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Études structurales des intéractions protéines-protéines et ARN-protéines impliquées dans l'assemblage des snoRNP à boîtes C/D / Structural studies on protein-protein and RNA-protein interactions implicated in the C/D snoRNP biogenesisBack, Régis 30 August 2012 (has links)
De nombreuses fonctions cellulaires essentielles telles que la traduction, l'épissage, la biogenèse des ribosomes et la réplication des télomères font appels aux particules RNP non codantes. La biogenèse de ces dernières chez les eucaryotes est un processus très complexes qui fait intervenir de nombreux facteurs cellulaires. La biogenèse du ribosome nécessite au moins 150 facteurs. Ceux-ci sont importants pour faciliter mais également contrôler la biogenèse de cette machinerie cellulaire essentielle qu'est le ribosome. Parmi ces facteurs, nous avons les snoRNP à boîtes C/D. Ces RNP sont impliqués dans la maturation des pré-ARNr (méthylation post-transcriptionnelle des riboses et clivages endonucléolytiques). Récemment notre laboratoire a participé à la découverte de facteurs d'assemblage de ces RNP. Il s'agit entre autre des protéines Rsa1p, du complexe R2TP (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p et Pih1p) et de Hit1p chez la levure Saccharomyces cerevisiae. En utilisant une approche de co-expression à haut débit, nos travaux ont révélé un réseau complexe d'interactions entre les protéines constitutives des snoRNP et leurs facteurs d'assemblage. Couplé à une stratégie de protéolyse ménagée, la co-expression nous a permis d'obtenir des sous-complexes protéiques Snu13p/Rsa1p et Rsa1p/Hit1p qui font actuellement l'objet d'une étude structurale par RMN. En collaboration avec l'équipe de F. Allain (ETH Zurich), nous avons également déterminé la structure tridimensionnelle de la protéine Tah1p, ainsi que de son complexe avec le peptide C-terminale de la protéine chaperonne Hsp90 à haute résolution. Ces travaux ont révélé un mode d'association particulier entre le domaine TPR de la protéine et le peptide / A lot of essential cellular functions like translation, splicing, ribosome biogenesis and telomere replication need the activity of non coding RNPs. The biogenesis of non coding RNPs in eukaryotes is a complex pathway involving numerous cellular factors. For instance, ribosome biogenesis requires more than 150 factors. They are important to facilitate and to control the biogenesis of this essential cellular machinery. These factors include the C/D box snoRNPs. These RNPs are involved in pre-rRNA maturation (post-transcriptional ribose methylation and endo-nucleolytic cleavages). Recently, our laboratory participated to the discovery of snoRNP assembly factors: the Rsa1p protein, R2TP complex (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p and Pih1p) and Hit1p in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using a high throughput co-expression approach, we deciphered a network of interactions between RNP core proteins and the assembly factors. Coupled with a limited proteolysis strategy, the co-expression method allowed us to obtain proteins sub-complexes Snu13p/Rsa1p and Rsa1p/Hit1p which are currently studied by NMR. In collaboration with the F. Allain team (ETH Zurich), we also determined the tridimensional structure of protein Tah1p and its complex with the chaperon Hsp90 C-terminal peptide at high resolution. The data obtained reveal a particular mode of association of the Tah1p TPR domain with the Hsp90 peptide
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Analyse fonctionnelle des protéines Hit1 et Bcd1 impliquées dans la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D eucaryotes / Functional analysis of the Hit1p and Bcd1p proteins involved in eukaryotic box C/D snoRNP biogenesisTiotiu, Decebal 10 October 2016 (has links)
Chez les eucaryotes, la biogenèse des ribosomes débute dans le nucléole par la maturation et la modification des ARN ribosomiques (ARNr), et fait intervenir des centaines de particules ribonucléoprotéiques (RNP) distinctes, comme les petites RNP nucléolaires (snoRNP) à boîtes C/D, qui portent une activité méthyl transférase ciblée sur la position 2’-OH des riboses. Leur biogenèse nécessite l’intervention transitoire de facteurs protéiques constituant une machinerie d’assemblage spécifique. Mon travail de thèse a visé à étudier le rôle fonctionnel de deux de ces facteurs chez la levure S. cerevisiae les protéines Hit1 et Bcd1. Hit1p avait été trouvée au laboratoire être impliquée dans la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D, et il était connu que l’expression de Bcd1p est essentielle à la viabilité cellulaire et pour la stabilité des snoRNA à boîtes C/D. Lors de ce travail, nous avons retrouvé le domaine fonctionnel de Hit1p et identifié les acides aminés impliqués dans l’interaction avec Rsa1p, un autre facteur d’assemblage. Par une approche similaire, nous avons recherché les domaines nécessaires à la fonctionnalité de Bcd1p. Le mécanisme par lequel Bcd1p influence spécifiquement les taux de snoRNA à boîtes C/D reste inconnu, mais au cours de ce travail j’ai identifié un nouveau partenaire potentiel pour cette protéine - la chaperonne d’histone Rtt106p. La dernière partie de mon travail a visé à rechercher le lien fonctionnel entre Rtt106p et l’expression des snoRNA à boîtes C/D / In eukaryotes, ribosome biogenesis begins in the nucleolus, by maturation and modification of ribosomal RNAs (rRNA) and involves hundreds of distinct ribonucleoprotein particles, like box C/D small nucleolar RNPs (snoRNPs). Their assembly requires the transient intervention of protein factors constituting a specific assembly machinery. My PhD work aimed to investigate the functional role of two such factors, Bcd1p and Hit1p, in the yeast S. cerevisiae. Hit1p involvement in box C/D snoRNP biogenesis was revealed in our lab, and it was known that Bcd1p expression is essential to cell viability and box C/D snoRNA stability. During this work, we identified the functional domain of Hit1p, and the aminoacids involved in its interaction with Rsa1, another assembly factor. By a similar approach we identified the functional domains of Bcd1p. The mechanism by which Bcd1p specifically influences box C/D snoRNA levels is unknown. However, I identified a potentially new partner for this protein – the Rtt106p histone chaperone. The last part of my work aimed to search for a functional link between this histone chaperone and box C/D snoRNA expression
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Caractérisation structurale et fonctionnelle de la protéine Bcd1, impliquée dans la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D chez la levure Saccharomyces cerevisiae / Structural and functional characterization of protein Bcd1, implicated in box C/D snoRNP biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiaeBragantini, Benoît 12 December 2016 (has links)
La protéine Bcd1 est un facteur nucléaire essentiel à la viabilité cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae. Il est décrit comme requis pour assurer la stabilité des snoRNA à boîtes C/D. Ces petits ARN non codants s’assemblent à un jeu de 4 protéines invariables pour former les snoRNP à boîtes C/D qui sont des acteurs cruciaux de la biogenèse des ribosomes. En effet, quelques-unes de ces particules participent aux mécanismes assurant la maturation du précurseur des ARN ribosomiques et la grande majorité des autres particules sont des catalyseurs de la modification par 2’-O-méthylation des riboses. Bcd1p n’est pas présente au sein des particules matures, mais fait partie de ses facteurs d’assemblage, au même titre que les sous-complexes Rsa1p:Hit1p et R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p). Notre analyse de différents fragments de Bcd1p a dans un premier temps montré que sa région N-terminale (résidus 1 à 96) suffit à lui conférer son caractère essentiel. Cette région comprend un domaine à double doigt à zinc de la famille zf-HIT, également présent chez un autre facteur d’assemblage des snoRNP à boîtes C/D, la protéine Hit1. Nous avons résolu la structure 3D en solution de ces doigts à zinc et montré que ce sont des modules d’interaction avec les protéines Rvb1/2. Dans un second temps nous avons identifié la région C-terminale (résidus 120 à 303) de la protéine Bcd1 comme étant suffisante pour interagir avec la chaperonne d’histone Rtt106p. La structure 3D en solution de ce domaine a été déterminée par RMN. Différentes approches de cinétique d’échange hydrogène/deutérium et d’expériences de cross-link suivies par des analyses par spectrométrie de masse, des expériences de titrage par RMN et de SAXS nous ont permis d’obtenir des informations sur les surfaces d’interaction de chacune de ces deux protéines. Un fragment, défini à partir des données de RMN de Bcd1p libre, nous a permis d'obtenir des cristaux du complexe Bcd1p:Rtt106p ouvrant la perspective de résoudre sa structure 3D par diffraction aux rayons X. De plus, des études fonctionnelles ont débuté visant à déterminer l’importance de la formation de ce complexe sur la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D et l’impact de Bcd1p sur l’interaction entre Rtt106p et les nucléosomes / The protein Bcd1 is a nuclear factor essential for the cellular viability of the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is described as required to ensure box C/D snoRNA stability. These small non-coding RNAs associate with an invariable set of 4 proteins to form the box C/D snoRNPs that are crucial players in ribosome biogenesis. Indeed, some of these particles participate in mechanisms for the maturation of the ribosomal RNA precursor (prerRNA) and the vast majority of the other particles are catalysts of 2’-O-methylation of riboses. Bcd1p is not present in mature particles, but is one of the assembly factors in addition to the Rsa1p:Hit1p and R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p) sub-complexes. Our analysis of the different Bcd1p fragments has firstly shown that the essential function of Bcd1p relies on its N-terminal region (residues 1 to 96). It comprises a double zinc finger domain from the zf-HIT family, also present in another box C/D snoRNP assembly factor, the protein Hit1. We solved the 3D solution structure of these two zinc fingers and showed that these are modules for the interaction of Bcd1p with the Rvb1/2 proteins. Secondly, we identified the C-terminal region (residues 120 to 303) of Bcd1p as being sufficient to interact with the histone chaperone Rtt106p. The 3D solution structure of this domain of Bcd1p was determined by NMR. Different approaches of hydrogen/deuterium kinetic exchange and cross-link experiments followed by mass spectrometry analysis, NMR titration, and SAXS allowed us to obtain information about the interaction surfaces on each of the two proteins. A fragment defined from NMR data on the free Bcd1p allowed us to obtain crystals of the Bcd1p:Rtt106p complex, opening the perspective to solve its 3D structure by X-ray diffraction. Furthermore, functional studies started in order to determine the importance of this complex formation in box C/D snoRNP biogenesis and the impact of Bcd1p on the interaction of Rtt106p with nucleosomes
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Étude des processus de biogenèse des petites particules ribonucléoprotéiques nucléolaires à boîtes C/D (snoRNP C/D) chez la levure Saccharomyces cerevisiae : caractérisation fonctionnelle et structurale d'une machinerie dédiée à l'assemblage de ces RNP / Study of the biogenesis process of box C/D small nucleolar ribonucleoparticles (C/D snoRNPs) in the yeast Saccharomyces cerevisiae : functional and structural characterization of a machinery dedicated to assembly of these RNPsRothé, Benjamin 30 March 2012 (has links)
Les protéines de la famille L7Ae sont les constituants de nombreuses RNP essentielles. Chez les vertébrés, les particules snoRNP C/D et H/ACA sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes, la UsnRNP U4 dans l'épissage des pré-ARNm, le complexe télomérase dans la réplication des télomères, et les mRNP SECIS dans la traduction des sélénoprotéines. Comme c'est le cas pour la majorité des RNP eucaryotes, leur assemblage, sous forme d'entités fonctionnelles, ne constitue pas un processus autonome et requiert l'intervention de facteurs spécialisés. En basant notre étude sur l'assemblage des snoRNP C/D, dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae, et en utilisant des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de génétique, nous avons entrepris de caractériser ces événements. Nos travaux ont contribué à identifier un ensemble de protéines, agissant de façon coordonnée au sein d'une machinerie conservée entre la levure et l'homme. Cette dernière est composée de deux principales sous-unités : (i) Rsa1p/NUFIP, une protéine plate-forme, qui interagit avec certaines protéines de la famille L7Ae et facilite l'assemblage des RNP, (ii) le complexe R2TP (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), qui pourrait opérer des remodelages conformationnels nécessaires à la formation des RNP matures. En plus de ces acteurs centraux, d'autres facteurs sont apparus intimement liés à ce mécanisme. La protéine Hit1p/TRIP3, interagit notamment avec Rsa1p/NUFIP et s'est avéré requise pour assurer sa stabilité chez la levure. La chaperonne HSP90, dont le rôle est prédominant chez l'homme, exerce son activité sur certains constituants des RNP. Enfin, la protéine Bcd1p/BCD1 pourrait être associée à cette machinerie dans le cadre spécifique de l'assemblage des snoRNP C/D / The L7Ae family proteins are essential components of many RNPs. In vertebrates, C/D and H/ACA snoRNPs are involved in ribosome biogenesis, the U4 snRNP in pre-mRNA splicing, the telomerase complex in telomeres replication, and mRNP SECIS in selenoproteins translation. Like most eukaryotic RNPs, assembly in functional entities is not an autonomous process and requires the intervention of specialized factors. Basing our study on the assembly of C/D snoRNP in the model organism Saccharomyces cerevisiae, and using approaches of molecular biology, biochemistry and genetics, we undertook to decipher these mechanisms. Our work has helped to identify a set of proteins, acting in a coordinated manner within a machinery conserved between yeast and human. This machinery consists of two major subunits: (i) Rsa1p/NUFIP, a platform protein that interacts with some proteins of the L7Ae family and facilitates the RNPs assembly, (ii) the R2TP complex (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), which could induce conformational remodeling necessary for the formation of mature RNPs. In addition to these key players, other factors appeared closely linked to this mechanism. The Hit1p/TRIP3 protein interacts with Rsa1p/NUFIP and is required to ensure its stability in yeast. HSP90 chaperone, whose role is predominant in human, operates on some components of the RNPs. Finally, the Bcd1p/BCD1 protein is associated specifically with this machinery during C/D snoRNPs assembly
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