Le syndrome du QT long (LQTs) et le syndrome de Brugada (BS) sont deux maladies cardiaques héréditaires, pouvant causer la mort subite en relation avec des torsades de pointe dues à une fibrillation ventriculaire. SCN5A est le gène codant pour la sous-unité a du canal Na4 dépendant du voltage, exprimé dans le cœur humain. Objectif : Dans la présente étude, deux mutations (R1193Q et F1344S) dans le gène SCN5A ont été identifiées. La mutation R1193Q a été trouvée chez deux patients après le test de provocation à la procainamide par voie intraveineuse. Un des patients est atteint de BS et l'autre est atteint à la fois de BS et de LQTs. La mutation F1344S a été trouvée chez un autre patient atteint uniquement de BS. Méthode : Les canaux mutants ont été exprimés dans un système d'expression de mammifère (lignée cellulaire tsA 201) et les propriétés biophysiques ont été étudiées avec la technique de patch clamp en configuration cellule entière. Résultats : L'analyse des séquences montre un changement de G à A à la position 3587 sur l'exon 20. La mutation RI 193Q montre un déplacement négatif de 5mV de l'inactivation et un courant Na+ persistant. Le déplacement vers des potentiels négatifs de l'inactivation est responsable d'une perte de fonction causant l'élévation du segment ST chez le patient atteint de BS. La présence du courant persistant est responsable du gain de fonction causant l'augmentation de l'intervalle QT chez le patient avec LQTs. La mutation F1344S montre une manifestation typique de BS sur l'électrocardiogramme pendant une période de fièvre. Le séquençage a révélé un changement de T à C à la position 4031 sur l'exon 23. L'analyse biophysique montre une perte de fonction due au déplacement de la courbe d'activation vers des potentiels positifs à 23°C et ce déplacement est exacerbé à 40.5°C avec une pente plus lente. Conclusion : Les différentes manifestations cliniques de ces deux mutations sont la conséquence des anormalités électrophysiologiques distinctes du canal Na+ cardiaque mutant décrites dans cette étude. Pour les patients porteurs de R1193Q, la prescription de quelques drogues pouvant provoquer le LQTs et le BS doit être limitée. Pour éviter les épisodes de fibrillation ventriculaire, l'hyperthermie doit être contrôlée chez les patients porteurs de la mutation F1344S. / Long QT syndrome (LQTs) and Brugada syndrome (BS) are two distinct hereditary cardiac diseases, causing sudden cardiac death related to torsade de pointes and ventricular tachycardia (VT) / ventricular fibrillation (VF). SCN5A is the gene encoding the principal voltage-gated Na+ channel a-subunit, which is only expressed in the human heart. Objective: In present study, two mutations (R1193Q and F1344S) in SCN5A have been identified. RI 193Q mutation was found in two patients, one with BS and another with an overlap of BS and LQTs after the intravenous procainamide test. F1344S mutation was found in another patient with BS. Method: The mutant channels were expressed in a mammalian expression System (tsA 201 cell Une) and the biophysical properties were studied by the patch clamp technique with whole cell configuration. Results: The sequence analysis showed a G to A base change at position 3587 in exon 20. The R1193Q mutation produced a negative shift for 5 mV of inactivation and a persistent Na+ current. The negative shift of inactivation is responsible for loss of the function, leading to ST segment elevation in BS. The persistent Na+ current is responsible for gain of function, causing QT interval prolongation in LQTs. The F1344S mutation presented a typical BS manifestation on ECG during fever period. The sequencing analysis revealed a T to C base change at position 4031 in exon 23. The biophysical analysis showed loss of function due to significantly positive shift of activation at both 23°C and 40.5°C, but the shift was more important at 40.5°C with a slower slope factor. Conclusion: The different clinical manifestations of these two mutations probably derive from the distinct electrophysiological abnormalities of the mutant cardiac Na+ channels reported in this study. For patients with RI 193Q mutation, some drugs that likely precipitate LQTs and BS should be limited to prescribe. To prevent from VT/VF events, hyperthermia should be effectively controlled in the patients with F1344S mutation.

Les mutations du gène SCN5A, codant la sous-unité ? du canal Na+ cardiaque Nav1.5, sont responsables d'arythmies cardiaques héréditaires. La pénétrance incomplète observée dans ces maladies suggère l'existence d'autres facteurs modulant le phénotype associé à ces mutations. Dans ce travail de thèse, nous avons caractérisé deux mutations identifiées dans SCN5A. Le mutant R104W, identifié chez un patient atteint du syndrome de Brugada, est retenu dans le réticulum endoplasmique (RE), dégradé par le protéasome et abolit le courant Na+. Co-exprimé avec le canal sauvage, R104W conduit à la rétention de celui-ci dans le RE, résultant en un effet dominant négatif sur les canaux sauvages. Nous avons démontré que ce nouveau mécanisme mettait en jeu une interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5. La mutation R1860Gfs*12 a été identifiée dans une famille présentant des arythmies auriculaires. Dans un système d'expression hétérologue, ce mutant induit à la fois une perte et un gain de fonction de Nav1.5. La modélisation informatique nous a permis de montrer que la perte de fonction était plus prononcée dans les cellules auriculaires que ventriculaires. De plus, nous avons montré que la présence de polymorphismes en amont du gène PITX2 dans cette famille pouvait expliquer la variabilité des phénotypes observés. En conclusion, l'interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5, les propriétés électriques différentes entre oreillette et ventricule et la présence de polymorphismes chez les patients porteurs de mutations SCN5A sont des facteurs importants dans l'interprétation des effets fonctionnels de ces mutations, contribuant à la variabilité phénotypique des canalopathies Na+. / Mutations in the SCN5A gene, which encodes the α-subunit of the cardiac sodium channel Nav1.5, are implicated in different inherited cardiac arrhythmias. The incomplete penetrance observed in these diseases suggests the existence of other factors modulating the phenotype of these mutations. In this thesis work, we characterized two mutations identified in SCN5A. The R104W mutant identified in a patient with Brugada syndrome is retained in the endoplasmic reticulum (ER), degraded by the proteasome and abolishes the sodium current. Co-expressed with wild type (WT) channels, R104W leads to WT channels ER retention, causing a dominant-negative effect. We demonstrated that interaction between Nav1.5 α-subunits is responsible for the retention and the dominant-negative effect. The R1860Gfs*12 mutation was identified in a family with atrial arrhythmias. In a heterologous system, this mutant induces both loss- and gain-of-function effects on Nav1.5. Computer-model simulation showed that the loss-of-function was more pronounced in atrial than in ventricular cells. In addition, we showed that the presence of polymorphisms upstream of the PITX2 gene could explain the observed phenotypic variability in this family. In conclusion, the interaction between the α-subunits of Nav1.5, the different electrical properties between atria and ventricles and the presence of polymorphisms in patients with SCN5A mutations, are important factors in the interpretation of the functional effects of these mutations, which could explain the phenotypic variability of sodium channelopathies.

Le syndrome de Brugada (SBr) est une arythmie cardiaque héréditaire à pénétrance partielle. Cette pathologie est caractérisée par une élévation du segment ST dans les dérivations précordiales droites (V1 à V3) sur l'ECG et un risque important de mort subite et de syncope par fibrillation ventriculaire. Les mutations dans le gène SCN5A, qui code le canal sodique cardiaque Nav1.5, sont mises en cause dans 20% des cas. Le canal sodique cardiaque est responsable de l'initiation et de la propagation du potentiel d'action dans le myocarde. Ainsi, la perte de fonction de ce canal joue un rôle important dans le SBr. Ce travail permet de mieux comprendre les conséquences des mutations de la région N-terminale très conservée au cours de l'évolution, dans le SBr et le rôle de cette dernière dans la fonction du canal Nav1.5. Nous avons montré que certaine mutation de la région la région N-terminale mène à la rétention du canal mutant dans le réticulum endoplasmique précédant sa dégradation par le protéasome. En conséquence ces mutations semblent bien être responsables du SBr. Par ailleurs, cette région joue un rôle important dans la capacité d'ouverture du canal sodique cardiaque. Nous avons mis en évidence que la présence de canaux mutants peut altérer le transport à la membrane du canal sauvage menant à un effet dominant négatif. Mais aussi la capacité du canal non fonctionnel R878C-Nav1.5, qui est capable d'atteindre la membrane plasmique, à restaurer partiellement le courant sodique de mutants retenus dans des compartiments intracellulaires. Ce phénomène de transcomplémentation montre que les canaux sodiques sont capables de coopérer.

Les mutations du gène SCN5A, codant la sous-unité ? du canal Na+ cardiaque Nav1.5, sont responsables d'arythmies cardiaques héréditaires. La pénétrance incomplète observée dans ces maladies suggère l'existence d'autres facteurs modulant le phénotype associé à ces mutations. Dans ce travail de thèse, nous avons caractérisé deux mutations identifiées dans SCN5A. Le mutant R104W, identifié chez un patient atteint du syndrome de Brugada, est retenu dans le réticulum endoplasmique (RE), dégradé par le protéasome et abolit le courant Na+. Co-exprimé avec le canal sauvage, R104W conduit à la rétention de celui-ci dans le RE, résultant en un effet dominant négatif sur les canaux sauvages. Nous avons démontré que ce nouveau mécanisme mettait en jeu une interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5. La mutation R1860Gfs*12 a été identifiée dans une famille présentant des arythmies auriculaires. Dans un système d'expression hétérologue, ce mutant induit à la fois une perte et un gain de fonction de Nav1.5. La modélisation informatique nous a permis de montrer que la perte de fonction était plus prononcée dans les cellules auriculaires que ventriculaires. De plus, nous avons montré que la présence de polymorphismes en amont du gène PITX2 dans cette famille pouvait expliquer la variabilité des phénotypes observés. En conclusion, l'interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5, les propriétés électriques différentes entre oreillette et ventricule et la présence de polymorphismes chez les patients porteurs de mutations SCN5A sont des facteurs importants dans l'interprétation des effets fonctionnels de ces mutations, contribuant à la variabilité phénotypique des canalopathies Na+.

Le syndrome de Brugada (BrS) est une cardiopathie héréditaire à transmission autosomique dominante, se manifestant par une anomalie de l'ECG et un risque accru de mort subite. Les mutations retrouvées dans la sous-unité α du canal sodique cardiaque Nav1.5 chez certains patients entraînent un défaut d'adressage membranaire de ces canaux. Ceux-ci restent alors séquestrés dans des compartiments intracellulaires. L'étude de ces mutants se réduisant souvent à l'utilisation de traitements correcteurs, les mécanismes de rétention impliqués restent encore méconnus. L'objectif de ce travail est d'étudier des mutants Nav1.5 présentant un défaut d'adressage en tenant compte non seulement de l'hétérozygotie des patients BrS mais également de la présence de la sous unité régulatrice β1 prédominante dans le cœur. Des études fonctionnelles et biochimiques mettent en évidence un effet dominant négatif exercé par les mutants R1432G, L325R et S910L sur la densité de courant INa sauvage (WT). Cet effet nécessite la présence de la sous-unité β1 et passe par l'altération de l'adressage membranaire des formes WT. Ceci est la conséquence d'une interaction physique entre des sous-unités α mutantes et WT. D'autre part, les mutants étudiés présentent un profil de maturation lié aux N-glycosylations qui différent de celui des canaux WT. Nos données suggèrent que ces canaux peuvent emprunter (i) la voie classique d'adressage dans leur forme mature (ii) la voie dite non conventionnelle lorsqu'ils sont partiellement glycosylés. En conclusion, ces travaux mettent en évidence le rôle de la sous-unité β1 ainsi que l'implication des N-glycosylations dans la modulation de l'adressage des canaux Nav1.5 / Brugada syndrome (BrS) is an inherited autosomal dominant cardiac channelopathy characterized by abnormal ECG pattern and an increased risk of sudden cardiac death. Several mutations on the cardiac sodium channel Nav1.5 which are responsible for BrS lead to misfolded proteins that do not traffic properly to the plasma membrane and are instead retained in intracellular compartments. Although pharmacological rescue is commonly used to characterize misfolded mutants, underlying cellular retention mechanisms remain unclear. The aim of this work is to investigate trafficking defective Nav1.5 mutants considering BrS patient heterozygosity and the presence of the regulatory β1-subunit which is largely expressed in cardiac tissue. By combining electrophysiology and biochemical approaches, we show that three distinct mutants, R1432G, L325R and S910L, exert a strong dominant negative effect upon wild-type (WT) sodium current density. Our data indicate that this effect requires the presence of the β1-subunit and is mediated by disruption of membrane trafficking of WT channels. Co-immunoprecipitation experiments demonstrate a physical interaction between mutant and WT α-subunits occurring only when the β1-subunit was present. Furthermore, we investigate the maturation pattern of Na channels. Our data show distinct N-glycosylated states between WT and mutant channels, suggesting that Nav1.5 α-subunits traffic (i) via unconventional secretion pathway as a partially glycosylated product, (ii) through the classical secretory pathway for mature fully-glycosylated form. This work highlights that β1-subunit and N-linked glycosylation process play key roles in modulating Nav1.5 trafficki

En utilisant la méthode de génétique inverse, la mutation causale d'un bloc de conduction cardiaque familial a été localisée sur le bras long du chromosome 19 en 13.3 dans une grande famille libanaise. Après avoir testé 12 gènes candidats, nous avons trouvé 3 mutations différentes dans trois familles indépendantes de bloc de conduction cardiaque isolé. Les conséquences des 3 mutations ont été explorées par des études électrophysiologiques. Il s'agit dans les 3 cas d'un gain de fonction. Puis, une cohorte de 248 patients atteints de syndrome de Brugada a été étudiée. Onze mutations du gène TRPM4 ont été trouvées chez 20 patients. Les conséquences électrophysiologiques des mutations étaient diverses. Ensuite, des cohortes de patients atteints de syndrome du QT long, de fibrillation auriculaire ou de cardiomyopathie dilaté ont été étudiées. Nous avons également trouvé des mutations ou des variants prédisposants du gène TRPM4 chez ces patients. Une étude électrophysiologique doit être réalisée pour comprendre le rôle de TRPM4 dans ces autres pathologies. Enfin, notre étude immunohistochimique a démontré que TRPM4 est fortement exprimé dans le système de conduction cardiaque mais aussi plus faiblement dans les cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires communs. Ce travail a permis d'impliquer pour la première fois le gène TRPM4 dans des maladies humaines. Ce travail donne les bases pour comprendre le rôle du canal TRPM4 dans le fonctionnement cardiaque. C'est le préalable nécessaire avant de pouvoir développer de nouvelles thérapeutiques dans le futur / By using reverse genetics, the causal mutation of a familial cardiac conduction block was localized to the long arm of chromosome 19 in 13.3. After screening 12 candidate genes, we found 3 different mutations in three independent families with isolated cardiac conduction block. The consequences of these 3 mutations were explored by electrophysiological studies. In all 3 mutations it was a gain of function. Then, a cohort of 248 patients with a Brugada syndrome was studied. Eleven mutations were found in the TRPM4 gene in 20 patients. The electrophysiological consequences of these mutations were diverse. Then, cohorts of patients with long QT syndrome, atrial fibrillation, and dilated cardiomyopathy were studied. We found also mutations or predisposing variants in these patients. An electrophysiology study should be conducted to understand the role of TRPM4 in these other pathologies. Finally, our immunohistochemical study showed that TRPM4 is highly expressed in the cardiac conduction system but also although with less intensity in common auricular and ventricular cardiomyocytes. This work implied for the first time the TRPM4 gene in human diseases. This work provides the basis to understand the role of the TRPM4 channel in cardiac function. This is a prerequisite to be able to develop novel therapies in the future

Le syndrome de Brugada (BS) est une maladie génétique responsable de troubles du rythme cardiaque. En raison de la nature complexe et multifactorielle de cette pathologie, la stratification du risque peut s’avérer particulièrement difficile et il est nécessaire de pouvoir définir de nouveaux marqueurs avec des valeurs prédictives élevées afin d’identifier les patients à haut risque. Les événements arythmiques dans cette population étant souvent liés à des modifications de fonctionnement du système nerveux autonome (SNA), l’objectif de la thèse est l’évaluation et comparaison de la réponse cardiovasculaire aux modulations du SNA pendant la nuit, ainsi qu'en réponse à des manœuvres normalisées, telles que l'épreuve d'effort ou le test d'orthostatisme, chez une série de patients BS présentant différents niveaux de risque (sujets symptomatiques et asymptomatiques). Une première partie du travail de thèse est dédiée à l’application de méthodes d'analyse de complexité cardiaque, de sensibilité baroréflexe et de variabilité non-stationnaire du rythme cardiaque, jamais étudiées dans le cadre des patients BS. Dans une deuxième partie, afin d'aborder la nature multifactorielle de la maladie, une approche multivariée basée sur une méthode de machine learning est introduite. En employant des marqueurs extraits à l'analyse du traitement du signal précédent, des classificateurs robustes capables de distinguer les patients à différents niveaux de risque sont proposés. Dans la troisième partie de ce travail, deux modèles mathématiques de connaissances ont été proposés et analysés, afin d'étudier les réponses autonomiques et hémodynamiques au test d’orthostatisme et à l’épreuve d’effort. Enfin, une application prospective d’une approche multivariée intégrant les paramètres extraits à l'étape de modélisation est également présentée. L’ensemble des résultats de la thèse permet une meilleure caractérisation des profils autonomiques des patients BS et laisse envisager une amélioration de la sélection des patients pour implantation d'un défibrillateur implantable. / Brugada syndrome (BS) is a genetic arrhythmogenic disease characterized by a distinctive electrocardiographic pattern, associated with a high risk for sudden cardiac death. Its complex and multifactorial nature turns risk stratification into a major challenge. Although variations in autonomic modulation are commonly related to arrhythmic events in this population, novel markers with higher predictive values are still needed so as to identify those patients at high risk. Since the autonomic function can be better characterized through the application of standardized maneuvers stimulating the autonomic nervous system (ANS), the main objective of this thesis is to evaluate and compare the cardiovascular response to ANS modulations overnight, as well as in response to exercise and HUT testing, on a series of BS patients with different levels of risk (symptomatic and asymptomatic subjects). In a first part of this work, we apply previously described methods for the analysis of heart rate complexity, baroreflex sensitivity, and non-stationary heart rate variability, never before studied in the context of BS patients. In a second part, in order to address the multifactorial nature of the disease, a multivariate approach based on a step-based machine learning method is introduced. By employing markers extracted at signal-processing analysis, robust classifiers capable of distinguishing patients at different levels of risk are proposed. The third part of this work has been focused on the proposal of novel mathematical models and the associated model analysis methods, so as to study the autonomic and hemodynamic responses to exercise and HUT testing. Finally, a prospective application of a multivariate approach integrating parameters extracted at the model-based stage is also presented. Overall, the obtained results provide new insights into the underlying autonomic mechanisms regulating the cardiovascular system in BS, improving physiopathology and prognosis interpretation. The proposed approach may be used as an instrument for the identification of those asymptomatic patients at high risk who may benefit from a cardioverter defibrillator implantation. / El síndrome de Brugada (SB) es una enfermedad genética asociada a un patrón electrocardiográfico característico y a un elevado riesgo de muerte súbita cardíaca (MSC), causada por fibrilación ventricular (FV) en ausencia de cardiopatías estructurales. Debido a su naturaleza compleja y multifactorial, la estratificación del riesgo supone, en la actualidad, uno de los aspectos más controvertidos. Ciertas alteraciones en la modulación del sistema nervioso autónomo (SNA) se han relacionado con eventos arrítmicos en esta población; no obstante, nuevos marcadores con valores predictivos más elevados que permitan identificar a aquellos pacientes con un alto riesgo de sufrir MSC son todavía necesarios. El uso de maniobras estandarizadas con el objetivo de estimular el SNA permite una mejor caracterización de la función autonómica. El principal objetivo de esta tesis doctoral es, por tanto, la evaluación exhaustiva de la respuesta cardiovascular a la modulación del SNA en una serie de pacientes con SB y diferentes niveles de riesgo (sujetos sintomáticos y asintomáticos), a través de diferentes maniobras autonómicas, con la finalidad de identificar nuevos marcadores potencialmente útiles para la estratificación de riesgo en esta población. En este contexto, la evaluación de la función autonómica se llevó a cabo mediante tres estrategias principales. En primer lugar, se caracterizaron y compararon la variabilidad y complejidad del ritmo cardíaco, así como la sensibilidad barorrefleja, en pacientes sintomáticos y asintomáticos, con el objetivo de identificar nuevos marcadores capaces de distinguir entre grupos de pacientes. Los resultados mostraron, en el grupo sintomático, una menor variabilidad y complejidad durante la noche, así como un mayor tono vagal y una menor actividad simpática tanto durante el ejercicio como en respuesta a la prueba de mesa inclinada. En un segundo análisis, se abordó la etiología multifactorial del síndrome mediante un enfoque multivariado basado en un método de aprendizaje automático por etapas. A partir de marcadores extraídos en la etapa anterior, se propusieron modelos predictivos capaces de clasificar pacientes diagnosticados con SB en función de su nivel de riesgo. El mejor clasificador (AUC = 95%) fue diseñado a partir de marcadores autonómicos obtenidos durante la noche, superando modelos predictivos previamente descritos para la estratificación del riesgo en el SB a partir de la combinación de parámetros no invasivos. Finalmente, se analizaron las interacciones entre las funciones mecánica, circulatoria y autonómica de estos pacientes a partir de modelos fisiológicos. En primer lugar, mediante la implementación y evaluación de un modelo computacional integrando la dinámica del sistema cardiovascular y su respuesta autonómica a la prueba de mesa inclinada. Asimismo, se propuso la identificación recursiva de un modelo implementado para el análisis de la evolución temporal de las contribuciones simpática y parasimpática del SNA durante una prueba de esfuerzo. Los resultados mostraron una menor contractilidad, así como una actividad parasimpática significativamente mayor durante el ejercicio, en pacientes sintomáticos. Con el objetivo de combinar características extraídas del modelado fisiológico, un último estudio prospectivo propuso el diseño de un clasificador multivariado integrando los parámetros estimados en esta última etapa. Los resultados obtenidos indican importantes tendencias de relevancia clínica que aportan nuevos conocimientos sobre los mecanismos autonómicos encargados de regular el sistema cardiovascular en el SB. Su interpretación permite mejorar la estratificación del riesgo en estos pacientes y, por tanto, optimizar las estrategias terapéuticas aplicadas. La metodología propuesta se presenta como un instrumento para la identificación de aquellos pacientes con alto riesgo de MSC que podrían beneficiarse de la implantación de desfibriladores automáticos.