La biogenèse des ribosomes matures et fonctionnels est notamment dépendante de petites particules ribonucléoprotéiques composées d’ARN et de protéines, les snoRNP (small nucleolar RiboNucleoProteins). Celles-ci sont subdivisées en deux familles : les snoRNP à boîtes C/D et les snoRNP à boîtes H/ACA. Ces deux classes de snoRNP catalysent des modifications chimiques, respectivement de 2’-O-méthylation et de pseudouridylation, sur des positions spécifiques des ARN ribosomiques (ARNr), ou sont impliquées dans des clivages du long ARNr précurseur. Les snoRNP à boîtes C/D sont composées d’un snoARN à boîtes C/D servant de guide pour cibler la position à modifier, et d’un jeu invariant de quatre protéines : Snu13p/SNU13, Nop1p/Fibrillarine, Nop56p/NOP56 et Nop58p/NOP58 (levure/Homme). Ces snoRNP sont produites par la cellule grâce à la présence de plusieurs complexes protéiques constituant une machinerie pour leur assemblage. Outre plusieurs facteurs protéiques déjà connus dans la biogenèse de snoRNP à boîtes C/D comme les protéines Rsa1p/NUFIP, Hit1p/ZNHIT3 et les protéines du complexe R2TP, d’autres protéines pourraient compléter cette machinerie. Parmi ces facteurs additionnels, la protéine Bcd1p/ZNHIT6, pour Box C/D snoRNA protein 1, est essentielle pour maintenir spécifiquement la stabilité in vivo des snoARN à boîtes C/D, et des associations ont pu être identifiées entre Bcd1p/ZNHIT6 avec différents partenaires protéiques de la machinerie d’assemblage de ces particules. Toutefois, l’étape d’assemblage où Bcd1p/ZNHIT6 intervient et la fonction qu’elle y accomplit demeurent inconnues. L’utilisation d’outils in vivo et in vitro chez la levure S. cerevisiae et chez les mammifères nous ont permis de progresser dans la compréhension de la fonction de Bcd1p/ZNHIT6 dans l’assemblage des snoRNP à boîtes C/D. Bcd1p est un facteur d’assemblage recruté de manière co-transcriptionnelle sur les loci codant les snoARN à boîtes C/D et est requis pour le recrutement des complexes d’assemblage sur les snoARN en cours de transcription. Plus spécifiquement, Bcd1p affecte l’interaction de Nop58p avec le facteur d’assemblage Rsa1p, suggérant une fonction dans le recrutement de Nop58p dans une pré-snoRNP en cours d’assemblage. Ce travail a permis d’apporter des informations importantes permettant d’expliquer le caractère essentiel de Bcd1p dans la fonction et la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D / Ribosome biogenesis is especially dependent on the action of small RNA/proteins complexes called small nucleolar ribonucleoproteins (snoRNPs). They are divided into two main families: the so-called box C/D snoRNPs and box H/ACA snoRNPs. Each category performs specific enzymatic processes, 2’-O-methylation and pseudouridylation, respectively, and induces target-specific chemical modification on rRNAs. Few snoRNPs are also essential for pre-rRNA processing. The box C/D snoRNPs are formed by the association of a box C/D snoRNA with a set of four invariant proteins: Snu13p/SNU13, Nop1p/Fibrillarine, Nop56p/NOP56 and Nop58p/NOP58 (yeast/Human). Biogenesis of these RNPs relies on the action of several proteins complexes which constitute a dedicated assembly machinery. Rsa1p/NUFIP, Hit1p/ZNHIT3, and components of the R2TP complex are the best characterized protein actors of this machinery. Additional protein factors probably participate in box C/D snoRNP biogenesis; Bcd1p/ZNHIT6 (Box C/D snoRNA protein 1) is such a candidate as it is essential for the in vivo stability of box C/D snoRNAs, and it was found associated with proteins involved in this machinery in yeast and Human. However, the mechanism governing the recruitment of this protein towards the biogenesis of box C/D snoRNP, and the step of the assembly process relying on the presence of Bcd1p are still unknown. In S. cerevisiae and Human, in vivo and in vitro tools allowed us to improve the understanding of the functions of Bcd1p/ZNHIT6 in box C/D snoRNP assembly. Bcd1p is an assembly factor that is recruited co-transcriptionally on box C/D snoRNA loci, and is required for the recruitment of assembly complexes on nascent snoRNAs. Bcd1p is important for Nop58p association with the assembly factor Rsa1p, which suggests that its primary function is to recruit Nop58p to nascent pre-snoRNPs. This work evidenced important information on the essential role of Bcd1p in C/D snoRNP biogenesis and function

Le séquençage à haut débit est une technique très utile pour l’étude des ARN. Pendant mon doctorat, nous l’avons utilisé pour la caractérisation des ARN extracellulaire (ARNex) du plasma humain. Les ARNex du plasma sont retrouvés soit à l’état soluble sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ou encapsulés au sein de vésicules extracellulaires (VE) de diverses origines (exosomes, microvesicles, …). Dans ce projet, j’ai démontré que le plasma contenait principalement des micro ARN, le fragment hY4 et des ARN ribosomiques dégradés. Par ailleurs, après chromatographie à exclusion de tailles ou par traitement consécutif protéinase K/RNase A, des VE hautement purifiées peuvent être obtenus. Nous ne retrouvons plus en majorité les micro ARN et l’ARN hY4 dans ces échantillons mais plutôt des ARN du microbiote humain, montrant une composition différente entre les ARNex solubles et ceux des vésicules purifiées. Par ailleurs, j’ai également effectué une étude comparative de kits commerciaux qui sont supposés purifier les exosomes par précipitation. La composition en ARN de ces fractions est très similaire au plasma humain total, montrant une forte contamination par les RNP solubles. Ainsi, nous sommes en mesure de proposer un protocole pour l’étude des ARNex dans le cadre de biopsies liquides avec des échantillons cliniques afin de découvrir de potentiels biomarqueurs de diagnostic. Au-delà de la caractérisation d’ARN, le séquençage à haut-débit peut être utilisé pour la détection et quantification des modifications post-transcriptionnelles. Pendant ma thèse, j’ai utilisé le séquençage pour l’analyse des 2’O-méthylation des ARN de transfert chez E. coli par RiboMethSeq. Sous plusieurs conditions de stress (manque de nutriments ou des concentrations non létales d’antibiotiques), certaines 2’O-méthylations montrent une réponse adaptative. Alors que plus de la moitié des 2’O-méthylations en position 18 (Gm18) sont augmentées dans toutes les conditions de stress étudiées, les positions Nm34 montrent un effet opposé avec une diminution dans certains stress (chloramphénicol et streptomycine). Chacun de ces deux comportements peut être relié à un phénomène de régulation cellulaire en réponse au stress : un changement au niveau de la wobble base pourrait être un moyen de réguler la traduction en modifiant l’usage des codons. En ce qui concerne Gm18, son rôle dans l’évasion du système immunitaire inné lors de l’invasion d’un hôte est en cours d’élucidation. / For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNA and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were not present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which are supposed to purify human exosomes by precipitation. Their RNA composition was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments (chloramphenicol and streptomycin). Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated.

Η RNase P είναι το ένζυμο που ωριμάζει το 5΄ άκρο των πρόδρομων μορίων tRNA, ενώ έχει βρεθεί και στις τρεις φυλογενετικές περιοχές, καθώς και σε υποκυτταρικά οργανίδια. Είναι ριβονουκλεοπρωτεϊνικής φύσεως στις περισσότερες περιπτώσεις, ενώ έχουν βρεθεί και ένζυμα RNase P αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η υπομονάδα RNA των βακτηριακών ολοενζύμων είναι καταλυτικά ενεργή απουσία πρωτεϊνικών παραγόντων in vitro, καθιστώντας την ένα πραγματικό ριβοένζυμο. Η ικανότητα της RNase P να αναγνωρίζει συγκεκριμένες δομές στα μόρια των υποστρωμάτων της και όχι αλληλουχίες, δημιούργησε τη δυνατότητα χρήσης αυτού του ενζύμου ως ενός μοριακού εργαλείου για τη στόχευση πολλών ιικών και παθολογικών μορίων RNA in vitro και in vivo, καταστέλλοντας την έκφραση των μορίων αυτών, μέσω της τεχνολογίας των μορίων EGS (external guide sequence) και των ριβοενζύμων M1GS. Η RNase P, σύμφωνα με πολλές μελέτες, έχει δειχθεί ότι αποτελεί στόχο πολλών φαρμακευτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων πολλών γνωστών αντιβιοτικών, οι οποίοι κατά κύριο λόγο αναστέλλουν τη δραστικότητα του ενζύμου. Πρόσφατα δείχτηκε, μέσω αναλυτικής κινητικής μελέτης, ότι ένα μακρολίδιο, η σπιραμυκίνη, ενεργοποιεί σημαντικά τη δραστικότητα της βακτηριακής RNase P και του M1 RNA κατά ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, λειτουργώντας έτσι ως μη-ειδικός ενεργοποιητής μικτού τύπου. Μέχρι σήμερα, στη διεθνή βιβλιογραφία, δεν έχει αναφερθεί άλλη ουσία η οποία προκαλεί θετική επίδραση στη δραστικότητα της RNase P. Στην παρούσα μελέτη, αρχικά μελετήθηκε η ενεργοποίηση της δραστικότητας της βακτηριακής RNase P και αποκαλύφθηκε ότι η σπιραμυκίνη δεν αλληλεπιδρά με ιοντικούς δεσμούς με το μόριο Μ1 RNA, αλλά προκαλεί αλλαγή διαμόρφωσης στο δομικό στοιχείο P10/11 του ριβοενζύμου. Το δομικό αυτό στοιχείο εμπλέκεται στην αναγνώριση του υποστρώματος, αποτέλεσμα το οποίο έρχεται σε συμφωνία με τις τιμές KD που προσδιορίστηκαν για το σύμπλοκο ριβοενζύμου–υποστρώματος, απουσία και παρουσία σπιραμυκίνης. Με δεδομένο ότι η σπιραμυκίνη δεν επηρεάζει την πρωτεϊνοσύνθεση ή τη δραστικότητα της RNase P των ευκαρυωτικών κυττάρων, κατασκευάστηκε ένα ριβοένζυμο M1GS, ώστε να ελεγχθεί η επίδραση του αντιβιοτικού στη δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, σε καλλιεργούμενα ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ293. Ως στόχος του συγκεκριμένου M1GS, επιλέχτηκε ο μεταγραφικός παράγοντας Ets2 λόγω της μεγάλης κλινικής σημασίας του, εφόσον έχει συσχετιστεί με αρκετούς τύπους καρκίνου και παθολογικές καταστάσεις, καθώς και με διαδικασίες διαφοροποίησης. Ο σπουδαίος ρόλος του Ets2, σε συνδυασμό με τα ελλιπή δεδομένα σχετικά με την έκφρασή του, είχαν αποτρέψει μέχρι σήμερα την αποτελεσματική στόχευσή του με τη χρήση των υπαρχουσών μεθοδολογιών που βασίζονται στο RNA, όπως το RNAi. Μετά από ανάλυση της δευτεροταγούς δομής του Ets2 mRNA, σχεδιάστηκαν δύο οδηγοί αλληλουχίες. Οι αλληλουχίες αυτές, αρχικά, δοκιμάστηκαν ως εξωτερικές οδηγοί αλληλουχίες (EGS) σε συνδυασμό με το βακτηριακό ολοένζυμο της RNase P. Η EGS303 (το νούμερο υποδεικνύει το νουκλεοτιδικό κατάλοιπο του στόχου που δρα η RNase P), εμφάνισε τη μεγαλύτερη ικανότητα να επάγει τη δράση της RNase P in vitro. Η οδηγός αυτή αλληλουχία, στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στο 3΄ άκρο του M1 RNA, παράγοντας το ριβοένζυμο M1GS303, το οποίο είναι δραστικό έναντι του μορίου–στόχου του in vitro. Η δραστικότητα του συγκεκριμένου ριβοενζύμου ενεργοποιείται εντυπωσιακά κατά 160% παρουσία σπιραμυκίνης. Προκειμένου να ελεγχθεί η δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, το μόριο–στόχος και το ριβοένζυμο εκφράστηκαν ελεγχόμενα σε κύτταρα E. coli, προκαλώντας μείωση της έκφρασης του μορίου–στόχου από το M1GS303 κατά 95% μετά από 12 ώρες έκφρασης των μορίων. Μείωση στα ίδια επίπεδα ανιχνεύτηκε μόλις μετά από 4 ώρες έκφρασης εφόσον στα κύτταρα είχε προστεθεί σπιραμυκίνη, γεγονός που υποστηρίζει την εντυπωσιακά θετική επίδραση της σπιραμυκίνης επί της δραστικότητας του ριβοενζύμου. Η ίδια σειρά πειραμάτων επαναλήφθηκε σε ευκαρυωτικά κύτταρα, με έκφραση του ριβοενζύμου σε HEK293 κύτταρα. Η δραστικότητα του ριβοενζύμου προσδιορίστηκε ποιοτικά και ποσοτικά, από την έκφραση της χιμαιρικής φθορίζουσας πρωτεΐνης Ets2–EGFP (μόριο–στόχος), σε διαφορετικούς χρόνους έκφρασης. Παρατηρήθηκε ότι το M1GS δρα αποτελεσματικά έναντι του μορίου–στόχου του και σε ευκαρυωτικά κύτταρα in vivo, προκαλώντας μείωση στην έκφραση του Ets2, η οποία αυξάνεται επιπλέον παρουσία σπιραμυκίνης. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν τη σημαντική ενεργοποίηση της δραστικότητας του M1GS σε ανθρώπινα κύτταρα και καθιστούν τη σπιραμυκίνη ένα σημαντικό ενεργοποιητή στη χρήση των ριβοενζύμων M1GS ως εργαλεία γονιδιακής αποσιώπησης. Ο συνδυασμός βελτιωμένων ριβοενζύμων M1GS με την παρουσία σπιραμυκίνης αυξάνει ακόμα περισσότερο την πρακτική χρήση της συγκεκριμένης τεχνολογίας τόσο in vitro όσο και in vivo, επιτυγχάνοντας ακόμα πιο αποτελεσματική αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης. / RNase P is the enzyme that endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. It has been found in all three phylogenetic domains of life, as well as in subcellular organelles. In most cases, it has been described as a ribonucleoprotein complex. However, few RNase P enzymes that are exclusively proteinaceous have been also reported recentrly. The RNA subunit of bacterial holoenzyme is catalytically active in the absence of protein factors in vitro, making it a true ribozyme. The ability of RNase P to recognize specific structures in its substrate molecules instead of specific sequences, allowed the use of this enzyme as a molecular tool for targeting pathological and viral RNA molecules in vitro and in vivo, by suppressing gene expression through the technology of EGS (external guide sequence) and M1GS ribozymes. RNase P, according to numerous studies, has been the target of several pharmaceutical agents, including most of the mainstream antibiotics. It has been shown recently, through analytical kinetic studies that the macrolide spiramycin significantly enhances the activity of bacterial RNase P and M1 in a dose dependent manner, acting as a non-specific mixed-type activator. Until now, no other compound has been reported to induce a positive effect on RNase P activity. In the present study, the enhancement of bacterial RNase P activity by spiramycin was tested initially, and it was revealed that spiramycin does not interact with the M1 RNA molecule through ionic bonds. On the contrary, it induces a conformational change of the P10/11 structural element of M1 RNA, which is mainly responsible for substrate recognition. The above results are in agreement with the KD values determined for the ribozyme-substrate complex, in the absence or in the presence of spiramycin. Since spiramycin does not affect eucaryotic protein synthesis or eucaryotic RNase P activity, an M1GS ribozyme was constructed, in order to examine the effect of spiramycin on the ribozyme activity in vivo, using human HEK293 cells. The target of this M1GS was the transcription factor Ets2, a factor with great clinical importance, since it has been associated with several types of cancer and disease, as well as essential processes during differentiation. The important role of Ets2 in combination with the lack of data on Ets2 expression, had hitherto prevented its effective targeting by using the existing methodologies based on RNA, such as RNAi. After analysis of the secondary structure of Ets2 mRNA, two guide sequences were designed. These sequences were originally tested in trans as external guide sequences (EGS), in combination with the bacterial RNase P. The EGS303 (the number indicates the nucleotide residue cleaved by RNase P), showed an ability to induce RNase P activity in vitro. The guide sequence was then cloned and fused into the 3' end of M1 RNA ribozyme, thus producing the M1GS303 ribozyme, which was found to be effective against the target molecule. The activity of this specific ribozyme is impressively enhanced by 160% in the presence of spiramycin. In order to examine the activity of this ribozyme in vivo, the expression of the target molecule and the ribozyme were induced in E. coli cells. After 12 hours of expression, a reduced level of the target molecule was detected, because of the M1GS303 activity (about 95%). Reduction to similar levels was observed after only 4 hours from the induction of both molecules expression, in the presence of spiramycin. This observation strongly supports spiramycin’s striking positive effect on the ribozyme activity. The same set of experiments was repeated in human HEK293 cells. The activity of the ribozyme was determined qualitatively and quantitatively, by the determination of the expression of the chimeric fluorescent protein Ets2-EGFP (target molecule) at different times of expression. The M1GS ribozyme cleaves efficiently the target molecule in human cells as well in vivo, resulting in a reduction in the expression of Ets2, which is further increased in the presence of spiramycin. This result indicates the significant activation of M1GS activity in human cells, making spiramycin an important activator in using M1GS ribozymes as tools in gene silencing. The combination of improved M1GS ribozymes in the presence of spiramycin, further increases the practical utilization of this technology both in vitro and in vivo, thus achieving an even more effective suppression in gene expression.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο, απολύτως απαραίτητο για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς είναι υπεύθυνο για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των προδρόμων μορίων tRNA. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα και από τις τρεις φυλογενετικές περιοχές (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες), όπως επίσης και από τα ημιαυτόνομα υποκυτταρικά οργανίδια, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες [Frank και Pace 1998, Xiao et al. 2002]. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μια RNA υπομονάδα απαραίτητη για την κατάλυση ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο ποικίλλει από μια στα βακτήρια έως και δέκα στην RNase P του ανθρώπου [Frank και Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. Η RNA υπομονάδα από τα Βακτήρια και ορισμένα Αρχαία παρουσιάζει καταλυτική δραστικότητα απουσία πρωτεϊνών in vitro, σε υψηλή ιοντική ισχύ [Guerrier-Takada et al. 1983, Pannucci et al. 1999]. Παρότι μέχρι στιγμής καμία τέτοια ιδιότητα δεν έχει εντοπιστεί σε ευκαρυωτική RNA υπομονάδα, πιστεύεται ότι στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα ριβοένζυμο [Frank et al. 2000]. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες οι οποίες είναι απαραίτητες για την δραστικότητα του ολοενζύμου. Η πυκνότητα επιπολής που υπολογίσθηκε για την RNase P από το D. discoideum είναι πολύ χαμηλή σε σχέση με τα χαρακτηρισμένα ολοένζυμα ευκαρυωτικής προέλευσης και είναι παρόμοια με αυτή ενός πρωτεϊνικού μορίου [Stathopoulos et al. 1995]. Παρότι έχει αποδειχθεί ότι το ολοένζυμο αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ακριβή σύσταση του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Πρόσφατα εντοπίστηκε το γονίδιο της RNA υπομονάδας της RNase P από το D. discoideum μέσω συγκριτικής φυλογενετικής ανάλυσης, μήκους 369 νουκλεοτιδίων [Marquez et al. 2005]. Χρησιμοποιώντας τις πρωτεϊνικές υπομονάδες Rpp20 και Rpp40 της RNase P του ανθρώπου πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στη τράπεζα δεδομένων της αλληλούχισης του γενωμικού DNA του D. discoideum. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης ήταν η εύρεση δύο ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (drpp20 και drpp40) που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες (DRpp20 και DRpp40) οι οποίες παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις υπομονάδες. Η επαγόμενη πρωτεΐνη DRpp20 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 26,4 KD, pI 5,6 και επιδεικνύει σημαντική ομοιότητα με την χαρακτηρισμένη πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp20 του ανθρώπου (34% ταυτότητα, 56% ομοιότητα σε μήκος 140 αμινοξέων). Όμοια, η πρωτεΐνη DRpp40 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 48,2 KD, pI 5,5 και παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με την πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp40 (26% ταυτότητα, 45% ομοιότητα σε μήκος 302 αμινοξέων). Παρά την συνολική ομοιότητα, τα μοριακά βάρη των DRpp20 και DRpp40 διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με αυτά των ομόλογων πρωτεϊνών τους. Η DRpp20 διαθέτει μια περιοχή χαμηλής πολυπλοκότητας, πλούσια σε κατάλοιπα θρεονίνης, γλουταμίνης και λυσίνης που πιθανόν να συνεισφέρει στο επιπλέον μοριακό βάρος όπως φαίνεται από την στοίχιση με το Clustal W. Τόσο οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων γενωμικών περιοχών όσο και οι περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας σε επίπεδο πρωτεΐνης υπάρχουν σε αφθονία στο D. discoideum [Eichinger et al. 2005] και παραμένει να αποδειχτεί εάν αυτά τα χαρακτηριστικά συνεισφέρουν δομικά ή λειτουργικά στις DRpp. Από βιοπληροφορική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις υπομονάδες των Αρχαίων ή τις εννέα υπομονάδες της ζύμης δεν παρουσιάζει ομοιότητα με τις DRpp20 και DRpp40. Επιπρόσθετα, με την βοήθεια του Pfam αλλά και των προγραμμάτων που συνδέονται με τον MetaServer εντοπίσαμε στην περιοχή 56-126 αμινοξέα της πρωτεΐνης DRpp20 το δομικό μοτίβο των Alba πρωτεϊνών. Η μελέτη των δύο πρωτεϊνών με βάση τον αλγόριθμο PSORT υποδεικνύει ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα για χωροθέτηση στον πυρήνα παρά σε οποιοδήποτε άλλο υποκυτταρικό διαμέρισμα. Στην παρούσα εργασία τα υπό μελέτη γονίδια drpp20 και drpp40 κλωνοποιούνται σε φορέα υπερέκφρασης pET-29 και εισάγονται σε δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)pLysS. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώνονται από το κυτταρικό εκχύλισμα με χρωματογραφία συγγενείας σε στήλη νικελίου. Οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 με την μέθοδο που απομονώνονται παραλαμβάνονται σχεδόν στην φυσική τους μορφή όπως προκύπτει και από τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού. Οι πρωτεΐνες αυτές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων καθώς επίσης και για λειτουργικές μελέτες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Όπως αποδεικνύεται οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 αποτελούν τμήματα του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανιχνεύουν μία ζώνη που συνεκλούεται με την δραστικότητα του ολοενζύμου σε ανάλυση κατά Western. Επιπρόσθετα, η ισχύς αυτής της αλληλεπίδρασης επιτρέπει την κατακρήμνιση καταλυτικά δραστικού ενζύμου με την χρήση των πολυκλωνικών αντισωματών anti-DRpp20 και anti-DRpp40. Μεταξύ των πρωτεϊνών και της RNA υπομονάδας καθώς επίσης του tRNA υποστρώματος αναμένεται να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις RNA πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα των πρωτεϊνών DRpp20 και DRpp40 να αλληλεπιδρούν με μόρια RNA και ιδιαίτερα με μόρια tRNA. Σε μία σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν δοκιμάστηκαν μόρια tRNA, ολικό RNA αλλά και πλασμιδιακό DNA χωρίς όμως κάποιο αποτέλεσμα στις συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η αντίδραση, παρότι άλλες πρωτεΐνες που φέρουν το μοτίβο των Alba πρωτεϊνών έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μόρια DNA ή δίκλωνα τμήματα RNA. Τέλος, για τις DRpp20, DRpp40 αλλά και το ολοένζυμο, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για δραστικότητα ΑΤΡασης κυρίως εξαιτίας της ομολογίας της πρώτης με την Rpp20 του ανθρώπου που διαθέτει τέτοια ιδιότητα, χωρίς να ανιχνεύεται μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης σημαντική ομολογία με αντίστοιχα ένζυμα. Στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν δεν ανιχνεύτηκε δραστικότητα ΑΤΡασης που να σχετίζεται με κάποια από τις δύο πρωτεΐνες ή το ολοένζυμο. Ο απώτερος στόχος μας είναι ο προσδιορισμός της ελάχιστης λειτουργικής δομής καθώς και η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και RNA-πρωτεΐνης στο ολοένζυμο της RNase P. Η ολοκλήρωση της μελέτης θα συμβάλλει στην κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού και της εξέλιξης της ριβονουκλεάσης Ρ από ένα αρχέγονο ριβοένζυμο σε ένα υψηλά οργανωμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous and essential ribonucleoprotein enzyme that matures the 5´ end of all primary tRNA transcripts. It has been studied from a variety of organisms, representing the three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya), as well as from the major subcellular organelles, mitochondria and chloroplasts [Frank and Pace 1998, Xiao et al. 2002]. RNase P enzymes contain a similar in size RNA subunit which is absolutely required for catalysis. However, the size and number of protein subunits of the holoenzyme varies significantly, from one small subunit in bacteria to ten subunits in human RNase P [Frank and Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. The RNA subunit from bacteria and some archaea is catalytically active in vitro in high ionic strength and in the absence of the protein fraction of RNase P [Guerrier-Takada et al.1983, Pannucci et al. 1999]. No such activity has been proven yet for eukaryotic RNA subunit but is still considered to be intrinsically a ribozyme [Frank et al. 2000]. Dictyostelium discoideum RNase P holoenzyme is a ribonucleoprotein complex, consisted of RNA and proteins essential for catalytic activity. Considering its buoyant density, D. discoideum RNase P exhibits one of the most proteinaceous idiosyncrasies, among the characterized holoenzymes of eukaryotic origin [Stathopoulos et al. 1995]. Although it has been established that this enzyme contains both RNA and protein components, very little is known on the exact composition of the ribonucleoprotein complex. A recent report identified a putative RNA subunit of D. discoideum RNase P of length of 369 nucleotides through phylogenetic comparative analysis [Marquez et al. 2005]. Genomic analysis of the available data from D. discoideum sequencing projects, revealed among others the existence of two open reading frames (drpp20 and drpp40) encoding two proteins (DRpp20 and DRpp40) that show significant similarity to previously characterized proteins subunits Rpp20 and Rpp40 from human RNase P. The encoded protein DRpp20 has a predicted molecular mass of 26,4 KD, pI 5,6 and exhibits significant similarity to characterized human RNase P protein subunit, Rpp20 (34% identity, 56% similarity at a length of 140 amino acids). Likewise, the protein DRpp40 of a predicted mass of 48,2 KD and pI 5,5, displays significant similarity to its human counterpart, Rpp40 (26% identity, 45% similarity at a length of 302 amino acids). DRpp20 harbors a region of low complexity (rich in threonine residues) which confers to higher MW in comparison with the human homologue. Such regions have not been encountered so far in proteins of this kind in other organisms. Tandem repeats at the genomic and the protein level, are abundant in D. discoideum [Eichinger et al. 2005] and it remains to be proven if these features contribute to the structure and function of DRpp proteins. To the best of our knowledge no homologues of DRpp20 and DRpp40 have been identified in yeast and archaeal RNase P enzymes. Additionally, pattern search of the D. discoideum protein sequences using MetaServer and Pfam prediction tools identified a DRpp20 region (amino acids 56 to 126) that bears similarity to the Alba domain. PSORT analysis of DRpp20 and DRpp40 predicts that these proteins are likely to localise into the nucleus. In this study the putative ORFs were subcloned into pET-29 expression vector and the recombinant vectors were used for the transformation of BL21(DE3)pLysS. The recombinant polypeptides were purified from the cell extract using Ni2+-nitriloacetic acid agarose column. The purified proteins are isolated in their native form as supported by circular dichroism analysis of the preparations. These preparations were used for the production of polyclonal antibodies as well as functional studies as described below. DRpp20 and DRpp40 are functionally associated with the RNase P ribonucleoprotein catalytic complex. Using anti-DRpp20 and anti-DRpp40 polyclonal antibodies we ascertained the concurrence of DRpp20 and DRpp40 with purified RNase P activity after standard purification schemes. Moreover, the nature of this association permits the precipitation of RNase P activity through antigen-antibody interaction using the same antibodies. RNA-proteins interactions between the protein subunits, the RNA moiety and/or the RNA substrate are expected in the holoenzyme complex, and therefore the ability of DRpp40 and DRpp20 to bind to RNA molecules was investigated. In a series of experiments using a variety of binding partners (plasmids, tRNAs and total RNA), we did not detect any DNA or RNA binding properties for DRpp20 and DRpp40, although other proteins that contain the Alba core interact with DNA or double stranded RNA regions. Although neither DRpp20 nor DRpp40 harbours an ATPase domain, we tested DRpp40 and DRpp20 for ATPase activity mostly due to the latter homology with human Rpp20, which was shown to have ATPase activity. We could not detect any ATPase activity associated with aforementioned proteins or holoenzyme. Our future prospects are the determination of minimal catalytic core and the complete mapping of all protein-protein and RNA-protein interactions within RNase P holoenzyme. The completion of this project will contribute in a decisive manner to the understanding of both the catalytic mechanism and the evolution of RNase P from a primordial ribozyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.

Résumé en français confidentiel / Résumé en anglais confidentiel

Cleavage and polyadenylation are essential pre-mRNA processing reactions maturing the 3’end of almost all protein encoding eukaryotic mRNAs. Analysis of the sequences required for cleavage and polyadenylation in the human melanocortin 4 receptor (MC4R) and the human transcription factors JUNB and JUND pre-mRNAs revealed that, at least for some mammalian genes, 3’end processing of the primary transcript is independent of previously described auxiliary sequence elements located upstream or downstream of the core poly(A) sequences. The analysis of the MC4R poly(A) site, contrary to the current understanding of mammalian poly(A) sites, showed that mutations of the AUUAAA hexamer sequence had no effect on 3’end processing levels while mutations in the short DSE severely reduced cleavage efficiency. The MC4R poly(A) site uses a potent DSE and to direct maximal cleavage efficiency requires only a short upstream adenosine rich sequence. Furthermore, analysis of the endogenous A-rich human JUNB poly(A) signal validated upstream A-rich core sequences as genuine 3’end formation directing sequences in human non-canonical 3’end formation signals. The results show that a minimal human poly(A) site, similar to yeast and plants, can be defined by an adenosine rich sequence adjacent to a U/GU-rich sequence element and a cleavage site. These findings further imply that some human non-canonical poly(A) sites may be recognised via a similar DSE-dependent mechanism and may not require additional auxiliary sequence elements. Finally, results on the analysis of the EDF1 poly(A) signal show that, in a spliced environment, A-rich sequences are also 3’end formation effectors but depend on an competent upstream splicing reaction for efficient definition of the 3’end processing site.

Le syndrome de Hutchinson-Gilford, ou progéria, est une pathologie génétique rare qui se caractérise par des symptômes assimilés à un vieillissement prématuré. Les mutations à l'origine de la progéria affectent le gène LMNA, codant la lamine A, qui joue un rôle majeur dans la formation, la maintenance et la résistance du noyau. Ces mutations activent l'utilisation de sites 5' alternatif ou cryptique d'épissage présents dans l'exon 11 du pré-ARNm LMNA en amont du site normalement utilisé. Nous avons révélé un effet des mutations sur la structure secondaire de l'ARN aux alentours des mutations, qui permet l'augmentation de l'utilisation des sites d'épissage mutants. De plus, nous avons montré l'implication de plusieurs protéines SR (SRSF1, SRSF5 et SRSF6) dans la régulation de l'utilisation des différents sites d'épissage. D'autre part, il a déjà été observé que les noyaux des cellules des patients atteints de progéria contiennent des granules de stress, les nSB, situés dans les régions péricentromériques des chromosomes et contenant des ARN dits satellite III et des facteurs d'épissage. Des nSB similaires sont formés dans les cellules saines suite à divers stress, comme le stress thermique. Il est possible que ces nSB séquestrent ces facteurs d'épissage afin de réguler le profil d'épissage alternatif des cellules pendant la régénération après un stress. Nous avons purifié les protéines associées aux ARN satellite III in vitro afin de trouver de nouveaux composants des nSB et analysé, par emploi de puces jonction-exon, le transcriptome de cellules soumises à un choc thermique, pour mieux comprendre à terme comment la formation des nSB peut affecter l'épissage alternatif / The Hutchinson-Gilford syndrome, also called progeria, is a rare genetic disease, characterized by symptoms that can be assimilated to accelerated natural ageing. Mutations that cause progeria affect the LMNA gene, which codes the lamin A that plays a major role in the shaping, maintenance and resistance of the nucleus. These mutations lead to the activation of alternative or cryptic 5' splice sites located within the exon 11 of LMNA pre-mRNA upstream from the normal 5' splice site. Our work revealed an effect of the mutations on the 2D RNA structure of the splice sites, which contributes to the increased use of the mutant sites. On top of it, we showed the impact of several SR proteins, (SRSF1, SRSF5 and SRSF6) on the regulation of the use of the exon 11 5' splice sites. On the other hand, it was previously observed that cells from progeria patients contain nuclear stress bodies (nSB), located in chromosomal pericentromeric regions and containing satellite III RNAs and several splicing regulatory proteins. Similar bodies are formed in healthy cells submitted to various stresses such as heat shock. A work hypothesis is that those nSBs sequester splicing factors in order to regulate the global alternative splicing profile in cells during the recovery period after stress. We purified proteins associated with satellite III RNAs in vitro, to find new components of the nSBs, and analyzed the transcriptome of cells subjected to heat shock using exon junction microarrays, in order to eventually understand how nSB formation can affect alternative splicing

L’arthrose est la pathologie articulaire la plus répandue et, avec l’allongement de l’espérance de vie, sa prévalence ne cesse d’augmenter. Elle se caractérise par une dégénérescence du cartilage articulaire associée à une inflammation synoviale et un remodelage anormal de l’os sous-chondral, qui résultent en une perte progressive de mobilité et des douleurs très handicapantes. Dans le cartilage, le chondrocyte est le seul type cellulaire et il est responsable de la synthèse des composants de la matrice extracellulaire (collagènes, protéoglycanes). Au cours de l’arthrose, le phénotype du chondrocyte est altéré et la balance synthèse/dégradation des composants matriciels est déséquilibrée en faveur de la dégradation du cartilage. Il n’existe actuellement aucun traitement permettant de ralentir efficacement l’évolution du processus arthrosique, de sorte que la recherche de biomarqueurs pertinents et de cibles thérapeutiques potentielles est en pleine effervescence depuis l’explosion de l’étude des microARNs. Les microARNs sont des petits ARNs non codants régulant négativement l’expression des gènes. On estime que 50% des gènes sont potentiellement régulés par les miARNs. Les miARNs semblent impliqués dans tous les processus biologiques majeurs tels que la différenciation cellulaire, l’apoptose ou encore la cancérisation. Ces petits ARN non codants sont donc des biomarqueurs potentiels très intéressants. Au cours de ces travaux de thèse l’implication des miARN dans la régulation du phénotype chondrocytaire a été étudiée. A partir d’un modèle de perte du phénotype chondrocytaire différencié, provoquée par des repiquages successifs ou une stimulation par l’IL-1β les variations du profil d’expression des miARNs ont été analysées par l’utilisation de puces dédiées. Ces données ont permis de mettre en évidence 43 miARNs candidats dont le cluster miR-23~27b~24-1 et miR-29b. L’étude de la régulation de la production différentielle des miARNs de ce cluster a été entreprise, sans que nous parvenions toutefois à apporter une réponse formelle sur les mécanismes impliqués. Néanmoins, nous avons identifié miR-29b comme un régulateur négatif de l’expression du gène codant Col-IIa1 au cours de la perte du phénotype différencié, ainsi que chez les chondrocytes « arthrosiques ». Enfin, comme il a été montré au laboratoire que l’équilibre entre les concentrations extracellulaires de pyrophosphate/phosphate inorganique (ePi/ePPi) était essentiel au maintien du phénotype chondrocytaire différencié, nous nous sommes intéressés à la régulation des gènes codant les acteurs protéiques impliqués dans cette balance (ANK, PC1, Pit-1 et TNAP). A partir de prédictions de cibles par analyse in silico, un panel de 4 miARNs candidats a été établi : let7e, miR-9, miR-188 et miR-219. Nos travaux avec des systèmes rapporteurs ont démontré l’implication de miR-9 en tant que régulateur négatif de l’expression des gènes PC-1, Pit-1 et TNAP, de façon cohérente ou non avec les prédictions bio-informatiques. / Osteoarthritis (OA) is the most frequent joint disease and its prevalence still grows with the increase in lifespan. OA is characterized by articular cartilage degeneration, together with synovitis and abnormal subchondral bone remodeling, leading to progressive loss of mobility and pain. Chondrocyte is the unique cell type in cartilage which accounts for the synthesis of extracellular matrix (ECM) components (collagens, proteoglycans). During OA, chondrocyte phenotype is altered and the balance between ECM synthesis and degradation is impaired towards cartilage degradation. To date no treatment can efficiently reduce OA progression so that the search for reliable biomarkers and potential therapeutic targets is very active, particularly since the discovery of microRNAs. miRNAs are estimated to regulate 50% of cellular genes. They contribute to major cellular processes such as cell differentiation, apoptosis or tumorigenesis. Therefore, miRNAs are interesting putative biomarkers. During this PhD thesis, we studied the contribution of miARNs to the control of chondrocyte phenotype. Using a model of chondrocyte differentiated phenotype loss induced by extensive subculturing or IL-1β challenge we studied changes in miRNAs profile with microarrays. We determined a panel of 43 varying miRNA including the miR-23~27b~24-1 cluster and miR-29b. The differential production of miRNAs from this cluster has been investigated, but we didn’t succeed in identifying the underlying mechanisms. However, we identified miR-29b as a negative post-transcriptional regulator of Col-IIa1 during differentiated phenotype loss and OA. Finally, as equilibrium between extracellular levels of inorganic phosphate and pyrophosphate (ePi/ePPi) was previously shown in the laboratory to be crucial for the maintenance of a differentiated chondrocyte phenotype, we studied the regulation of the genes encoding the 4 proteins regulating this balance (ANK, PC1, Pit-1 and TNAP). From in silico analysis, we selected a panel of 4 miRNAs: let7e, miR-9, miR-188 and miR-219. Using reporter assays, we showed that miR-9 was a negative regulator of PC-1, Pit-1 and TNAP, according or not to bioinformatics prediction

Les protéines de la famille L7Ae sont les constituants de nombreuses RNP essentielles. Chez les vertébrés, les particules snoRNP C/D et H/ACA sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes, la UsnRNP U4 dans l'épissage des pré-ARNm, le complexe télomérase dans la réplication des télomères, et les mRNP SECIS dans la traduction des sélénoprotéines. Comme c'est le cas pour la majorité des RNP eucaryotes, leur assemblage, sous forme d'entités fonctionnelles, ne constitue pas un processus autonome et requiert l'intervention de facteurs spécialisés. En basant notre étude sur l'assemblage des snoRNP C/D, dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae, et en utilisant des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de génétique, nous avons entrepris de caractériser ces événements. Nos travaux ont contribué à identifier un ensemble de protéines, agissant de façon coordonnée au sein d'une machinerie conservée entre la levure et l'homme. Cette dernière est composée de deux principales sous-unités : (i) Rsa1p/NUFIP, une protéine plate-forme, qui interagit avec certaines protéines de la famille L7Ae et facilite l'assemblage des RNP, (ii) le complexe R2TP (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), qui pourrait opérer des remodelages conformationnels nécessaires à la formation des RNP matures. En plus de ces acteurs centraux, d'autres facteurs sont apparus intimement liés à ce mécanisme. La protéine Hit1p/TRIP3, interagit notamment avec Rsa1p/NUFIP et s'est avéré requise pour assurer sa stabilité chez la levure. La chaperonne HSP90, dont le rôle est prédominant chez l'homme, exerce son activité sur certains constituants des RNP. Enfin, la protéine Bcd1p/BCD1 pourrait être associée à cette machinerie dans le cadre spécifique de l'assemblage des snoRNP C/D / The L7Ae family proteins are essential components of many RNPs. In vertebrates, C/D and H/ACA snoRNPs are involved in ribosome biogenesis, the U4 snRNP in pre-mRNA splicing, the telomerase complex in telomeres replication, and mRNP SECIS in selenoproteins translation. Like most eukaryotic RNPs, assembly in functional entities is not an autonomous process and requires the intervention of specialized factors. Basing our study on the assembly of C/D snoRNP in the model organism Saccharomyces cerevisiae, and using approaches of molecular biology, biochemistry and genetics, we undertook to decipher these mechanisms. Our work has helped to identify a set of proteins, acting in a coordinated manner within a machinery conserved between yeast and human. This machinery consists of two major subunits: (i) Rsa1p/NUFIP, a platform protein that interacts with some proteins of the L7Ae family and facilitates the RNPs assembly, (ii) the R2TP complex (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), which could induce conformational remodeling necessary for the formation of mature RNPs. In addition to these key players, other factors appeared closely linked to this mechanism. The Hit1p/TRIP3 protein interacts with Rsa1p/NUFIP and is required to ensure its stability in yeast. HSP90 chaperone, whose role is predominant in human, operates on some components of the RNPs. Finally, the Bcd1p/BCD1 protein is associated specifically with this machinery during C/D snoRNPs assembly