του εξελικτικού σταδίου και οι διαφορές της σε σχέση με την επιδερμίδα του ενηλίκου, είναι ελάχιστα μελετημένες. Οι σχετικές εργασίες που ανευρίσκονται στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες σε αριθμό και αποσπασματικές (περιορισμένο υλικό, στενό φάσμα εξεταζόμενων ηλικιών), ενώ τα αποτελέσματα τους είναι σε πολλές περιπτώσεις αντιφατικά. Για τους λόγους αυτούς ο σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η διερεύνηση σε μεγάλο δείγμα και ευρύ ηλικιακό φάσμα της υδατανθρακικής συστάσεως των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά τη μορφογένεση της ανθρώπινης επιδερμίδας, με τη χρήση έξι διαφορετικών βιοτινυλιωμένων λεκτινών (PNA, DBA, WGA, RCA, ConA και UEA), η αντιπαραβολή των ευρημάτων με τα αντίστοιχα της διεθνούς βιβλιογραφίας και με εκείνα της υγιούς επιδερμίδας του ενηλίκου και τέλος η διερεύνηση του ενδεχομένου μελλοντικής αξιοποιήσεως των ευρημάτων της μελέτης στα πλαίσια διαγνωστικών ή θεραπευτικών εφαρμογών. Το υλικό της παρούσης εργασίας αποτελείτο από 152 συνολικά βιοψίες δέρματος κνήμης, ηλικίας 10 έως 23 εβδομάδων EGA. Ο καθορισμός της ηλικίας, η επεξεργασία των βιοψιών και η χρώση με λεκτίνες έγιναν σύμφωνα με καθιερωμένες μεθόδους που περιγράφονται στο αντίστοιχο κεφάλαιο. Κατά τη χρώση με τη λεκτίνη ΡΝΑ διαπιστώθηκε στο περιδέρμιο και στην ενδιάμεση στιβάδα συνεχής παρουσία της D-γαλακτοζο-β-(1,3)- Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης από την 10η μέχρι και την 20η εβδομάδα. Η βασική στιβάδα ήταν αρνητική σε όλα τα παρασκευάσματα από την 10η έως την 20η εβδομάδα, ενώ παρουσία της D-γαλακτοζο-β-(1,3)-Ν- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης στην βασική μεμβράνη διαπιστώθηκε από την 10η έως και την 13η εβδομάδα. Στα παρασκευάσματα της 23η εβδομάδας η κεράτινη στιβάδα, η βασική στιβάδα και η βασική μεμβράνη ήταν αρνητικές στην ΡΝΑ, ενώ οι κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων τόσο της κοκκώδους όσο και της ακανθωτής στιβάδας παρουσίαζαν μετρίας εντάσεως θετική χρώση. Η υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων και στην επιδερμίδα των ενηλίκων είναι ταυτόσημη. Η RCA έδωσε θετική αντίδραση κυμαινόμενης εντάσεως στο περιδέρμιο και στην ενδιάμεση στιβάδα σε όλα τα παρασκευάσματα από την 10η έως και την 20η εβδομάδα, γεγονός το οποίο υποδηλώνει μεμβρανική παρουσία της β-D-γαλακτόζης. Η β-D-γαλακτόζη ήταν παρούσα σε χαμηλή συγκέντρωση στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της βασικής στιβάδας μεταξύ 10ης-12ης και 18ης-20ης εβδομάδας, ενώ αντιθέτως δεν ανιχνεύθηκε από την 13η έως την 17η εβδομάδα. Στην βασική μεμβράνη παρουσία της διαπιστώθηκε έως την 15η εβδομάδα. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα της 23ης εβδομάδας η β-D- γαλακτόζη απουσιάζει μόνο στην κεράτινη στιβάδα και στη βασική μεμβράνη, ενώ η συγκέντρωσή της αυξάνει στις μεμβράνες των κυττάρων από την βασική προς την ενδιάμεση στιβάδα. Όσον αφορά και την RCA η χρώση της εμβρυϊκής επιδερμίδος κατά την 23η εβδομάδα αντιστοιχεί σε γενικές γραμμές με εκείνη της επιδερμίδας των ενηλίκων. Το περιδέρμιο ήταν θετικό για την DBA από την 10η έως και την 20η εβδομάδα, εύρημα το οποίο υποδηλώνει παρουσία της α-D-N- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων του από την 10η εβδομάδα μέχρι και την απόπτωσή του. Ο υδατάνθρακας αυτός απουσίαζε όμως πλήρως στις μεμβράνες των κυττάρων τόσο της ενδιάμεσης όσο και της βασικής στιβάδας από την 10η έως και την 20η εβδομάδα. Η α-D-N-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη ανιχνευόταν στη βασική μεμβράνη μόνον μεταξύ της 10ης και της 12ης εβδομάδας. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων ο υδατάνθρακας αυτός απουσίαζε παντελώς στη βασική μεμβράνη και σε όλες τις στιβάδες πλην της βασικής, στην οποία ανιχνευόταν σε ποσοστό 40% των παρασκευασμάτων και μόνον εστιακά. Το παρατηρούμενο πρότυπο γλυκοζυλιώσεως στην 23η εβδομάδα όσον αφορά την α-D-N- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη, είναι ταυτόσημο με εκείνο που παρατηρείται στην επιδερμίδα των ενηλίκων. Σύμφωνα με πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα πιθανολογείται πως τα DBA-θετικά κύτταρα της βασικής στιβάδας αποτελούν πρώιμα μεταμιτωτικά διαφοροποιούμενα κύτταρα. Για την μετακίνηση των κυττάρων αυτών προς τις υπερβασικές στιβάδες είναι απαραίτητη η απώλεια των β1-ιντεγκρινών από την κυτταρική επιφάνεια, φαινόμενο που σχετίζεται με την διακοπή της γλυκοζυλιώσεως της β1 ιντεγκρινικής υπομονάδας και τη συσσώρευσή της στο σύστημα Golgi. Η παρουσία της α-D-N-ακετυλο-D- γαλακτοζαμίνης θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει σήμα αναστολής της κινήσεως της β1-ιντεγκρίνης προς την κυτταρική επιφάνεια. Η χρώση της εμβρυϊκής επιδερμίδας με ConA στο περιδέρμιο και την ενδιάμεση στιβάδα ήταν θετική μεταξύ 10ης και 20ης εβδομάδος, με συνεχείς διακυμάνσεις της εντάσεως (και κατά συνέπεια της συγκεντρώσεως της α-D-μανόζης και της α-D-γλυκόζης). Στην βασική στιβάδα η ConA ήταν θετική έως και την 12η εβδομάδα, ενώ στην βασική μεμβράνη ήταν θετική έως την και την 14η εβδομάδα. Η παρουσία της α- D-μανόζης και της α-D-γλυκόζης στην βασική στιβάδα σε πρώιμα στάδια της μορφογενέσεως φαίνεται να αποτελεί διαφορά μεταξύ της εμβρυϊκής επιδερμίδας και άλλων εμβρυϊκών επιθηλίων και υποδηλώνει κάποιο ειδικό ρόλο του υδατάνθρακος αυτού κατά το κρίσιμο στάδιο της επιδερμιδικής διαφοροποιήσεως. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα κατά την 23η εβδομάδα η α-D-μανόζη και η α-D-γλυκόζη ανιχνεύονται μόνο στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της κοκκώδους και της ακανθωτής στιβάδας. Η απουσία τους από τη βασική στιβάδα της εμβρυϊκής επιδερμίδας στις 23 εβδομάδες αποτελεί και τη μοναδική διαφορά της τελευταίας σε σύγκριση με την επιδερμίδα των ενηλίκων. Αν εξαιρέσει κανείς τη βασική στιβάδα της εμβρυϊκής επιδερμίδας (και τη βασική μεμβράνη) από τη 10η έως και την 20η εβδομάδα στην οποία η μεμβρανική χρώση με UEA ήταν αρνητική (άρα απουσίαζε η α- L-φουκόζη) στις υπόλοιπες επιδερμιδικές στιβάδες η ένταση της χρώσεως παρουσίαζε μεγάλες διακυμάνσεις. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων θετική χρώση με UEA και επομένως και παρουσία α-L-φουκόζης υπήρχε μόνο στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της κοκκώδους και της ακανθωτής στιβάδας, όπως ακριβώς συμβαίνει και στην επιδερμίδα του ενηλίκου. Η απουσία της α-L-φουκόζης στη βασική στιβάδα φαίνεται να αποτελεί σημαντική διαφορά μεταξύ της εμβρυϊκής επιδερμίδας και άλλων εμβρυϊκών επιθηλίων όπως π.χ. του αναπνευστικού. Αντιθέτως, η πρώιμη παρουσία της στις μεμβράνες των κυττάρων της ενδιάμεσης στιβάδας, υποδηλώνει σημαντικό ρόλο της κατά τα πρώτα στάδια της επιδερμιδικής διαφοροποιήσεως. Βασικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της χρώσεως της εμβρυϊκής επιδερμίδας από την 10η έως και την 20η εβδομάδα με τη λεκτίνη WGA ήταν οι συνεχείς διακυμάνσεις της εντάσεώς της τόσο στο περιδέρμιο όσο και στην ενδιάμεση και στη βασική στιβάδα, ενώ στη βασική μεμβράνη μετά την 13η εβδομάδα η αντίδραση ήταν αρνητική. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν αντίστοιχες ποσοτικές μεταβολές της μεμβρανικής συγκεντρώσεως της β(1,4)-D-N-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης. Στα παρασκευάσματα της 23ης εβδομάδας αρνητική χρώση με WGA παρατηρήθηκε μόνο στην κεράτινη στιβάδα και στη βασική μεμβράνη, όπως ακριβώς και στην επιδερμίδα των ενηλίκων. Σε όλες τις περιπτώσεις μεταξύ 13ης και 15ης εβδομάδος η βασική μεμβράνη αρνητικοποιήθηκε για τους υδατάνθρακες D-γαλακτοζο-β- (1,3)-Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη, β-D-γαλακτόζη, α-D-N-ακετυλο-D- γαλακτοζαμίνη και α-D-μανόζη, α-D-γλυκόζη. Οι αλλαγές αυτές στην γλυκοζυλίωση συμπίπτουν χρονικά με την έναρξη του σταδίου της θυλακικής κερατινοποίησης και πιθανώς να σχετίζονται με την - απαραίτητη για τη μορφογένεση των τριχικών θυλάκων και άλλων δομών - σύνθετη αλληλεπίδραση επιδερμίδας-χορίου. Η ερμηνεία των παρατηρηθέντων μεταβολών της υδατανθρακικής σύστασης των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά τη μορφογένεση της επιδερμίδας είναι επί του παρόντος δυσχερής, δεδομένου ότι οι μηχανισμοί συνθέσεως και μεταφοράς των υδατανθράκων στα επιδερμιδικά κύτταρα παραμένουν άγνωστοι. Η σύγκριση των ευρημάτων της παρούσης μελέτης με τις ολιγάριθμες και αποσπασματικές προγενέστερες σχετικές εργασίες, δείχνει ταύτηση σε πολλά σημεία αλλά και σημαντικές διαφορές. Για την ερμηνεία των διαφορών αυτών θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ο πολύ μικρός αριθμός παρασκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκε στις προγενέστερες εργασίες, ο συγκριτικά πολύ μεγάλος αριθμός παρασκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, οι διαφορές στις θέσεις λήψεως των βιοψιών του δέρματος μεταξύ των μελετών, αλλά και οι διαφορές στις τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν. Τα ευρήματα της παρούσης μελέτης, στην οποία αναλύεται για πρώτη φορά σε τέτοιο βαθμό πληρότητας (ηλικιακό φάσμα, αριθμός παρασκευασμάτων), η υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά την μορφογένεση, θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη διερεύνηση της παθογένειας δερματικών νοσημάτων, καθώς και για τη μελλοντική ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών εφαρμογών. / Carbohydrates are essential structure components of plasma cell membranes since they are constituents of the molecules of glycoproteins, glycosaminoglycans and glycolipids. It is known that carbohydrates do not simply represent energy sources but molecules of cardinal functional importance, which are involved in the regulatory mechanisms of the mitotic activity and differentiation of cells and participate in cell recognition and adhesion, signal transduction, receptor function, antigen formation and other key biochemical and immunological events. Lectins are proteins or glycoproteins of plant or animal origin, which are capable of specifically and reversibly binding to carbohydrate residues of the cell surface, intercellular matrix or free glycolipids and glycoproteins. Specifically labelled lectins represent a useful tool for the study and manipulation of carbohydrate composition of plasma cell membranes. Despite the recent significant progress in molecular anatomy, our knowledge and understanding of the mechanisms underlying the morphogenesis of human skin are limited. Particularly very little is known about the carbohydrate composition of plasma cell membranes of human embryonic epidermis, its alterations during epidermal morphogenesis and its differences, as compared to the adult epidermis. The number of studies dealing with this subject is small, the examined skin specimens are limited, the spectrum of the gestational age groups they originated from is narrow and the corresponding results mostly contradictory. We found it, therefore, of interest to : a) Investigate in the present study the carbohydrate composition of plasma cell membranes during morphogenesis of human epidermis, using six different biotinylated lectins (PNA, DBA, WGA, RCA, Con A and UEA) in a large number of specimens derived from different gestational age-groups. b) To comparatively evaluate our findings with the available data on embryonic and adult human epidermis and c) To search for possible diagnostic or therapeutic applications of our results. A total number of 152 tibial skin specimens (10-23 weeks EGA) were studied by lectin histochemistry. The positive reaction of periderm and intermediate layer (10th to the 20th week EGA) points towards a persistent occurrence of D-galactose-β-(1,3)-N-acetyl-D-galactosamine in the plasma cell membranes of these layers. The basal layer revealed negative reaction to PNA in all specimens (10th to 20th week EGA), whereas, basement membrane demonstrated positive staining in the specimens of the 10th to 13th week EGA. In the specimens of the 23th week EGA, the keratin and basal layer and the basement membrane showed no staining with PNA, whereas, the plasma cell membranes in the granular and spinous layers showed a moderately positive reaction. The identical-PNA binding pattern indicates the lack of any differences between the embryonic (23 weeks EGA) and adult epidermis with regard to D-galactose- β-(1,3)-N-acetyl-D-galactosamine plasma cell membrane composition. In all specimens of the 10th to 20th week EGA, periderm and intermediate layer showed a positive reaction to RCA of variable intensity. This finding indicates that β-D-galactose is an obligatory constituent of plasma cell membranes in embryonic epidermis. Low β-D-galactose concentrations were found in the plasma cell membranes of the basal layer in the specimens of the 10th to 12th and 18th to 20th week EGA, whereas, this carbohydrate was not detected in the specimens of 13th to 17th week EGA and in the basement membrane beyond the 15th week EGA. In the specimens of the 23th week it was absent in the keratin and basal layer, whereas its concentrations progressively increased from the basal to the spinous layers. The RCA-binding pattern of specimens of the 23th week EGA is very similar to that of the adult epidermis. Periderm showed positive reaction to DBA in the specimens of the 10th to 20th week EGA, indicating the occurrence of α-D-N-acetyl-D-galactosamine in the periderm until its apoptosis. However, this carbohydrate was completely absent in the plasma cell membranes of the keratinocytes in the intermediate and basal layers from the 10th to the 20th week EGA, but was detected in the basement membrane only in the specimens of the 10th to the 12th week EGA. In embryonic epidermis (23 weeks EGA) this carbohydrate was completely absent in the basement membrane and in all layers but the basal, in which it was focally detected in 40% of the specimens. Thus, the DBA-binding profile and concequently the pattern of α-D-N-acetyl-D-galactosamine distribution in the embryonic epidermis (23 weeks EGA) is identical to those of the adult epidermis. DBApositive keratinocytes of the basal layer are thought to represent early forms of post-mitotic differentiated keratinocytes. For the movement and translocation of these cells to the suprabasal layers the disappearance of β1-integrins from the cell surface is a prerequisite and related to the inhibition of β1-integrin subunit glycosylation and its accumulation in the Golgi apparatus. It is, therefore, possible that the presence of a-D-N acetyl-D-galactosamine could represent an inhibitory signal for β1- integrin translocation to the cell surface. Periderm and intermediate layer in the specimens of the 10th to the 20th week EGA positively reacted to Con A. The intensity of this reaction and concequently the concentration of α-D-glucose and α-D-mannose were variable. The plasma cell membranes of the basal layer stained with Con A only in the specimens of the 10th to 12th week EGA , whereas the basement membrane positively reacted only in the specimens of the 10th to 14th week EGA. It seems, therefore, that the occurrence of α-D-glucose and α-D-mannose in the keratinocyte membranes of the basal layer during the early stages of epidermal morphogenesis is a unique property of embryonic epidermis not shared by other embryonic epithelia that indicates a specific role of these carbohydrate residues in the critical initial stage of epidermal differentiation. In the embryonic epidermis, (23th week EGA), α-D-glucose and α-D-mannose were detected only in the plasma cell membranes of the keratinocytes of the granular and spinous layers, whereas its lack in the basal layer constitutes the only difference, as compared to the adult epidermis. Apart from the UEA negative basal layer (and the basement membrane) in the specimens of the 10th to the 20th week EGA, all other epidermal layers positively stained with this lectin. However, the intensity of the staining and consequently the concentration of α-L-fucose revealed dramatic variations. In the embryonic epidermis of the specimens of the 23rd week EGA only the plasma cell membranes of the keratinocytes in the granular and spinous layer positively reacted to UEA, a binding pattern identical to that found in the adult epidermis. The lack of α-Lfucose in the plasma cell membranes of basal keratinocytes constitutes a significant difference between the embryonic epidermis and other embryonic epithelia in humans. The occurrence of this monosaccharide in the surface of keratinocytes in the intermediate layer during the early age gestational roups indicate that it may play a significant role in the early stages of epidermal differentiation. A characteristic feature of embryonic epidermis (10th –20th week EGA) was the variable binding of the periderm and the plasma cell membranes of keratinocytes in the intermediate and basal layer to WGA, whereas the basement membrane (after the 13th week EGA) revealed a negative reaction. These findings clearly reflect corresponding variations of the plasma cell β(1,4)-D-N-acetyl-D-glucosamine composition. With regard to binding to WGA the embryonic epidermis (23rd week EGA) revealed a negative reaction, a feature also shared by the adult epidermis. It is of importance to note that in all specimens (13rd-15th week EGA) the basement membrane developed a negative reaction to D-galactose-β- (1,3)-Ν-acetyl-D-galactosamine, β-D-galactose, α-D-N-acetyl-D-galactosamine, α-D-glucose and α-D-mannose. These changes in plasma cell membrane glycosylation simultaneously occurred with the initiation of hair follicle keratinization and may be related to the complex interaction of epidermis and dermis, which is of essential importance for the morphogenesis of hair follicles. The interpretation of the observed alterations in the carbohydrate residue composition of the plasma cell membranes during epidermal morphogenesis is difficult at this juncture, since the mechanisms by which the synthesis and transport of these molecules within epidermal keratinocytes remain are mediated unknown. Our findings keep up with several results of previous investigations but contradict others, probably due to differences in the number and origin of the skin specimens and in the used techniques. The findings of the present study, in which the carbohydrate residue composition of keratinocyte plasma cell membranes was determined for the first time in a large number of specimens derived from different gestational age groups, could be utilized in the investigation of the pathogenesis, the prenatal diagnosis and the management of a vast variety of dermatoses.

No description available.

KirBac channels are prokaryotic homologs of eukaryotic inwardly-rectifying potassium channels, which have served as models for gaining insight into the structure of eukaryotic channels. This thesis focuses on the structure-function relationship in these channels. The first part of this study concerns a novel KirBac channel, KirBac9.2, which contains a unique amino acid sequence in the place of the canonical GYG selectivity filter. Although expressed and purified in a stable and functional form, the protein did not form well-diffracting crystals. Functional studies suggest that KirBac9.2 is non-selective for monovalent cations and a random mutagenesis screen identified a number of activatory mutants in the cytoplasmic domains of the channel. A full electrophysiological investigation of KirBac9.2 channel function is beyond the scope of this study. However, initial studies suggest that it is possible to record currents from KirBac9.2 channels reconstituted into lipid bilayers. The second part of this thesis investigates KirBac3.1, which is a classical KirBac channel containing the consensus GYG sequence for potassium selectivity. Five high resolution structures of a mutant channel are reported, which suggest a new feature in the gating mechanism of KirBac3.1 where a rotation of the cytoplasmic domains is linked to a change in the electrostatic environment of the cytoplasmic cavity. In addition, a functional study of the KirBac3.1 showed that the channel is highly pH sensitive.

Électroporation (EP) est une technique utilisée pour affecter l’intégrité des membranes cellulaires de plasma et/ou organites internes, conséquence de l’application d’un champ électrique d’énergie suffisante, dépendant de son intensité et sa durée. Il a été montré in- directement par de nombreuses études expérimentales et in-silico que ce phénomène résulte de la perméabilisation de la membrane par la formation pores aqueux. L’EP permet ainsi la vectorisation de molécules normalement non perméantes. Les applications de l’EP vont de l’électrochimiothérapie, à la vaccination à ADN. Les impulsions électriques utilisées dans l’EP sont classées en deux familles: Les msPEF dont la longueur des impulsions est de l’ordre de la microseconde et l’amplitude de l’ordre de quelques kV/cm. Ils affectent principalement la membrane cellulaire plasmique. Les nsPEFs d’intensité de MV/m de durée de l’ordre de la nanoseconde, ceux eux sont capables de perméabiliser organites internes ainsi que la membrane plasmique et présentent l’avantage d’éviter les effets thermiques indésirables. Les simulations de dynamique moléculaire (DM) qui permettent la description atomique, de la structure de la membrane et de son interaction avec la solution environnante, constituent un appui précieux aux résultats expérimentaux. Plusieurs études utilisant la DM été consacrées à décrire certains des aspects de l’EP (par exemple la formation de pores, leur évolution, le rôle de l’eau et des groupes de tête lipidiques, ...) néanmoins des questions en suspens restent inexplorées : • Comment la composition de la membrane affecte le seuil d’EP ? • Quelles sont la morphologie, la taille et la conductance des pores formés ? • Quels sont le mécanisme et l’échelle de temps de translocation de petites molécules à travers ces électropores ? • Y-a-t-il une différence notoire entre les effets des msPEFs et des nsPEFs ? Dans le cadre de ce travail, en utilisant des simulations de DM nous avons abordé ces questions pertinentes. Nous avons quantifié le seuil d’EP de bicouches lipidiques contenant des concentrations croissantes de cholestérol utilisant des protocoles qui miment les deux modes types de pulses nsPEFs et msPEFs. Les résultats obtenus indiquent que dans les deux cas les modèles de membranes à concentration en cholestérol croissante, nécessitent un voltage transmembranaire plus élevé pour perméabiliser la bicouche lipidique. Nous avons développé une procédure, mimant l’effet des msPEFs en adéquation avec les expériences, qui permet de stabiliser les voltages appliqués à la membrane suffisamment longtemps pour déterminer la dimension des pores, leur conductance et sélectivité ionique. Nous avons utilisé le même protocole pour étudier le transport de petites molécules chargées, utilisés dans l’administration de médicaments, et comparé nos résultats avec des études similaires menées dans des conditions nsPEFs. Nous avons montré que le transport assisté par EP a lieu dans la même échelle de temps (ns) que sous nsPEFs. Bien que les nsPEF ont l’avantage d’affecter les membranes cellulaires et celles des organites internes, la possibilité d’exploiter de telles impulsions pour la vectorisation de médicaments est encore en cours d’étude, car la capacité à fournir de manière fiable à des échantillons «biologiques» ces impulsions intenses ultra-courtes n’est pas trivial. Une attention particulière doit être accordée à la conception de micro-chambres afin de réaliser un dispositif à large bande passante afin de transmettre sans atténuation et distorsion les pulses ns, qui sont caractérisés par une grandes composante spectrale, jusqu’à GHz. Une partie importante de cette thèse mené en cotutelle, a été consacrée à la conception théorique (utilisant la Méthode des éléments Finis) d’un dispositif d’exposition, basé sur des systèmes de propagations de micro-ondes, capable de délivrer des impulsions aussi courtes que la ns avec des temps de monté et de chute de 0,5 ns / Electroporation (EP) is a technique used to affect the integrity of plasma cell membranes and/or internal organelles, consequence of the application of an external pulsed electric field of sufficient energy content, tuned by its strength and duration. It is proven by extensive indirect experimental and in silico evidences that this phenomenon results in the permeabilization of membrane structures by aqueous pores, allowing the transport of poorly- or non-permeant molecules, e.g. salts, ions, genetic material, and any other small solutes present. Applications of the techniques range from electrochemoterapy DNA vaccination and gene regulation. The electric pulses used in EP are categorized in two main families: msPEF, the length of the pulses is in the µs- ms scale and the amplitude in the order of kV/cm, their effect takes place mainly at the plasma cell membrane of cells; nsPEFs, higher magnitude (MV/m) over ns time scale, they act are able to permeabilize internal organelles as well as the plasma cell membrane, presenting the advantage of avoiding undesired thermal effects. Molecular dynamics simulations allow the microscopic description, with atomic resolution, of the membrane structure and its interaction with the surrounding solution, providing a substantial support to experimental findings. A considerable amount of work have been devoted to describe some of the aspects of EP using MD, (e.g. the pore formation, its evolution and reseal, the role of water and of lipid headgroups, …) nevertheless outstanding questions remain unexplored: • How does the composition of the bilayer affect the EP threshold? • What are the morphology, size and conductance of pores formed? • What are the mechanisms and time scales of translocation of small molecules through the electropores? • Is there any difference when modeling nsPEFs and msPEFs? As part of the present work, using MD simulations and comparing our results to other findings from our group, we addressed some relevant questions. We quantified the EP threshold of libid bilayes for the increasing concentration of cholesterol (0, 20, 30, 50 mol %) when the two protocol to model nsPEFs and msPEFs are exploited. The results obtained applying the two approaches indicate that in both cases an increase in cholesterol concentration requires a higher transmembrane voltage to porate the membrane bilayer. We developed a procedure, mimicking msPEFs, to stabilize electropores under different transmembrane voltages in mechanical condition similar to experiments for a time long enough to determine the pore dimension, its conductance and selectivity to ion species. We employed the same method to investigate the transport of small charged molecules, used in drug delivery, comparing our findings with similar studies conducted under nsPEFs conditions with the attempt to rationalize the molecular uptake. Interestingly we found that that the dynamic of the transport process takes place in the same time scale (nanosecond) that for nsPEFs. Despite the fact that nsPEFs have the advantage to affect both cell membranes and internal organelles and to further reduce thermal effects, the possibility to exploit nsPEFs for drug delivery is an ongoing research since the ability to reliably deliver to biological loads these ultra-short intense pulses is not trivial. Particular attention must be paid in the design of microchambers to realize a broadband devices to transmit without attenuation and distortion nsPEF, which exhibit large spectral components, i.e. spanning from MHz up to GHz. An important part of the current work has been devoted to the design (with Finite Element Method) of an exposure device, based on microwave propagating systems, able to deliver pulses down to 1 ns with rise and fall time of 0.5 ns

Une des clés pour comprendre les mécanismes d’action biologiques des molécules naturelles et thérapeutiques est leur faculté à incorporer ou traverser les membranes lipidiques. Parce que les méthodes expérimentales sont parfois couteuses et répondent partiellement aux questions posés par les interactions composé-membrane, la modélisation moléculaire est devenue une sérieuse alternative. Les simulations de dynamique moléculaire ont ouvert de nombreuses perspectives ces dernières années en offrant la possibilité de décrire ces interactions intermoléculaires au niveau atomique. À l’aide de ces simulations, nous avons évalué la capacité de plusieurs composés (polyphénols, vitamines E et C, plantazolicine et carprofènes) à s’incorporer dans les membranes. Ces molécules ont été choisies pour leurs activités biologiques diverses, à savoir (i) activité antioxydante, précisément inhibition de la peroxydation lipidique, (ii) activité antibiotique et possibilité de former un pore transmembranaire, et (iii) inhibition d’enzymes impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Leurs positions et orientations ainsi que leur capacité à s’accumuler ou à traverser les membranes ont été évaluées pour comprendre leurs mécanismes d’action.Dans le but d’utiliser les simulations de dynamique moléculaire en drug design, l’accent a été mis sur la précision des calculs, qui dépend de la qualité sous-jacente du modèle utilisé. En corrélant données expérimentales et théoriques, la méthodologie de nos modèles a été systématiquement revisitée. Le choix du champ de force, les paramètres des composés étudiés ainsi que la composition de la membrane sont en particulier apparus comme d’importants facteurs dans la description des interactions entre les molécules naturelles et thérapeutiques et les membranes. Des mélanges de lipides contenant du cholestérol ont notamment été utilisés et ont montré un impact significatif sur les résultats obtenus. / One of the key lockers to understand mechanisms of biological action of drugs and natural compounds is their capacity to incorporate/cross lipid bilayer membranes. In the light of demanding experimental techniques, in silico molecular modelling has become a powerful alternative to tackle these issues. In the past few years, molecular dynamics (MD) has opened many perspectives, providing an atomistic description of the related intermolecular interactions. Using MD simulations, we have explored the capacity of several compounds (polyphenols, vitamins E and C, plantazolicin, carprofens) to incorporate lipid bilayer membranes. The different compounds were chosen according to their different biological functions, namely (i) antioxidant activity against lipid peroxidation, (ii) antimicrobial activity with the possibility of trans-membrane pore formation, and (iii) inhibition of enzymes involved in Alzheimer’s disease. In order to rationalize their mechanisms of action, their position and orientation in membranes as well as their capacity to accumulate or permeate lipid bilayers were assessed. Having in mind a predictive purpose in drug design for MD simulations, the accuracy of the results relies on the quality of the in silico membrane models. By ensuring relationships between experimental and theoretical data, methodological improvements have been proposed. In particular, force field selection, xenobiotic parameterization and bilayer constitution emerged as crucial factors to appropriately depict drug-membrane interactions. For the latter issue, lipid mixtures e.g., including cholesterol have been developed.

Le transfert d'un analogue de lysine au travers de membranes de phospholipides a été étudié. Des simulations de dynamique moléculaire et des calculs d'énergie libre ont été conduits afin d'étudier l'évolution du pKa de cette molécule en fonction de sa position à l'intérieur de la membrane. Des grandeurs cinétiques telles que la perméabilité et les constantes de réaction associées au transfert ont montré que ce processus est susceptible de ce produire sur des échelles de temps appartenant à la ms. La comparaison de ces grandeurs dans des membranes constituées d'étherlipides et de lipides avec des chaînes branchées a été faite par la suite. Les études ont montré une diminution de la perméabilité et une augmentation du temps de passage dans des membranes faites d'étherlipides. L'ajout de méthyles le long des chaînes carbonées augmentent également le temps de passage et la perméabilité mais de manière moins importante. Cependant, le pKa indique que la forme chargée ne peut être retrouvée aussi profondément que dans une membrane constituée de chaînes linéaires. Finalement, le transfert du peptide a été étudié en estimant des surfaces d'énergie libre multidimensionnelles. La coordination de l'amine avec les molécules d'eau dans sa première sphère d'hydratation et la projection de la distance par rapport au centre de la membrane a été étudié. De nouvelles possibilités pour le changement d'état de protonation du peptide sont apparues. Contrairement au cas 1D, la forme neutre peut apparaître déjà dans la région des têtes polaires pour une certaine valeur de la coordination. Ces valeurs, inférieures à celles du milieux aqueux, peuvent être atteintes à l'interface d'après les surfaces déterminées / The transfer of a lysine amino acid analog across phospholipid membrane models was investigated using molecular dynamics simulations. The evolution of the protonation state of this small peptide as a function of its position inside the membrane was studied by determining the local pKa by means of free energy calculations. Permeability and mean first time passage were evaluated and showed that the transferoccurs on the sub-ms time scale. Comparative studies were conducted to evaluate the changes in the local pKa arising from the differences in the phospholipid chemical structure. We compared hence the effect of the ether vs ester linkage of the lipid head group as well as the linear vs branched lipid tails. The study reveals that protonated lysine residues can be buried further inside ether lipid membrane than ester lipid membrane while branched lipids are found to stabilize less the charged form compared to their un-branched lipid chain counterparts. As a result, the permeability and the transfer rate across a membrane constituted by ether lipid was found to slower than in membranes constituted by esterified lipids. Finally, multidimensionnal free-energy surfaces for the transfer of the peptide in its both states, charged and neutral, were estimated. The coordination of the amine with the water molecules in its first hydration shell with the projection of the distance from the center of the membrane were used as reaction coordinates. New possibilities for the deprotonation reaction were found, the latter appearing closer to the headgroup region. This finding suggests that if the lysine analog were less coordinated by water molecule a deprotonation is possible in the headgroup region

Στην παρούσα διπλωματική εργασία παρουσιάζονται Ατομιστικά Μοντέλα Διακριτών και Ενοποιημένων Ατόμων, τα οποία μπορούν να αποτελέσουν το πρώτο σημαντικό βήμα για τη μελέτη της βιολογικής μεμβράνης ή και ακόμα τη μελέτη συστημάτων μεμβρανών με πρωτεΐνες, σάκχαρα κ.α. Τέτοιες προσομοιώσεις θα μας δώσουν στοιχεία για μακροσκοπικές ιδιότητες της μεμβράνης (π.χ. διαχυτότητα) παρουσία συγκεκριμένων άλλων μακρομορίων. Αρχικά μελετάται σε ατομιστικό επίπεδο, με τα μοντέλα Διακριτών και Ενοποιημένων Ατόμων, τήγμα παλμιτικού οξέος (383Κ). Η καταλληλόλητα του νέου μοντέλου που εισήχθη για την περίπτωση των Ενοποιημένων Ατόμων εξετάζεται με βάση τις ιδιότητες διαμόρφωσης (λ.χ. κατανομές γωνιών) που εξάγονται από το μοντέλο Διακριτών Ατόμων. Στο μοντέλο Διακριτών Ατόμων χρησιμοποιήθηκε το αναλυτικότερο δυνατό δυναμικό (COMPASS). Τα αποτελέσματα ήταν άκρως ικανοποιητικά. Έχοντας ένα αξιόπιστο μοντέλο Ενοποιημένων Ατόμων προχωρήσαμε στο επόμενο βήμα. Επόμενο βήμα ήταν η μελέτη συστήματος παλμιτικού οξέος ανάμεσα από στρώμα νερού. Σημαντικό μειονέκτημα του μοντέλου Διακριτών Ατόμων για ένα τόσο μεγάλο σύστημα αποτελεί η περιορισμένη χρονική κλίμακα. Φαινόμενα σχηματισμού διπλοστοιβάδας παλμιτικού οξέος παρουσία νερού, είναι πολύ δύσκολο να μελετηθούν με χρήση μοντέλου Διακριτών Ατόμων λόγω των πολύ μικρών χρόνων που καλύπτουν. Επομένως, κρίνεται αναγκαία η χρήση μοντέλου Ενοποιημένων Ατόμων για το σύστημα PLM – νερό. Χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο Ενοποιημένων Ατόμων που οι ίδιοι αναπτύξαμε, όπως και για την περίπτωση του τήγματος, για την περιγραφή του παλμιτικού οξέος, και το μοντέλο SPCE για το νερό, το οποίο είναι ευρέως αποδεκτό από την επιστημονική κοινότητα. Πέραν της σύγκρισης των μοντέλων Ενοποιημένων και Διακριτών Ατόμων που έγινε για το τήγμα του παλμιτικού οξέος, πραγματοποιήθηκαν και διάφοροι υπολογισμοί που αφορούν τη σταθεροποίηση του συστήματος (Autocorrelation faction of end-to-end distance vector), δομικές ιδιότητες (Radial Distribution Function), ιδιότητες διαμόρφωσης (angle distribution, radius of gyration, end-to-end distance vector) και θερμοδυναμικές ιδιότητες (density). Υπολογίστηκαν επίσης ο συντελεστής αυτοδιάχυσης (self diffusion coefficient) καθώς και το πλήθος δεσμών υδρογόνου. / This diploma thesis presents Atomistic Models of Discrete and Integrated atoms, which can be an important first step to study the biological membrane or even studying membrane systems with proteins, sugars, etc. Such simulations will give us data on macroscopic membrane properties (eg diffusivity) in the presence of certain other macromolecules. Initially we study melt palmitic acid (383K)in atomistic level. The suitability of the new model, introduced for the case of the Consolidated Atoms is examined by checking the configuration properties (eg angles distributions) derived from the model of Discrete Atoms. In the model of discrete atoms the disaggregated possible dynamic (COMPASS)was used. The results were highly satisfactory. Having a reliable model for Unified atoms we move to the next step. Next step was to study the system of palmitic acid between waterbed. Major drawback of the model of Discrete atoms for such a large system is the limited time scale. Phenomena of bilayer formation of palmitic acid in the presence of water is very difficult to be studied using discrete atoms model because of very short times covered. Therefore, it is necessary to use a model of integrated atoms for the system PLM - water. We used the model of Unified atoms we ourselves have developed, as in the case of the melt, for the description of palmitic acid, and the SPCE model for water, which is widely accepted by the scientific community. Beyond the comparison of models of integrated and discrete atoms made for the melt of palmitic acid, various calculations for the stabilisation the system (Autocorrelation faction of end-to-end distance vector), structural properties (Radial Distribution Function), properties configuration (angle distribution, radius of gyration, end-to-end distance vector) and thermodynamic properties (density)were made. The self-diffusion coefficient (self diffusion coefficient) and the number of hydrogen bonds were also calculated.

The presented thesis investigates the transfer of drug molecules across interfaces that mimic biological membrane barriers. The permeability of drug molecules across biological membrane mimics has been investigated in a novel artificial membrane permeation assay configuration using an in situ time-dependent approach and reproducible rotation of the membrane. A method to determine the membrane permeability from the knowledge of measured permeability and the applied stirring rate is presented. The initial transient of the permeation response, previously not observed in situ, is investigated and its importance in data evaluation is discussed. The permeability coefficients of 31 drugs are optimised for the conditions found in vivo and a correlation with the fraction absorbed in humans is presented. The evidence for ionic and/or ion-pair flux across the artificial membrane obtained from measurement of permeability at different pH is supported by the investigation of the permeation assay with external membrane polarisation. The permeability coefficient of the solute's anionic form is determined. Liquid/liquid electrochemistry has been used to study the transfer of ionized species across the interface between water and 1,2-dichloroethane. An alternative method to study the transfer of partially ionised drug molecules employing a rotating liquid/liquid interface is presented. In addition, a bipolar electrochemical cell with a rotating-disc electrode is developed and its properties investigated in order to verify the hydrodynamics of the rotating artificial membrane configuration. Finally, in support of the electrochemical techniques used is this thesis, a detailed preparation and evaluation of the silver/silver sulphate reference electrode is presented.

Cette thèse a pour objectif de contribuer à la modélisation, à la simulation et à l’analyse des signaux contenant des potentiels d’action extracellulaires (EAPs), tels que mesurés in-vivo par des microélectrodes implantées dans le cerveau. Les modèles actuels pour la simulation des EAPs consistent soit en des modèles compartimentaux très détaillés et lourds en calcul, soit en des modèles dipolaires jugés trop simplistes. Dans un premier temps, une approche de simulation des EAPs se situant entre ces deux extrêmes est proposée, où la somme des contributions des compartiments du neurone est traitée comme une convolution, appliquée aux courants membranaires d’un seul compartiment actif. L'analyse des EAPs passe par une étape de classification des potentiels d'action détectés dans le signal enregistré, qui consiste à discriminer les formes de potentiels d’action et ainsi à identifier l'activité de neurones uniques. Dans cette thèse, une nouvelle approche basée sur l’inférence bayésienne est développée permettant l'extraction et la classification simultanées des EAPs. La méthode est appliquée à des signaux générés à l'aide de l'approche de simulation proposée plus haut, confirmant la qualité de la méthode de classification introduite et illustrant la capacité de la méthode de simulation à générer des EAPs réalistes de formes diverses et discriminables. Nous avons enrichi une modélisation de l’activité hippocampique réalisée dans l’équipe permettant de reproduire des oscillations dans ces bandes fréquentielles spécifiques en introduisant les EAPs, ceci afin d’évaluer les contributions de l'activité synaptique et celle des potentiels d’action à certaines bandes de fréquence des signaux enregistrés. Finalement, une étude sur signaux réels enregistrés dans le cadre de l'étude de la perception des visages chez l'homme a été menée, illustrant les performances de la méthode de spike sorting proposée dans un cadre réel et ouvrant la discussion sur les perspectives qu'offrent ces travaux de thèse pour l'étude de questions neuroscientifiques basées sur l'analyse de signaux multi-échelle. / The objective of this thesis is to contribute to the modelling, simulation and analysis of signals containing extracellular action potentials (EAPs), as measured in vivo by microelectrodes implanted in the brain. Current models for the EAPs simulation consist either of very detailed and computationally heavy compartmental models or dipole models considered too simplistic. An EAP simulation approach between these two extremes is proposed, where the sum of the contributions of the neuron compartments is treated as a convolution, applied to the membrane currents of a single active compartment. The analysis of EAPs involves a step of classifying the action potentials detected in the recorded signal, which consists in discriminating the forms of action potentials and thus identifying the activity of single neurons In this thesis, a new approach based on Bayesian inference is developed allowing the simultaneous extraction and classification of EAPs. The method is applied to signals generated using the simulation approach proposed above, confirming the quality of the sorting method introduced and illustrating the ability of the simulation method to generate realistic EAPs of various and discriminatory forms. We modified a model of hippocampal activity previously proposed in our team, able to reproduce oscillations in specific frequency bands, by including the EAPs model, which allowed to evaluate the contributions of synaptic activity and that of action potentials the recorded signals. Finally, a study on real signals recorded as part of the study of face perception in humans is conducted, illustrating the performance of the proposed spike sorting method in a real setting and opening the discussion on the perspectives offered by this thesis work for the study of neuroscientific questions based on multiscale signal analysis.