Η αποαδενυλίωση είναι συνήθως στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και καταστολής της μετάφρασης του mRNA. Το γεγονός αυτό καθιστά την αποαδενυλίωση ως το κυριότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Οι αποαδενυλάσες είναι εξωριβονουκλεάσες εξαρτώμενες από Mg2+ που υδρολύουν το mRNA με κατεύθυνση 3’-5’, παράγοντας 5’-AMP. Ο αριθμός των γνωστών αποαδενυλασών έχει επεκταθεί πρόσφατα, κυρίως μέσω βιοχημικών και γενετικών μελετών. Όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν σε μία από της δύο ομάδες, την DEDD ή την exonuclease– endonuclease–phosphatase (EEP) υπέρ-οικογένεια. ∆εν είναι ακόμη πλήρες κατανοητό το πλεονέκτημα της ύπαρξης τόσων πολλών αποαδενυλασών. Υποψήφιες αποαδενυλάσες έχουν ταυτοποιηθεί με χρήση προγραμμάτων βιοπληροφορικής, ωστόσο η δράση τους δεν έχει αποδειχθεί, όπως η PNLDC1. Αρχική βιοπληροφορική ανάλυση του γονιδίου pnldc1 έδειξε ότι κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη η οποία παρουσιάζει ομολογία με την PARN με πετιδικό σήμα που σχετίζεται με μια διαμεμβρανική περιοχή της πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα φαίνεται ότι ο υποκινητής του γονιδίου περιέχει νησίδες CpG. Με μοντελοποίηση με βάση την ομολογία με την ανθρώπινη PARN της περιοχής με δράση νουκλεάσης προβλέφθηκε μία δομή που περιέχει ενεργό κέντρο με τα χαρακτηριστικά κατάλοιπα DEDD να κατευθύνονται σωστά για να αλληλεπιδρούν με τα ιόντα Mg2+ και να υποστηρίζουν ενζυμική δράση. Το γονίδιο pnldc1 κλωνοποίηθηκε και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη καθαρίσθηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Πειράματα αποαδενυλίωσης έδειξαν ότι η PNLDC1_1 είναι μία αποαδενυλάση με υψηλή συγγένεια γα το υπόστρωμα poly(A) αλλά χαμηλή Vmax σε σχέση με την PARN. Η έκφραση του pnldc1 μπορεί να ρυθμιστεί μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή. Ύστερα από χορήγηση του απομεθυλιωτικού 5-Aza- Deoxycytidine, η έκφραση του pnldc1 αυξήθηκε 4 φορές στις κυτταρικές σειρές HaCaT και HEK 293 T ενώ τα επίπεδα των PARN και CNOT7 mRNA παρέμειναν αμετάβλητα, υποδεικνύοντας πιθανόν έναν μοναδικό ρόλο της νέας αποαδενυλάσης στην γονιδιακή έκφραση κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης και διαφοροποίησης. Η αποαδενυλάση PAN2 είναι μέλος της οικογένειας των DEDD νουκλεασών και ξεκινάει την βράχυνση του poly(A) απομακρύνοντας σχεδόν την μισή ουρά μέχρι άλλες αποαδενυλάσες να αποικοδομούν την υπόλοιπη. Παρόλο που ο ρόλος της PAN2 στην αποικοδόμηση του mRNA είναι διευκρινισμένος ο βιολογικός ρόλος του ενζύμου δεν έχει αποσαφηνισθεί. Μετά από αποσιώπηση της PΑΝ2 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης των mRNA PARN, Papola, CBP20 και MYC ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή στα επίπεδα EIF4E και CNOT7. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η PAN2 εμπλέκεται στην γονιδιακή έκφραση πιθανόν με το να διεγείρει την αποικοδόμηση των ήδη υπαρχόντων μορίων mRNA επιτρέποντας την παραγωγή νέων. / Deadenylation is often a rate-limiting step for mRNA decay and translational silencing, making it an ideal control point for both processes. Deadenylases are Mg2+ -dependent exoribonucleases that hydrolyse RNA in the 3′→5′ direction, which results in release of 5′- AMP. The number of known deadenylases has recently expanded, mainly through biochemical and genetics studies. All known deadenylases belong to one of two groups, the DEDD or the exonuclease–endonuclease–phosphatase (EEP) superfamilies. The advantage of having such a range of deadenylases is not yet completely understood. Putative deadenylases have been identified through bioinformatics, but their functions has not yet been established such as the mammalian PNLDC1 which is a Poly(A)-specific Ribonuclease homolog (termed PARN-like). Preliminary bioinformatic analysis of the pnldc1 gene revealed that it encodes a PARN-similar protein with a signal peptide which corresponds to a trans-membrane region. In addition several CpG islands within the gene’s promoter were identified. Homology modeling of the nuclease domain with its human PARN homolog predicted a structure that forms an active site which contains the characteristic DEDD residues orientated correctly to interact with Mg2+ ions to support enzymatic activity. Pnldc1 was cloned and the recombinant protein was purified via affinity chromatography. Deadenylation assays showed that PNLDC1_1 is a deadenylase with high affinity for poly(A) substrates but relatively low Vmax compared to PARN. Interestingly, pnldc1 expression can be regulated through promoter methylation. Following treatment with the demethylating agent, 5-Aza-Deoxycytidine, pnldc1 expression was increased 4-fold in both HaCaT and HEK 293 T cell lines, whereas PARN and CNOT7 mRNA expression was unchanged, thus implying a possible unique role of this new deadenylase in gene expression during embryogenesis and differentiation. PAN2 deadenylase, a member of the DEDD nucleases initiates poly(A) degradation removing almost half of the tail when other nucleases degrade the rest of the tail. Although the role of PAN2 in mRNA degradation has been revealed, its biologic function has not been studied. On knockdown of PAN2 a significant reduction was observed in the levels of PARN, Papola, CBP20 and MYC, but no significant change changes were observed in the levels of EIF4E and CNOT7 mRNA expression. Our results indicate that PAN2 is involved in gene expression, this probably by triggering the degradation of the current messengers allowing production of new messengers.

Pseudoknots are essential for the functioning of many small RNA molecules. In addition, viral RNAs often exhibit pseudoknots that are required at various stages of the viral life-cycle. Techniques for detecting evolutionarily conserved, and hence most likely functional RNA pseudoknots, are therefore of interest. Here we present an extension of the alidot approach that extracts conserved secondary structures from a multiple sequence alignment and predicted secondary structures of the individual sequences. In contrast to purely phylogenetic methods, this approach yields good results already for small samples of 10 sequences or even less.

Starting with the discovery of microRNAs and the advent of genome‐wide transcriptomics, non‐protein‐coding transcripts have moved from a fringe topic to a central field research in molecular biology. In this contribution we review the state of the art of “computational RNomics”, i.e., the bioinformatics approaches to genome‐wide RNA annotation. Instead of rehashing results from recently published surveys in detail, we focus here on the open problem in the field, namely (functional) annotation of the plethora of putative RNAs. A series of exploratory studies are used to provide non‐trivial examples for the discussion of some of the difficulties.

Dynamic Programming Algorithms solve many standard problems of RNA bioinformatics in polynomial time. In this contribution we discuss a series of variations on these standard methods that implement refined biophysical models, such as a restriction of RNA folding to canonical structures, and an extension of structural alignments to an explicit scoring of stacking propensities. Furthermore, we demonstrate that a local structural alignment can be employed for ncRNA gene finding. In this context we discuss scanning variants for folding and alignment algorithms.

The 7SK small nuclear RNA (snRNA) is a key player in the regulation of polymerase (pol) II transcription. The 7SK RNA was long believed to be specific to vertebrates where it is highly conserved. Homologs in basal deuterostomes and a few lophotrochozoan species were only recently reported. On longer timescales, 7SK evolves rapidly with only few conserved sequence and structure motifs. Previous attempts to identify the Drosophila homolog thus have remained unsuccessful despite considerable efforts. Here we report on the discovery of arthropod 7SK RNAs using a novel search strategy based on pol III promoters, as well as the subsequent verification of its expression. Our results demonstrate that a 7SK snRNA featuring 2 highly structured conserved domains was present already in the bilaterian ancestor.

7SK RNA is a highly abundant noncoding RNA in mammalian cells whose function in transcriptional regulation has only recently been elucidated. Despite its highly conserved sequence throughout vertebrates, all attempts to discover 7SK RNA homologues in invertebrate species have failed so far. Here we report on a combined experimental and computational survey that succeeded in discovering 7SK RNAs in most of the major deuterostome clades and in two protostome phyla: mollusks and annelids. Despite major efforts, no candidates were found in any of the many available ecdysozoan genomes, however. The additional sequence data confirm the evolutionary conservation and hence functional importance of the previously described 3´ and 5´ stemloop motifs, and provide evidence for a third, structurally well-conserved domain.

A plethora of new functions of non-coding RNAs have been discovered in past few years. In fact, RNA is emerging as the central player in cellular regulation, taking on active roles in multiple regulatory layers from transcription, RNA maturation, and RNA modification to translational regulation. Nevertheless, very little is known about the evolution of this \Modern RNA World' and its components. In this contribution we attempt to provide at least a cursory overview of the diversity of non-coding RNAs and functional RNA motifs in non-translated regions of regular messenger RNAs (mRNAs) with an emphasis on evolutionary questions. This survey is complemented by an in-depth analysis of examples from different classes of RNAs focusing mostly on their evolution in the vertebrate lineage. We present a survey of Y RNA genes in vertebrates, studies of the molecular evolution of the U7 snRNA, the snoRNAs E1/U17, E2, and E3, the Y RNA family, the let-7 microRNA family, and the mRNA-like evf-1 gene. We furthermore discuss the statistical distribution of microRNAs in metazoans, which suggests an explosive increase in the microRNA repertoire in vertebrates. The analysis of the transcription of non-coding RNAs (ncRNAs) suggests that small RNAs in general are genetically mobile in the sense that their association with a hostgene (e.g. when transcribed from introns of a mRNA) can change on evolutionary time scales. The let-7 family demonstrates, that even the mode of transcription (as intron or as exon) can change among paralogous ncRNA.

This thesis develops probabilistic models of RNA secondary structure. The first chapter introduces RNA secondary structure prediction, in particular stochastic context-free grammars (SCFGs), and considers a novel method for automated design of SCFGs. Many SCFGs are found with a similar predictive quality as those commonly used for RNA secondary structure prediction. The second chapter discusses the effect alignment quality, evolutionary distance between sequences, and number of sequences in an alignment have on RNA secondary structure prediction. By combining statistical alignment and SCFG models we can, in a statistically sound setting, average structure predictions over the space of alignments to decrease loss created by poor alignments. The third chapter incorporates additional biological information about RNA secondary structure formation into the decoding of the SCFG posterior distribution. Combining iterative helix formation, phylogenetic modelling, and a distance function between alignment columns leads to the an improvement in the accuracy of comparative RNA secondary structure prediction. Finally, appendices briefly discuss further work concerning probabilistic models of RNA secondary structure which may be of interest to the reader.

Les amplifications de répétitions de triplets CTG dans le gène DMPK humain sont à l'origine de la dystrophie myotonique de type 1 ou DM1. Les répétitions CUG présentes dans les ARNm DMPK séquestrent le facteur d'épissage MBNL1 au sein de foci nucléaires et dérégulent l'épissage des pré-ARNm cibles de MBNL1. Par ailleurs, 9 isoformes de MBNL1, produites par épissage alternative, coexistent dans les cellules. Dans un premier temps nous avons recherché quels exons constitutifs ou alternatifs étaient requis pour la reconnaissance des ARN, la régulation de l'épissage et la localisation cellulaire de MBNL1. Nous avons ensuite entrepris de rechercher par l'approche SELEX les séquences de haute affinité pour MBNL1. Nous avons ainsi identifié une séquence conservée de 12 nucléotides de long, contenant un seul motif de fixation pour MBNL1 et adoptant une structuration tige-boucle particulière. L'importance de cette structuration a été confirmée par l'existence de mutants compensatoires au sein des ARN sélectionnés. Finalement nous avons étudié les mécanismes de régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm de la troponine T cardiaque humaine (hcTNT). Une approche in cellulo nous a permis d'identifier les séquences minimales requises pour la régulation de l'épissage en conditions normales et en présence des répétitions CUG. Au sein de ces séquences nous avons identifié 6 nouveaux sites MBNL1 dont nous avons montré l'importance fonctionnelle in cellulo et in vitro. Nous avons également mis en évidence l'implication d'autres séquences régulatrices dans la régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm hcTNT et un rôle de la protéine hnRNP H dans ces régulations. L'ensemble de ces données apportent de nouveaux éléments d'information importants pour la compréhension de la DM1 / Amplifications of CTG motifs in the human DMPK gene are responsible for Myotonic Dystrophy of type 1. The resulting CUG repeats in pre-mRNAs capture the MBNL1 splicing factor, leading to mis-regulation of MBNL1 pre-mRNA targets. Due to the recent discovery of MBNL1 and its numerous isoforms (9) resulting from alternative splicing, little is known on how MBNL1 regulates splicing and how a decreased level of available MBNL1 generates splicing miss-regulations. First, we defined which of the MBNL1 alternative and constitutive exons are required for: i) RNA binding, ii) splicing activity and, iii) MBNL1 sub-cellular localization. Second, for a more precise definition of the MBNL1 RNA binding properties, we performed SELEX experiments using a library of RNA stem-loop structures containing a 18-nt long randomized sequence. Its leads to the identification of 12-nt long sequence adopting a peculiar stem-loop structure, whose importance for MBNL1 binding was revealed by its preservation by compensatory base-pair mutations. Finally, based on the above data, we studied the mechanisms involved in regulation of hcTNT exon 5 splicing. By in cellulo assays, we defined the hcTNT pre-mRNA region required for both normal inclusion and for the trans-dominant effect of CUG repeats. Within this region, we identified six new potential MBNL1 sites and demonstrated their functional role by in vitro and in cellulo assays. We also identified several additional splicing regulatory elements involved in normal and CUG-deregulated exon 5 inclusion and already showed a role of hnRNP H in splicing regulation. Altogether, our data bring new information important for understanding the pathology

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα πανταχού παρόν ένζυμο, το οποίο θραύει ενδονουκλεολυτικά τα πρόδρομα μετάγραφα των tRNA, παράγοντας τα ώριμα 5΄ άκρα τους. Πρόσφατα, βρέθηκε πως η RNase P συμμετέχει στην μεταγραφή γονιδίων που κωδικοποιούν tRNA, rRNA και άλλα μικρά μη κωδικοποιούντα RNA. Η RNase P έχει ανιχνευθεί σε αντιπροσώπους και των τριών περιοχών της ζωής (βακτήρια, αρχαία, ευκαρυώτες), καθώς επίσης σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες, με μοναδική εξαίρεση το αρχαίο Nanoarchaeum equitans. Σε σχεδόν όλους τους οργανισμούς, η RNase P είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από μία απαραίτητη RNA υπομονάδα και ποικίλο αριθμό πρωτεϊνών. Υπάρχουν μόνο δύο, πρόσφατα, αναφερόμενες εξαιρέσεις, αυτές των ανθρώπινων μιτοχονδρίων και των πλαστιδίων του φυτού A. thaliana, των οποίων η RNase P είναι αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η RNA υπομονάδα είναι υπεύθυνη για την καταλυτική λειτουργία του ολοενζύμου της RNase P από τα βακτήρια, τα αρχαία και τους ευκαρυώτες. Οι πρωτεϊνικές υπομονάδες είναι απαραίτητες για την κατάλυση in vivo και παίζουν πολλούς ρόλους στη δομή και λειτουργία του ολοενζύμου. Η πυρηνική RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι το πιο πλούσιο, σε πρωτεϊνική σύσταση, ολοένζυμο ανάμεσα στα ευκαρυωτικά ένζυμα RNase P που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια RNA υπομονάδα και οχτώ πρωτεΐνες (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). Αυτές οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν ομοιότητες με τις ομόλογές τους από ανώτερα ευκαρυωτικά ένζυμα, όπως του ανθρώπου, ενώ παράλληλα διατηρούν ιδιοσυγκρασιακά χαρακτηριστικά. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφουμε την κλωνοποίηση και τις ιδιότητες αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης DRpp29 με την RNA υπομονάδα της RNase P του D. discoideum. Πειράματα ηλεκτροφορητικής κινητικότητας έδειξαν, πως η DRpp29 δεσμεύεται ειδικά με την RNA υπομονάδα, ένα χαρακτηριστικό που επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τον σχεδιασμό του μοντέλου της δομής της DRpp29. Επιπλέον, κατασκευάστηκαν μεταλλάγματα απολοιφής της DRpp29, για να μελετηθούν οι περιοχές της DRpp29 που συνεισφέρουν ή/και είναι υπεύθυνες για την άμεση αλληλεπίδρασή της με την RNA υπομονάδα. Εντοπίστηκε μια περιοχή, μεταξύ των ευκαρυωτικών ομολόγων, πλούσια σε λυσίνες και αργινίνες, η οποία φαίνεται να διευκολύνει την αλληλεπίδραση των δύο αυτών υπομονάδων. Προσδιορίσαμε, επίσης, με τη διεξαγωγή ανάλυσης αποτυπώματος και τη χρήση δεδομένων βιοπληροφορικής, τη δευτεροταγή δομή της RNA υπομονάδας της RNase P του D. discoideum. Με ανάλυση αποτυπώματος αποκαλύφθηκε, πως η DRpp29 αλληλεπιδρά με την περιοχή εξειδίκευσης (“S-domain”) της RNA υπομονάδας, δείχνοντας, ότι η DRpp29 επηρεάζει την ικανότητα δέσμευσης του υποστρώματος από το ένζυμο. Στη συνέχεια, ελέγχθη η ικανότητα της DRpp29 και των μεταλλαγμάτων της να σχηματίζουν, μαζί με την RNA υπομονάδα του E. coli, ενεργά ενζυμικά σύμπλοκα με δραστικότητα RNase P. Τέλος, ελέγχθη ο σχηματισμός ενός ελάχιστα καταλυτικού πυρήνα της RNase P του D. discoideum, με την πραγματοποίηση πειραμάτων ομόλογης ανασύστασης με την DRpp29, τον πρωτεϊνικό της συνεργάτη DRpp21 και την RNA υπομονάδα / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous enzyme, which endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. Recently, RNase P has been found to participate in the transcription of tRNA, rRNA and other small non-coding RNA genes. RNase P occurs in representatives of all domains of life (bacteria, archaea, eukarya), as well as in mitochondria and chloroplasts, apart from the archeon Nanoarchaeum equitans. In almost every organism, RNase P is a ribonucleoprotein complex, with one essential RNA and a multiple number of protein subunits. There are only two exceptional cases, that of the human mitochondria and the plastids from A. thaliana, whose RNase P lacks an RNA subunit. The RNA subunit is responsible for the main catalytic function of the RNase P holoenzyme in bacteria, archaea and eukarya. Protein subunits are essential for catalysis in vivo and they play multiple roles in structure and function of the holoenzyme. Dictyostelium discoideum nuclear RNase P is the most proteinaceous holoenzyme among the eukaryal RNase P studied so far. It’s a ribonucleoprotein complex, which consists of one RNA and eight protein subunits (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). These proteins display similarities with its counterparts from higher eukaryotes, such as the human enzyme, but at the same time they retain distinctive characteristics. In the present study, we report the molecular cloning and interaction details of DRpp29 and RNase P RNA. Electromobility shift assays exhibited that DRpp29 binds specifically to the RNase P RNA subunit, a feature that was further confirmed by the molecular modeling of the DRpp29 structure. Moreover, deletion mutants of DRpp29 were constructed in order to investigate the domains of DRpp29 that contribute to and/or are responsible for the direct interaction with the D. discoideum RNase P RNA. A eukaryotic specific, lysine and arginine rich region was revealed, which seems to facilitate the interaction between these two subunits. We determined the D. discoideum RNase P RNA secondary structure based on footprinting analysis and bioinformatic data. Furthermore, footprinting analysis revealed that DRpp29 interact with the specificity domain (“S-domain”) of the RNA subunit, suggesting that DRpp29 influence the enzyme’s substrate binding ability. Furthermore, we tested the ability of wild type and mutant DRpp29 to form active RNase P enzymatic particles with the E. coli’s RNase P RNA. Finally, we tested the formation of a minimal catalytic core of the D. discoideum RNase P, by performing homologous reconstitution experiments with DRpp29, its protein partner DRpp21 and the RNA subunit