Les nanoparticules décorées de ligands de ciblage sont des dispositifs puissants développés pour servir d'outils théranostiques efficaces contre des maladies graves comme le cancer ou les maladies infectieuses. En raison des limitations importantes des anticorps en tant que ligands de ciblage, comme une grande taille et une faible stabilité, les protéines d'affinité modifiées à façon offrent une alternative intéressante pour la fonctionnalisation des nanoparticules. Les Affitines sont de petites protéines thermiquement et chimiquement stables, dérivées d'une famille de protéines d’archées de 7 kDa liant l'ADN, dont la spécificité et l'affinité pour leurs cibles sont comparables à celles des anticorps. Les dendrimères de l'acide gallique-triéthylèneglycol (GATG) sont des macromolécules monodispersées, synthétiques, globulaires, en forme d'arbre, préparées de façon itérative (générations) permettant une présentation multivalente des ligands de ciblage. L'objectif de ce travail de thèse est de combiner les propriétés de ciblage des Affitines et la polyvalence des dendrimères pour obtenir des conjugués Affitines-dendrimères pour des applications biomédicales. Le premier objectif était de mettre au point une méthode de conjugaison orientée pour incorporer des Affitines ciblant Staphylococcus aureus (S. aureus) et un traceur fluorescent pour la détection et l'imagerie, puis de les caractériser en termes de taille, d’hétérogénéité, de composition et d’affinité. Le deuxième objectif était d'évaluer leur potentiel à moduler des comportements multicellulaires complexes, comme l'agglutination et la formation de biofilms de S. aureus grâce aux interactions multivalentes implémentées. / Smart targeted nanoparticles are powerful devices developed to serve as efficient theranostic tools against severe disorders such as cancer or infectious diseases. Due to important limitations of antibodies as targeting ligands, such as large size and low stability, engineered affinity binding proteins offer an attractive alternative for nanoparticle functionalization. Affitins are small, thermally and chemically stable proteins derived from an archaeal 7 kDa DNA-binding family, with specificity and affinity for their targets comparable to that of antibodies. Gallic acid-triethylene glycol (GATG) dendrimers are monodisperse, synthetic globular tree-like macromolecules prepared in a stepwise fashion (generations) allowing multivalent presentation of targeting ligands. The aim of this project is to combine the targeting properties of Affitins and the versatility and multivalency of dendrimers to obtain Affitin-dendrimer conjugates for biomedical applications. The first goal of this work was to develop a site-specific conjugation method to incorporate Affitins targeting Staphylococcus aureus (S. aureus) and a fluorescent dye for detection and imaging, and then to thoroughly characterize them in terms of size, heterogeneity, composition and affinity. The second goal was to assess the potential of these conjugates to modulate complex multicellular behaviors, such as agglutination and biofilm formation of S. aureus due to enhanced multivalent interactions.

Franklin H. Portugal and Jack S. Cohen. / Includes bibliographical references and index.

Le syndrome de Brugada (BrS) est une cardiopathie héréditaire à transmission autosomique dominante, se manifestant par une anomalie de l'ECG et un risque accru de mort subite. Les mutations retrouvées dans la sous-unité α du canal sodique cardiaque Nav1.5 chez certains patients entraînent un défaut d'adressage membranaire de ces canaux. Ceux-ci restent alors séquestrés dans des compartiments intracellulaires. L'étude de ces mutants se réduisant souvent à l'utilisation de traitements correcteurs, les mécanismes de rétention impliqués restent encore méconnus. L'objectif de ce travail est d'étudier des mutants Nav1.5 présentant un défaut d'adressage en tenant compte non seulement de l'hétérozygotie des patients BrS mais également de la présence de la sous unité régulatrice β1 prédominante dans le cœur. Des études fonctionnelles et biochimiques mettent en évidence un effet dominant négatif exercé par les mutants R1432G, L325R et S910L sur la densité de courant INa sauvage (WT). Cet effet nécessite la présence de la sous-unité β1 et passe par l'altération de l'adressage membranaire des formes WT. Ceci est la conséquence d'une interaction physique entre des sous-unités α mutantes et WT. D'autre part, les mutants étudiés présentent un profil de maturation lié aux N-glycosylations qui différent de celui des canaux WT. Nos données suggèrent que ces canaux peuvent emprunter (i) la voie classique d'adressage dans leur forme mature (ii) la voie dite non conventionnelle lorsqu'ils sont partiellement glycosylés. En conclusion, ces travaux mettent en évidence le rôle de la sous-unité β1 ainsi que l'implication des N-glycosylations dans la modulation de l'adressage des canaux Nav1.5 / Brugada syndrome (BrS) is an inherited autosomal dominant cardiac channelopathy characterized by abnormal ECG pattern and an increased risk of sudden cardiac death. Several mutations on the cardiac sodium channel Nav1.5 which are responsible for BrS lead to misfolded proteins that do not traffic properly to the plasma membrane and are instead retained in intracellular compartments. Although pharmacological rescue is commonly used to characterize misfolded mutants, underlying cellular retention mechanisms remain unclear. The aim of this work is to investigate trafficking defective Nav1.5 mutants considering BrS patient heterozygosity and the presence of the regulatory β1-subunit which is largely expressed in cardiac tissue. By combining electrophysiology and biochemical approaches, we show that three distinct mutants, R1432G, L325R and S910L, exert a strong dominant negative effect upon wild-type (WT) sodium current density. Our data indicate that this effect requires the presence of the β1-subunit and is mediated by disruption of membrane trafficking of WT channels. Co-immunoprecipitation experiments demonstrate a physical interaction between mutant and WT α-subunits occurring only when the β1-subunit was present. Furthermore, we investigate the maturation pattern of Na channels. Our data show distinct N-glycosylated states between WT and mutant channels, suggesting that Nav1.5 α-subunits traffic (i) via unconventional secretion pathway as a partially glycosylated product, (ii) through the classical secretory pathway for mature fully-glycosylated form. This work highlights that β1-subunit and N-linked glycosylation process play key roles in modulating Nav1.5 trafficki

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