L’accessió exòtica de meló PI 161375 presenta una barreja de resistència qualitativa i quantitativa front a la infecció per CMV depenent de la soca. Anteriorment s’ha descrit la presencia del gen recessiu de resistència cmv1 situat en el grup de lligament XII, i que conferia resistència total només a algunes soques de CMV (Essafi et al., 2009). En aquesta tesi hem ampliat els coneixements sobre la resistència determinada pel gen cmv1 present en meló i hem obtingut la seqüència i els clons infectius de la soca M6. Aquesta tesi ha estat estructurada en tres capítols. En el primer capítol vam analitzar la resistència conferida pel gen cmv1 en 11 soques de CMV del subgrup I i II. Els resultats van indicar que cmv1 conferia resistència total a les soques del subgrup II però no a les del subgrup I. Mitjançant l’ús dels clons infectius de les soques CMV-LS (subgrup II) i CMV-FNY (subgrup I) vam fer combinacions entre els RNAs d’ambdues soques podent localitzar el determinant de virulència en el RNA3. Virus quimèrics entre FNY i LS van indicar-nos que el determinant de virulència estava en els 209 aminoàcids de l’extrem N-terminal de la proteïna de moviment. Mitjançant mutagènesi dirigida vàrem identificar una combinació de 4 posicions específiques que confereixen a LS l’habilitat de sobrepassar la resistència conferida pel gen cmv1 quan els substituïm pels residus corresponents de la soca FNY. El segon capítol tracta de la caracterització de la resistència conferida pel gen cmv1. La soca CMV-LS és capaç de replicar-se i de moure’s cèl·lula a cèl·lula en la fulla inoculada de la línia resistent. No obstant, LS és incapaç d’envair el floema ja que no hem pogut detectar virus en el floema de la línia resistent. Mitjançant immunomarcatge de CMV amb or col·loïdal hem identificat el límit entre cèl·lules de la beina (BS) i parènquima vascular (VP) o cèl·lules acompanyants (IC) com a barrera que impedeix la infecció sistèmica en la línia portadora del gen cmv1. Amb els resultats obtinguts hem demostrat que la resistència determinada pel gen cmv1 interromp l’entrada del virus al sistema vascular, impedint així una infecció sistèmica. En el tercer capítol vam obtenir la seqüència de la soca CMV-M6 i vam generar clons moleculars capaços d’infectar sistèmicament N. benthamiana i meló. / La accesión exótica de melón PI 161375 presenta una mezcla de resistencia cualitativa y cuantitativa frente a la infección por CMV, dependiendo de la cepa. Anteriormente se describió en nuestro laboratorio la presencia del gen recesivo de resistencia cmv1 situado en el grupo de ligamiento XII, y que confería resistencia total sólo a algunas cepas de CMV (Essafi et al., 2009). En esta tesis hemos ampliado los conocimientos sobre la resistencia mediada por el gen cmv1 presente en melón y hemos obtenido la secuencia y los clones infectivos de la cepa M6. La tesis ha sido estructurada en tres capítulos. En el primer capítulo analizamos la resistencia conferida por el gen cmv1 en 11 cepas de CMV del subgrupo I y II. Los resultados indicaron que cmv1 confería resistencia total a las cepas del subgrupo II pero no a las del subgrupo I. Mediante el uso de los clones infecciosos de las cepas CMV-LS (subgrupo II) y CMV-FNY (subgrupo I) hicimos combinaciones entre los RNAs de ambas cepas, pudiendo localizar el determinante de virulencia en el RNA3. Quimeras entre FNY y LS indicaron que el determinante de virulencia estaba en los 209 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína de movimiento (MP). Mediante mutagénesis dirigida identificamos una combinación de 4 posiciones específicas que confieren a LS la habilidad de sobrepasar la resistencia mediada por cmv1 cuando las sustituimos por los residuos correspondientes de la cepa FNY. El segundo capítulo trata de la caracterización de la resistencia conferida por el gen cmv1. La cepa CMV-LS es capaz de replicarse y moverse célula a célula en la hoja inoculada de la línea resistente. No obstante, LS es incapaz de invadir el floema ya que no hemos podido detectar virus en el floema de la línea resistente. Mediante inmunomarcaje de CMV con oro coloidal hemos identificado el límite entre células de la vaina (BS) y parénquima vascular (VP) o células acompañantes (IC) como barrera que impide la infección sistémica en la línea portadora del gen cmv1. Con los resultados obtenidos hemos demostrado que la resistencia determinada por el gen cmv1 interrumpe la entrada del virus al sistema vascular, impidiendo así una infección sistémica. En el tercer capítulo hemos obtenido la secuencia de la cepa CMV-M6 y generado clones moleculares capaces de infectar sistémicamente N. benthamiana y melón. / The exotic melon accession PI 161375 shows a complex mixture of qualitative and quantitative resistance to Cucumber mosaic virus (CMV) infection, depending on the strain. Previously, the presence of a recessive gene (cmv1) in the linkage group XII conferring total resistance to a set of CMV strains was reported in our laboratory (Essafi et al., 2009). In this thesis we have extended the knowledge about the cmv1-mediated resistance present in melon and have obtained the sequence of the strain CMV-M6 and its infectious clones. This thesis is divided in three chapters. In the first chapter, we have analysed the cmv1-mediated resistance in 11 strains of CMV from subgroup I and II and have established that cmv1 confers total resistance only to strains of subgroup II. Using infectious clones of strains CMV-LS (subgroup II) and CMV-FNY (subgroup I) we have made combinations between RNAs of both strains showing that the determinant of the virulence is located in RNA3. Chimaeras between CMV-FNY and CMV-LS showed that the determinant of virulence is in the N-terminal 209 amino acids of the movement protein (MP). By directed mutagenesis, we identified a combination of four specific positions that confer to LS the ability to overcome cmv1-mediated resistance when exchanged for the corresponding FNY residues. In the second chapter, we have characterized the resistance mediated by cmv1. The strain CMV-LS is able to replicate and move cell to cell in the inoculated leaf of the resistant line. However, it is not able to invade the sieve elements since it has not been detected in the phloem of the resistant line. By immunogold labelling of CMV particles we have identified that the boundary between bundle sheath cells (BS) and vascular parenchyma (VP) or intermediary cells (IC) impedes the systemic infection in the resistant line. Altogether, our results demonstrate that the resistance determined by cmv1 involves interruption of the virus entry into the vascular system and therefore, inability to develop a systemic infection. In the third chapter, we have obtained the sequence of CMV-M6 strain and generated infectious clones able to infect systemically N. benthamiana and melon.

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad hemorrágica altamente infecciosa de declaración obligatoria a la Organización Mundial de la Salud Animal (OIE) y que provoca grandes pérdidas económicas en los países afectados. El agente causal de la enfermedad es el virus de la peste porcina africana (VPPA), un virus para el que todavía hoy no existe vacuna. El VPPA permanece endémico desde su origen en el África subsahariana, mantenido en un ciclo silvestre entre los cerdos salvajes y las garrapatas, infectando ocasionalmente a cerdos domésticos, altamente susceptibles a la enfermedad. Desde que en el año 2007 el virus volviera a entrar en la Europa continental, no ha parado de expandirse desde Georgia por todo el Cáucaso y Rusia, alcanzando en 2014 a varios países de la Unión Europea. El principal objetivo de esta Tesis fue desarrollar una nueva vacuna frente a la PPA basada en la manipulación genética del virus. Estos fueron los principales logros conseguidos: i) la deleción del gen de la hemaglutinina o CD2 viral del genoma de la cepa virulenta BA71, atenúa dramáticamente su patogenia in vivo.; ii) El virus delecionado de CD2v, BA71.ΔCD2, es capaz de conferir protección frente a la infección letal con el virus homólogo virulento BA71, así como frente al virus heterólogo virulento E75, de una manera dosis dependiente; iii) La dosis más elevada ensayada de BA71.ΔCD2: 106 UFP, protegió totalmente a los animales frente a la infección letal con uno u otro aislado de VPPA; iv) La protección cruzada observada tras inmunizar con BA71.ΔCD2 correlaciona con la capacidad que este virus tiene de inducir células T-­‐CD8+ que in vitro reconocen tanto a BA71 como a E75, mientras que los virus atenuados hasta ahora probados sólo protegían y reconocían únicamente a virus homólogos; iv) La inoculación de 106 UFP de BA71.ΔCD2 fue capaz de proteger al 100% de los cerdos vacunados frente a la infección con una dosis letal del virus heterólogo Georgia07, actualmente circulando por Europa. Los resultados obtenidos durante esta Tesis avalan la idea de que obtener una vacuna frente a PPA es posible, si bien es esencial aumentar su seguridad y dotarla de la capacidad de inducir una respuesta inmunológica que permita diferenciar a los animales vacunados de los infectados; clave sobre todo pensando en su utilización en zonas libres de la enfermedad. / African swine fever (ASF) is a highly infectious hemorrhagic disease of compulsory declaration to the World Animal Health (OIE) and causes important economical losses in affected countries. The causative agent of the disease is African swine fever virus (ASFV), a large and complex virus against which there is no effective vaccine available and therefore, its control and eradication relies on the rapid diagnostic of the disease and culling of infected and/or exposed animals to the virus. ASF remains endemic in sub-­‐Saharan Africa where the virus is in a sylvatic cycle between wild pigs and ticks, occasionally infecting highly susceptible domestic pigs. The virus re-­‐entered Continental Europe in 2007 and since then, the virus has circulated from Georgia to the rest of the Caucasian Regions, Russia and more recently has entered the European Union borders. The main objective of this Thesis was developing a new vaccine strategy against ASF, based on the genetic manipulation of the ASFV genome. The main findings obtained can be summarized as follows: i) the deletion of the hemagglutinin gene or viral CD2, strongly attenuated the ASFV-­‐BA71 virulent strain in vivo; ii) BA71.ΔCD2, a live attenuated virus defective for CD2v, is able to confer in vivo protection in a dose-­‐dependent manner against the lethal challenge with either the homologous BA71 virus or the heterologous E75 virus; iii) Inoculation with the higher dose tested of BA71.ΔCD2, 106 PFU, conferred complete protection against BA71 and E75; iv) the cross-­‐protection induced by BA71.ΔCD2 correlated with its ability to induce specific CD8+ T-­‐cells capable to in vitro recognize both BA71 and E75 viruses; an effect observed for the first time for ASFV-­‐attenuated viruses, capable only to confer protection against homologous viruses; v) Inoculation of 106 PFU of BA71.ΔCD2 protected 100% of the immunized pigs against lethal challenge with the virulent strain Georgia07, currently circulating in Europe. The encouraging results obtained during this Thesis open new expectations and strength our opinion about the possibility of obtaining a vaccine against ASFV. Despite these promising findings, this vaccine prototype should be refined to obtain a safer vaccine capable also of inducing a differential immune response from circulating ASF viruses; a must in Veterinary vaccines against diseases of compulsory declarations.

Recientes progresos en el conocimiento de la patogénesis de la enfermedad causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) junto con el desarrollo de potentes agentes antiretrovirales han resultado en una abundancia de opciones de tratamiento para los individuos infectados por este virus, y entre estos progresos, los avances en el conocimiento del proceso por el cual el VIH-1 entra en la célula huésped, han señalado este punto como una diana para el desarrollo de nuevas drogas que añadir al actual armamento terapéutico. Este trabajo esta centrado en el proceso de entrada viral, en su posible inhibición y en las consecuencias del bloqueo de alguno de sus pasos. AR177 (Zintevir) y las albúminas cargadas negativamente son dos clases de compuestos de naturaleza aniónica. Nosotros mostramos evidencias directas de que ambos compuestos interaccionan con la molécula gp120. Esto nos permite sugerir un modo de acción común para ambas clases de compuestos: la unión de dichas moléculas a la glucoproteína gp120, acción que previene una asociación estable entre el VIH-1 y las células CD4+. Los biciclanes y los aminoglicosidos conjugados a L-argininas son dos clases de agentes antivirales catiónicos. La fuerte interacción con CXCR4 aquí mostrada, indica que el mecanismo de acción de ambas clases de compuestos es el bloqueo del correceptor CXCR4. La naturaleza catiónica de estos compuestos podría conducir a interacciones electrostáticas con los residuos cargados negativamente de CXCR4, impidiendo de este modo la interacción de la glucoproteína de la envuelta de VIH con el correceptor CXCR4. Frente al bloqueo del receptor de quimiocinas CXCR4, en un modelo experimental que trataría de reflejar lo que ocurriría in vivo, el VIH-1 evoluciona de dos formas muy diferentes. Con concentraciones subóptimas del antagonista, y sin la posibilidad de utilizar otro correceptor, el virus adquiere un gran número de mutaciones en la glucoproteína de la envuelta que le permite crecer sin cambiar de correceptor Con concentraciones óptimas del antagonista, y en presencia del receptor CCR5, se da un cambio de fenotipo de tipo X4 a fenotipo de tipo R5 y se previene el cambio de fenotipo de tipo R5 a tipo X4, sugiriendo que el tratamiento de pacientes VIH-positivos con un antagonista de CXCR4 podría revertir el fenotipo viral de tipo X4 a un fenotipo menos patogénico de tipo R5 prolongándose así la fase asintomática de la enfermedad. En conjunto, nuestros resultados muestran que el bloqueo del proceso de entrada del virus de la inmunodeficiencia humana nos puede ofrecer una nueva oferta de fármacos antivirales que no sólo mejorarían las terapias anti-VIH actualmente existentes, sino que nos pueden ayudar a aumentar el conocimiento del proceso de infección del VIH, además de ayudarnos a diseñar nuevas drogas quizá capaces de llegar a la erradicación de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana.

Els anellovirus són un grup de virus de cadena senzilla d’ADN amb una elevada diversitat genètica i que infecten a vertebrats. Els Torque teno sus virus (TTSuV) son ubics i és l’espècie d’anellovirus específica que infecta els porcs. S’han descrit 3 espècies víriques diferents, anomenades TTSuV1a i TTSuV1b dins del gènere Iotatorquevirus i TTSuVk2a, dins el gènere Kappatorquevirus. Aquests virus son genèticament molt diferents (>56% de diversitat de seqüencia nucleotídica) però comparteixen la mateixa organització del genoma i estratègia d’expressió. L ‘infecció de TTSuV en porcs es caracteritza per una virèmia persistent. Els TTSuVs no es consideren patogènics, però es creu que juguen un paper en la co-infecció amb altres agents infecciosos que causen malalties porcines importants. L'impacte real dels TTSuVs sobre la salut dels porcs, si n’hi ha , segueix sent objecte de debat. L'objectiu principal d'aquesta Tesi fou caracteritzar la variabilitat de TTSuV i explorar el desenvolupament de possibles prototipus vacunals enfront els TTSuVs. El primer estudi descriu la caracterització genètica d'una nova espècie de TTSuV, anomenada Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). Segons l'anàlisi filogenètica, aquest nou virus pertany al gènere Kappatorquevirus, el mateix al qual pertany TTSuVk2a. Es van desenvolupar tècniques quantitatives de PCR basades en la tecnologia de SybrGreen pels estudis epidemiològics i per l’estudi de la distribució geogràfica. En concret, es va desenvolupar una tècnica que quantificava la càrrega total de TTSuV (TTSuV broad-spectrum qPCR) i tres més que quantificaven la càrrega viral específica de cada espècie de TTSuV. D'altra banda, es va estudiar la prevalença i la càrrega d'ADN vírica en animals afectats amb per circovirosi porcina (CP). L'estudi epidemiològic va revelar que TTSuVk2b es distribueix a tot el món, encara que és menys abundant que TTSuV1 i TTSuVK2a. TTSuVk2b es va associar amb la CP, una malaltia porcina d'importància econòmica molt significativa. El segon estudi contenia dos objectius: d'una banda, l'expressió de les proteïnes TTSuVs; per l'altra banda, l’avaluació de l'impacte d’una vacuna experimental multivalent enfront les 4 espècies de TTSuVs conegudes, utilitzant com a model l’infecció natural de TTSuV en porcs. Les proteïnes recombinants ORF1, ORF1-A, ORF2 i ORF3 dels quatre TTSuVs coneguts es van expressar amb èxit mitjançant un sistema d'expressió de baculovirus. Per altra part, la vacuna experimental multivalent (formada per les proteïnes dels gens ORF1 i ORF3) va ser administrada per via intramuscular i intradèrmica utilitzant dos esquemes de vacunació diferents (dues o tres dosis). La seroconversió i els títols vírics en sang es van mesurar a partir de 3 fins a 15 setmanes d'edat, utilitzant respectivament l'ELISA indirecte basat en proteïnes del virus expressades en baculovirus i tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie TTSuV, respectivament. Aquest estudi va mostrar que la vacuna multivalent induïa anticossos anti-TTSuV, però aquest prototipus vacunal no era capaç de controlar la virèmia durant l’infecció natural de TTSuV. Finalment, en el tercer estudi es va avaluar l’immunització enfront TTSuVk2a durant l’infecció natural en porcs. L’immunització va consistir en una combinació d'ADN i proteïnes víriques per augmentar les possibilitats d'activació de respostes immunitàries tant cel·lulars com humorals. Es van utilitzar tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie de TTSuV, mentre que l’inducció d'anticossos específics va ser monitoritzada mitjançant ELISA indirecte. El grup vacunat va mostrar una seroconversió i una reducció significativa de les càrregues víriques de TTSuVk2a en comparació amb el grup control. Aquest estudi va demostrar per primera vegada que la virèmia per TTSuV pot ser controlada a través de l’ús d’una combinació que inclou ADN i proteïnes recombinant. En general, aquesta Tesi Doctoral contribueix a augmentar el coneixement dels TTSuVs mitjançant la descripció d’una nova espècie vírica, la qual pot estar associada al desenvolupament de malalties del porc, com s’ha indicat per TTSuVk2a. A més, l’infecció per TTSuV pot ser controlada mitjançant l'administració d'una vacuna d'ADN i proteïnes recombinats del virus, mentre que la vacuna basada en múltiples proteïnes (multivalent) no va ser eficient. / Anelloviruses are a highly diverse group of circular single-stranded DNA viruses infecting vertebrates. Torque teno sus viruses (TTSuV) are ubiquitous pig-infecting anelloviruses. Three different viral species have been described, namely TTSuV1a and 1b within the genus Iotatorquevirus and TTSuVk2a, within the genus Kappatorquevirus. These viruses are genetically very distinct (>56% sequence diversity) but share similar genome organization and expression strategy. TTSuV infection in pigs is distributed worldwide, and is characterized by a persistent viremia. TTSuV themselves are considered non-pathogenic; however, it is believed that these viruses play a role in co-infection with other economically important viral porcine infections. Apparently, TTSuV infection can influence the development or may contribute to the pathogenesis of various porcine diseases during co-infection. The real impact of TTSuV on the pig health, if any, is still under debate. The present Thesis aimed to characterize a novel TTSuV species and to explore possible ways of vaccination against TTSuVs. The first study describes the discovery, genetic characterization and epidemiology of a novel TTSuV species, named Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). According to phylogenetic analysis, this new virus belongs to the Kappatorquevirus genus, belonging to the same genus as TTSuVk2a. Quantitative PCR techniques based on SybrGreen technology were developed; one for quantification of total TTSuV load (TTSuV broad-spectrum qPCR) and others for quantification of each TTSuV species separately. These techniques were used for epidemiological studies and assess the geographical distribution. Moreover, prevalence and viral DNA load were determined in porcine circovirus type 2-systemic disease (PCV2-SD)-affected animals and healthy counterparts, since previous studies have associated another kappatorquevirus species, to the disease. The epidemiological study revealed that TTSuVk2b is worldwide distributed, although less abundant and displaying lower viral DNA titres in serum than TTSuV1 and TTSuVk2a. TTSuVk2b was associated with PCV2-systemic disease (PCV2-SD), which revealed that the two kappatorquevirus species are both genetically and biologically related. The second study contained two objectives. On one hand, TTSuV proteins were expressed in a baculovirus-based platform; on the other hand, the impact of a multivalent experimental vaccine was evaluated in a natural TTSuV infection model of pigs. The ORF1, ORF1-A, ORF2 and ORF3 recombinant proteins of all four known TTSuVs were successfully expressed in a baculovirus expression system. In additional, the multivalent experimental vaccine containing ORF1 and ORF3 proteins was administered by intramuscular and intradermal routes using two different vaccination schedules (twice or three times). Seroconversion and viral titres in blood were measured from 3 weeks until 15 weeks of age, using the indirect ELISA based on baculoviruses proteins and species-specific qPCRs, respectively. This study showed that vaccination induced anti-TTSuV antibodies; however the multivalent vaccine was not able to control viremia during TTSuV natural infection. Finally, in the third study, the immunization against TTSuVk2a during natural infection was evaluated using a different approach. The immunizations consisted of a combination of DNA and protein to increase the possibilities of activating both cellular and humoral immune responses. Quantitative PCR techniques were used to detect and quantify the viremia levels of each TTSuV species, while the induction of specific antibodies was monitored by indirect ELISA. The vaccinated group showed a seroconversion and a significant reduction of the TTSuVk2a viral loads compared to the control group. This study demonstrated for the first time that TTSuV viremia can be controlled by a combined DNA and protein immunization. Overall, the present Thesis contributes to increase the knowledge on TTSuV by means of describing a novel species, which may be involved in disease progression in co-infection with other pig pathogens. Moreover, TTSuV infection can be controlled by the administration of a combined DNA/protein immunization while a multivalent protein based vaccine was not efficient.

La convergencia de diversas disciplinas como la biotecnología, biología molecular e ingeniería genética en el desarrollo de vehículos terapéuticos a escala nanometrica para la entrega de moléculas terapeuticas, se plantea como una herramienta con un elevado potencial en el campo de la nanomedicina. El mayor reto de estos nanovehiculos es permitir una eficaz entrega de ácidos nucleicos, proteínas o incluso fármacos, con una elevada especificidad celular para poder así disminuir la dosis administrada y por eso reducir sus toxicidad. En el caso de los ácidos nucleicos, la especificidad de entrega y la protección de los mismos de las nucleasas son los puntos clave para prever el desarrollo de estos sistemas. Sin embargo, el uso de vectores virales que parecían contener todos los elementos necesarios para aplicar la terapia génica extensivamente, ha topado con serios problemas de toxicidad e inmunogenicidad que limitan su uso. Así pues, el desarrollo de vectores de entrega no víricos, degradables y de diverso origen como dendrímeros, liposomas, polímeros, proteínas modulares o virus-like particles (VLPs), entre otros, se ha revelado como un campo de investigación que promete aportar las herramientas necesarias para desarrollar vehículos auto ensamblables “inteligentes” capaces de superar las barreras impuestas por el sistema biológico y llegar al tejido o compartimiento celular diana sin provocar las reacciones adversas que limitan el utilizo de sistemas virales. En el óptica de estudiar la optimización de nanovehiculos autoensamblabels de origen proteicos para la terapia génica, hemos explorado por un lado la caracterización de VLPs obtenidas mediante la expresión del la proteína VP1 de la capside viral del human JC virus tanto en E.coli, como en células de insecto. Por otro lado hemos estudiado la optimización del proceso de producción y autoensamblado de proteínas multifuncionales y evaluado su capacidad de unir y proteger los acidos nucleicos de la degradación por parte de proteasas. Así pues, diferentes entornos genéticos del sistema de control de calidad en E. coli han evidenciado la alteración del rendimiento de producción y de calidad conformacional en el ensamblado de las VLPs del virus JC. En este tesis hemos explorado los efectos de la chaperona DnaK en la producción y calidad conformacional de las VLPs formadas por la proteína VP1 a través de tres cepas caracterizadas por la presencia/ausencia/sobre expresión de la chaperona DnaK. Se ha observado que la ausencia de esta chaperona promueve una mayor rendimiento de producción pero al mismo tiempo ha demostrado efectos negativos en el ensamblaje de las VLPs. El mismo concepto se ha aplicado en estudios en células de insecto, co-produciendo la proteína VP1 y las chaperonas bacterianas DnaK/DnaJ. En este caso el rendimiento de producción se ha visto afectado por la presencia de las chaperonas contrariamente a la calidad conformacional que se ha visto beneficiada. Paralelamente, estudios sobre las propiedad arquitectónicas de la proteína modular R9-GFP-H6 y sus interacciones con el ADN ha permitido establecer las condiciones optímales para la interacción de sus dominios peliotropicos, resultante en el auto ensamblado de esta proteína en complejos ADN/nanoparticulas capaces de proteger el ADN de la acción de proteasas. Además se ha propuesto un modelo bioinformática de las nanoestructuras estudiadas. Consecuentemente a la caracterización de la R9-GFP-H6, diferentes modelos de proteína modula auto-ensamblables derivada de esta han sido estudiados para evaluar sus eficacias a la hora de unir y transportar ADN al núcleo celular. En esta tesis se ha propuesto una modificación del protocolo de purificación que permite aumentar sensiblemente la eficacia de las diferentes nanoparticulas implicadas. Por lo tanto, en todos estos trabajos, queda reflejado que el desarrollo de virus artificiales para nanomedicina y terapia génica es un proceso fascinante y multidisciplinario donde las nanoparticulas de origen proteicos, sean proteínas modulares o virus like particles, están siendo concebidas como una herramienta extremadamente potente para la obtención de productos eficientes, seguros y comercialmente atractivos. Con esta tesis, entonces, se pretende entrar a fondo en las técnicas de desarrollo y mejora del proceso productivo de novedosas nanoestructuras proteicas para sus utilizo en nanomedicina. / The convergence of different field as biotechnology, molecular biology and genetic engineering in the development of a nano-scale therapeutical vector became matter of interest because of their nanomedical applications. The major challenge of nanovectors is obtain a good delivery of nucleic acid, therapeutic proteins or drugs, with high cell specificity and low side effects. In this way, viral vectors allow an extremely efficient delivery but are also responsible of severe side effects. Because of this main limitation, the development of artificial virus derived from either dendrimers, liposomes, polymers, modular proteins or virus like particles (VLPs) is considered an interesting and promising research field. In this thesis we expose our studies in the optimization of protein self-assembling nanoparticles. From one side we produced and characterized VLPs derived form the major capsid protein VP1 of the human JC virus both in E. coli and insect cells protein factories. On the other side we studied the optimization of the self-assembling and the purification process of multi-domain self-assembling proteins derived by paradigmatic protein R9-GFP-H6, which is described to form nanoparticles. Different genetic backgrounds for protein quality control system in E. coli have shown to alter the protein production yield and conformational quality of artificial virus assembly. We discuss in this thesis the effects of the prokaryotic DnaK chaperone on VP1 production yield and VLPs conformation quality. For this purpose we used three genetic backgrounds including, wild type expression, over-expression and absence of expression of DnaK molecular chaperone. Surprisingly, in the absence of the molecular chaperone the production yield of VP1 is enhanced but has negative effects on VLPs assembly. Moreover we tested different buffer formulations in order to establish the optimal salt concentration and pH for VLP organization, stabilization and conformation. The same concept where applied for insect cell system, exploring the effects in yield and conformational quality of VP1 hJCV VLPs upon re-hosting DnaK/DnaJ chaperones. Results showed a lowering in production yield upon chaperone co-expression but an increase in VLPs conformational quality. At the same time architectural properties of the paradigm protein R9-GFP-H6 and its interactions with DNA were studied in order to obtain a suitable protein-based artificial virus for gene delivery. It has been observed that in presence of DNA and at slightly acidic pH, R9-GFP-H6 proteins organize in two distinct populations. Microscopy observations showed a supramolecular organization of DNA/nanoparticle complexes, revealing the 9 Arginine and 6 Histidines blocks as promising pleyotropic domains. Moreover, in optimized conditions, R9-GFP-H6 protein has also showed an effective DNA protection against proteases. Finally, we purposed potential structural models of R9-GFP-H6/DNA complexes, based on bioinformatics analysis and experimental data. Subsequently we explored the nucleic acid contaminants in non-viral protein based nanovector production process of R9-GFP-H6 derivative proteins. Enzymatic downstream treatment with nucleases has revealed a good strategy to solve the limitations derived from nucleic acid contamination. All together, these works allows having a general overview of non-viral nanoparticles approach in gene delivery and permitting to understand better the difficulties in the production process. With this thesis, then, we claim to discuss and develop newly production and purification methods in order to develop efficient artificial virus for nanomedicine and gene therapy.

Des de l’any 2001, diferents brots d’una malaltia associada a la infecció per un pestivirus, concretament un virus de la malaltia de la frontera de genotip 4 (BDV-4, de l’anglès border disease virus), han causat reduccions importants en el nombre d’efectius d’isard (Rupicapra pyrenaica pyrenaica). L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral va consistir en estudiar l’epidemiologia de la infecció per BDV a l’isard i a altres remugants salvatges i domèstics, ja que els pestivirus no són hoste-específics estrictes. La principal zona d’estudi va consistir en els Pirineus Catalans i Andorrans, però també es van estudiar diferents zones dels Ports de Tortosa i Beseit i Sierra Nevada, a Espanya, i dels Alps italians i suïssos. Les espècies estudiades van ser l’isard, el mufló europeu (Ovis aries), el cérvol (Cervus elaphus), el cabirol (Capreolus capreolus), la daina (Dama dama), l’isard alpí (Rupicapra rupicapra), l’íbex (Capra ibex) i la cabra salvatge (Capra pyrenaica), així com l’oví, caprí i vaquí que pasturen en els prats d’alta muntanya. Es va determinar la presència d’anticossos enfront a pestivirus en sèrum mitjançant una tècnica d’ELISA. En els sèrums positius es va dur a terme un test de seroneutralització vírica comparada amb una soca del virus de la diarrea vírica bovina (BVDV, de l’anglès bovine viral diaorrhea virus) i diferents soques de BDV locals i de referència. La detecció vírica es va realitzar mitjançant una tècnica de reacció en cadena de la polimerasa inversa i/o un test ELISA. Per últim, es va seqüenciar la regió no codificant 5’ dels virus detectats i es van aïllar. L’estudi de poblacions d’isard prèviament afectades per brots de malaltia va indicar que la infecció per BDV ha esdevingut endèmica en determinades zones i que possiblement aquest fet està relacionat amb la manca de recuperació de certes poblacions. Tanmateix, en altres zones, el virus aparentment ha deixat de circular i la recuperació de la població d’isards després dels brots és bona. L’estudi a la reserva nacional de caça de Freser-Setcases, va establir que el BDV-4 és mantingut a la població d’isards sense causar cap efecte negatiu a la dinàmica poblacional. És possible que en aquesta població hi circulin soques menys virulentes de BDV-4, causant una elevada seroprevalença i evitant la dispersió d’altres soques més virulentes, i l’aparició d’un brot de malaltia. En totes les poblacions els isards seropositius van presentar títols més alts d’anticossos contra les soques BDV, i la majoria contra les BDV-4, concretament. En tots els remugants salvatges que comparteixen hàbitat amb l’isard es va detectar una seroprevalença baixa. La seroprevalenca en oví i caprí va variar depenent de l’origen geogràfic, i al vaquí sempre va ser elevada. L’oví va presentar títols d’anticossos més alts enfront a les soques BDV-4, el vaquí a BVDV i les cabres enfront a BDV-4 i BVDV. Als estudis realitzats al sud-oest dels Alps italians es va detectar una elevada seroprevalença a l’isard alpí. Aquest fet suggereix que la infecció per pestivirus és freqüent a les ambdues espècies del gènere Rupicapra. Per altra banda, als íbex i a les cabres salvatges de totes les zones es va detectar una seroprevalença molt baixa, i la majoria dels individus positius van mostrar anticossos enfront a BDV. A Suïssa, tots els cérvols analitzats i un isard alpí van mostrar anticossos enfront a BVDV, mentre que la resta d’isards van mostrar títols més alts enfront a BDV. Aquest resultat indica que els remugants salvatges de Suïssa es poden infectar amb les dos espècies de pestivirus. / Since 2001 several outbreaks of a new disease associated to Border Disease Virus (genus Pestivirus) of genotype 4 infection (BDV-4) have caused important declines in the Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) populations. The main goal of the present research work was to study the epidemiology of BDV infection in Pyrenean chamois and other wild and domestic ruminants, since pestiviruses are not strictly host-specific. The main study areas consisted of the Catalan and Andorran Pyrenees, but also different areas from the Ports de Tortosa i Beseit and Sierra Nevada Spanish mountains and from the Italian and Swiss Alps. The studied species were the Pyrenean chamois, European mouflon (Ovis aries), red (Cervus elaphus), roe (Capreolus capreolus), and fallow deer (Dama dama), Alpine chamois (Rupicapra rupicapra), Alpine (Capra ibex) and Iberian ibex (Capra pyrenaica), and sheep, goats and cattle that share the habitat with chamois. Sera were tested for the presence of antibodies against pestivirus with a commercial blocking ELISA assay. Comparative virus neutralization tests were performed in positive sera by using a bovine viral diarrhoea virus (BVDV) strain and reference and local BDV strains. Viral detection in wild ruminants was performed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using the panpestivirus primers 324 and 326 and/or with a commercial sandwich ELISA assay. As last, the sequence analyses of the 5’UTR region from positive samples and virus isolation were performed. The study of pestivirus epidemiology in Pyrenean chamois populations previously affected by BDV-infection outbreaks revealed that in some populations the disease has become endemic and BDV circulates frequently in the chamois population, possibly having a negative impact on host population dynamics. Contrarily, in some populations BDV does not seem to circulate after the disease outbreak. The study of a Pyrenean chamois population from the Eastern Pyrenees unaffected by disease outbreaks revealed that BDV-4 is self-maintained in this population, apparently without causing negative population dynamic effects. The circulation of weakly virulent strains could have been the cause of the high seroprevalence detected, which could hinder the spread of more virulent strains within this chamois population and the appearance of disease outbreaks. The seropositive Pyrenean chamois had BDV antibodies in all the studied populations, and most of them had higher titres against the BDV-4 strains. All the wild ruminants sharing habitat with Pyrenean chamois showed a low seroprevalence. The seroprevalence in sheep and goats, varied depending on the geographical origin, while in cattle it was constantly high. Sheep had higher antibody titres against the BDV-4 strains, cattle against BVDV, while goats showed higher titres against both BVDV and BDV strains. The study of pestivirus epidemiology in the south-western Italian Alps revealed a high seroprevalence in Alpine chamois, suggesting that members of the genus Rupicapra are likely to be infected with pestiviruses. Otherwise, Alpine and Iberian Ibex from all zones had a low seroprevalence, and most of the positive ibex had BDV antibodies. In Switzerland, the analyzed red deer and one Alpine chamois, had antibodies to BVDV, and the rest of chamois had antibodies to BDV. This results shows that the wild ruminants from this country can be infected with both pestivirus species, BVDV and BDV.

Els inhibidors de la transcriptasa inversa vírica i de la proteasa, són dos tipus de fàrmacs àmpliament utilitzats en la lluita contra el virus de la immunodeficiència humana tipus-1 (VIH-1). Un correcte ús i disseny dels tractaments, pot conduir a una inhibició sostinguda de la replicació vírica, tot i que, no a una eliminació de la infecció. Un dels majors obstacles de la teràpia, és l'aparició de mutacions en el genoma víric, associades a una disminució de l'eficàcia terapèutica. Les pròpies característiques del VIH afavoreixen l'aparició d'aquestes mutacions que faciliten la imposició de variants capaces d'escapar a les situacions adverses, com pot ser la presència d'un fàrmac antiretroviral. En aquest treball s'han analitzat l'efecte que una major o menor inhibició de la replicació vírica pot tenir sobre l'evolució vírica i l'aparició de mutants de resistència. Dels resultats dels treballs realitzats vam poder concloure que, el nivell de supressió de la replicació vírica, condiciona la facilitat d'aparició de mutacions associades a resistència, malgrat l'existència d'evolució genètica. També es va analitzar l'ús d'un sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda. Aquest sistema va ser dissenyat per l'anàlisi de proteases específiques pel lloc de tall, com és la proteasa del VIH-1. Tant l'acitivitat com la susceptibilitat als inhibidors de la proteasa són dos paràmetres importants a determinar de les diverses variants genètiques d'aquest enzim. Així vam veure que aquest sistema era útil per l'anàlisi de proteases obtingudes de mostres de pacients i permetia preveure la resposta a un posterior canvi de tractament. Altrament era molt sensible a la detecció de variacions en l'activitat proteolítica induida per canvis simples en la cadena aminoacídica, així com també permetia detectar canvis en la sensibilitat als diversos inhibidors de la proteasa. En resum doncs, vam concloure que, el sistema de cribratge basat en el bacteriòfag lambda constituiex una bona eina per a la caracterització de proteases del VIH-1 rellevants clínicament, així com, per la profundització en l'estudi i caracterització d'aquesta proteïna i les seves variants. / Inhibitors of protease and reverse transcriptase, are both widely used as drugs for threatment of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection. A correct use and design of threatments can reach an inhibition of viral replication during long periods of time. One of the major problems of therapy is the appearance of mutations in the viral genome associated with a diminution of therapy efficacy. The easy incorporation of mutations during replication of HIV-1, allowed the appearance of scape mutants. Here we evaluated how the level of viral replication can afect the appearance of genotipic resistance. We concluded that the level of supresion of viral replication conditionate the appearance of resistance associated mutations despite the existence of genetic evolution. We also evaluated the use of a bacteriophage lambda-based genetic screening system. This system was designed to evaluate cleavage site specific proteases as HIV-1 protease. The activity and drug susceptibility are two parameters important of HIV-1 protease variants. We found the system useful for the analysis of HIV-1 proteases from patient samples and was useful too, to predict the efect of a new therapy. The system was also very sensible to detect changes of the proteolytic activity due to simple genetic mutaions. In summary, we concluded that the lambda-based genetic screening system was a good tool to characterisate HIV-1 proteases clinically important, as was for the further study and characterisation of this protein and its variants.

Raltegravir es el primer inhibidor de la integrasa del VIH-1 aprobado para su uso en pacientes infectados por el VIH. Sinembargo, como el resto de los inhibidores, la emergencia de mutaciones de resistencia limita su eficacia clínica. El entendimiento de la prevalencia diferencial del ratio de mutaciones dentro de la región codificadora de la integrasa en pacientes con tratamiento TARGA (Tratamiento Antirretroviral de Gran Actividad) pero sin inhibidores de la integrasa, podría ayudar a identificar si algunas mutaciones virales o polimorfismos naturales ocurren, y si la diversidad genética del gen de la integrasa tiene implicaciones importantes en la respuesta clínica a los inhibidores de la integrasa. Por lo tanto, el primer objetivo de esta tesis doctoral fue explorar la evolución longitudinal de la región codificadora de la integrasa viral en pacientes que había recibido, durante una media de 10 años, terapia antirretroviral sin inhibidores de la integrasa. Un objetivo adicional, fue el estudio del efecto de los cambios genotípicos a la susceptibilidad al raltegravir y a la capacidad replicativa, en aquellas muestras que acumularon el mayor número de substituciones aminoacídicas durante el periodo de estudio. Nuestros resultados mostraron que las integrasas virales, después de una terapia antirretroviral prolongada, mantenían la sensibilidad genotípica y fenotípica al raltegravir. Además los cambios genotípicos a lo largo del tiempo, condujeron hacia una mejora de la capacidad replicativa de virus recombinantes para la integrasa viral, sugiriendo que el tratamiento antirretroviral prolongado no tiene coste biológico a nivel de capacidad replicativa del virus. Por lo tanto, nuestros datos apuntan que los tratamientos actuales no disminuyen la capacidad replicativa de la integrasa viral ni influyen la susceptibilidad al raltegravir. Hasta el momento, no existen estudios que evalúen la contribución fenotípica de mutaciones fuera de la región codificadora de la integrasa en pacientes que fracasan a tratamientos que contenían raltegravir. Las mutaciones de resistencia en la integrasa podrían jugar un papel importante en los cambios fenotípicos, tales como la capacidad replicativa y la susceptibilidad farmacológica. El segundo objetivo de esta tesis, fue comparar las contribuciones epistáticas de la integrasa, la proteasa, la transcriptasa reversa y el resto del genoma del VIH-1 en el fitness viral y la susceptibilidad al raltegravir en pacientes con y sin mutaciones de resistencia en la integrasa viral pero que fracasaban al TARGA conteniendo inhibidores de la integrasa. Nuestros resultados sugirieron una ausencia de efectos epistáticos entre los genes del VIH-1 en relación a la susceptibilidad farmacológica al raltegravir. Sinembargo, cambios genotípicos en la proteasa, la transcriptasa reversa y fuera de la polimerasa, compensaron la capacidad replicativa de virus que contenían mutaciones de resistencia en la integrasa viral. Por lo tanto, en pacientes que fracasaban a terapias que contenían inhibidores de la integrasa, la susceptibilidad al raltegravir estuvo esencialmente modulada por las mutaciones de resistencia dentro de la región codificadora de la integrasa, mientras que otros genes del VIH-1 estaban involucrados en la modulación del fitness viral. En pacientes con TARGA que consiguen suprimir la carga viral, se ha detectado la existencia de una viremia residual con métodos ultrasensibles. Si esta viremia residual refleja una replicación viral de bajo grado, o es el resultado de una producción viral por parte de reservorios estables, no está claro. Esta pregunta tiene serias implicaciones clínicas, porque si la viremia residual refleja una replicación de bajo grado, entonces la intensificación del TARGA podría ser útil para prevenir una evolución viral con el consecuente fracaso farmacológico. Los nuevos agentes farmacológicos, como los inhibidores de la integrasa, nos proporcionan nuevas herramientas con las que poder evaluar los reservorios virales que persisten en pacientes con TARGA. Raltegravir tiene un efecto único sobre las formas de ADN viral, incrementando las formas episomales 2-LTRs cuando la replicación es inhibida por el fármaco. El tercer objetivo de esta tesis fue evaluar si la intensificación del TARGA con raltegravir era capaz de impactar los niveles de ADN viral y la activación inmune. La intensificación con raltegravir bloqueó la replicación activa y la producción de virus infecciosos en un 29 por ciento de los pacientes. Nuestro estudio también reveló la relación efecto-causa entre la replicación activa y la activación inmune, sugiriendo que bajo un TARGA supresivo, la replicación activa es una causa, en vez de una consecuencia, de la anormal activación inmune. Por lo tanto, la intensificación del TARGA perturba el reservorio viral con implicaciones importantes para las estrategias terapéuticas dirigidas a alcanzar la erradicación viral. / Raltegravir is the first in-class HIV-1 integrase inhibitor approved for the treatment of HIV-1 infected subjects. However, like all other HIV inhibitors, the emergence of drug resistance limits its clinical efficacy. Understanding the differential prevalence rate of mutations within the integrase coding region from Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART)-experienced but integrase inhibitor-naïve subjects could help identify whether clinically relevant viral mutations or natural polymorphisms occur, and whether the sequence diversity of the integrase gene has important implications in the clinical response to integrase inhibitors. Therefore, the first objective of this project thesis was to explore intrasubject longitudinal evolution of the HIV-1 integrase-coding region over a median of 10 years of heavy antiretroviral therapy in integrase inhibitor-naïve subjects. An additional objective was to explore changes in phenotypic susceptibility to raltegravir and replication capacity in those samples that accumulated the highest number of amino acid substitutions during the study period. Our results showed that HIV-1 integrase from longitudinal samples did not show evidence of genotypic or phenotypic resistance to raltegravir. Long-term antiretroviral pressure did not impair the raltegravir susceptibility and appeared to drive the replication capacity of integrase-recombinant viruses towards improved phenotypes, suggesting no fitness cost associated with long¬term treatment. Therefore, our data suggest that current antiretroviral regimens do not diminish the fitness of integrase or influence raltegravir efficacy. No studies have evaluated the potential phenotypic contributions of mutations outside the integrase coding region in subjects whose raltegravir-containing regimens fail. Integrase resistance mutations could play a major role in phenotypic changes, such as replication capacity and drug susceptibility. The second objective of this thesis project was to compare the relative epistatic contributions of integrase, protease, reverse-transcriptase and the rest of the HIV-1 genome on viral fitness and susceptibility to raltegravir in subjects with and without raltegravir-resistance associated mutations and whose raltegravir-containing regimen has failed. Our results suggested an absence of epistatic effects between HIV-1 genes with regard to in vitro susceptibility to raltegravir. However, changes in protease, reverse-transcriptase and outside Polymerase compensated for the ex vivo replication capacity of viruses containing integrase resistance mutations. Therefore, raltegravir susceptibility was essentially driven by resistance mutations within the integrase coding region, whereas other HIV-1 genes were involved in modulating viral fitness in subjects whose raltegravir-containing regimen failed. In subjects under a suppressive HAART, residual viremia has been detected using ultra-sensitive methods. Whether residual viremia reflects ongoing viral replication at low levels or the production of virus from stable reservoirs remains unclear. Importantly, this question has immediate clinical implications, because if residual viremia reflects ongoing viral replication, then the intensification of the current treatment might be useful in preventing viral evolution and subsequent treatment failure. New classes of antiretroviral agents, such as integrase inhibitors, provide new tools to assess the viral reservoirs that persist in HAART-suppressed subjects. Raltegravir has a unique effect on viral DNA forms, leading to a measurable increase in 2-LTRs DNA circles when replication is inhibited. The third objective of this project thesis was to assess whether raltegravir intensification of the HAART regimen was able to impact the levels of HIV-1 DNA and immune markers in subjects with undetectable viremia measured by standard assays. Raltegravir intensification in HAART-suppressed subjects blocked active replication and production of infectious virus in 29 percent of subjects. Our study also revealed a causative relationship between active replication and immune activation, suggesting that under a suppressive HAART, active replication is a cause rather than a consequence of aberrant immune activation. Therefore, treatment intensification disturbs the latent reservoir, with important implications for therapeutic strategies aimed at achieving viral eradication.

El Circovirus porcí tipus 2 (PCV2) és l'agent causal de la circovirosi porcina (CP), una malaltia multifactorial que afecta porcs en fases de transició i engreix i que causa importants pèrdues econòmiques a la indústria porcina d'arreu del món. Les característiques histopatològiques de la CP i el fet que els animals malalts pateixin sovint infeccions secundàries i oportunístiques indica que aquesta malaltia implica una greu alteració del sistema immunitari del porc. Durant molts anys, el control de la CP es centrava principalment en la millora d'estratègies de maneig i en el control dels factors de risc que influeixen la presentació clínica de la malaltia. A dia d'avui, s'han introduït al mercat internacional quatre vacunes enfront PCV2 i la seva implementació al camp ha disminuït dràsticament la incidència de la CP. La present Tesi tenia com objectiu la caracterització de les respostes immunitàries desenvolupades pel porc en el curs de la infecció i vacunació per PCV2. En la primera part (Estudis I i II), es va caracteritzar el perfil immunològic de porcs sub-clínicament infectats amb PCV2, amb especial èmfasi en les respostes mediades per cèl·lules i el paper de les proteïnes capside (Cap) i replicasa (Rep) de PCV2 en el seu desenvolupament. Es va demostrar que el virus sencer, però no Cap i Rep indueix l'alliberació d'interleuquina (IL)-10 en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (CMSP), fins i tot en els cultius procedents d'animals verges, indicant l'origen innat d'aquesta resposta. Addicionalment, es va observar que, en fases inicials de la infecció per PCV2, es pot detectar interferó (IFN)-α en sèrum (dia 5 post-inoculació (PI)). Per altra banda, nivells detectables d'IL-10 només s'observaren de forma esporàdica, suggerint que els animals infectats sub-clínicament per PCV2 no es caracteritzen per tenir nivells elevats d'aquesta citoquina en sèrum. En relació a la immunitat adaptativa enfront a PCV2, es va veure que la resposta humoral es desenvolupa entra la segona i tercera setmana PI i que es caracteritza per la producció d'anticossos totals i neutralitzants, essent els neutralitzants d'aparició més tardana. La immunitat mediada per cèl·lules apareix entre la primera i segona setmana PI, i tant Cap com Rep estan implicades en el seu desenvolupament. A la segona part d'aquesta Tesi (Estudis III i IV), es va avaluar la immunogenicitat i eficàcia d'una vacuna comercial (una i dues dosis) basada en la Cap d'una soca de genotipus PCV2a en porcs convencionals. Els resultats d'aquests estudis van demostrar que la vacunació indueix el desenvolupament d'immunitat humoral i cel·lular i redueix la viremia, l'excreció i la càrrega vírica en teixits després de la infecció amb PCV2, tant amb soques de genotipus PCV2a com PCV2b. També es va observar que els anticossos maternals (AM) protegeixen enfront la infecció per PCV2 i influeixen en el desenvolupament de la resposta humoral després de la vacunació. Els resultats de l'estudi IV suggereixen que porcs amb títols d'IPMA per sota 5 log2 són potencialment més susceptibles a infectar-se amb PCV2. D'altra banda, es va veure que títols d'IPMA per sobre 10 log2 poden interferir amb el desenvolupament d'anticossos en resposta a la vacunació. En base a aquestes observacions, es proposa una "finestra de vacunació", definida com el rang de títols d'anticossos en el que els porcs s'haurien de vacunar per minimitzar la interferència amb els AM i, al mateix temps, assegurar el desenvolupament d'immunitat protectiva abans que els animals s'exposin a PCV2. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the causative agent of Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a multifactorial disease of nursery and fattening pigs that causes considerable economic losses to the swine industry worldwide. The histopathological features of PMWS and the fact that secondary and opportunistic infections are common in PMWS-affected pigs indicate that this disease involves a deep alteration of the immune system. For years, control of PMWS was limited mainly to the improvement of management strategies and to the control of risk factors thought to influence the infection outcome. At present, four vaccines against PCV2 are being sold on the international market and their application in the field drastically reduced the incidence of PMWS. This Thesis aimed to characterize the immune responses developed by pigs upon PCV2 infection and vaccination. In the first part (Studies I and II), the immune features of PCV2 experimental sub-clinical infections were characterized, with particular emphasis on cell-mediated responses, and on the role of PCV2 capsid (Cap) and replicase (Rep) proteins on it. Results from these studies showed that whole PCV2, but not Cap or Rep, induces the release of interleukin (IL)-10 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), even in those cultures obtained from PCV2-naïve pigs, a fact that indicates the innate origin of this response. In addition, it was found that interferon (IFN)-α can be detected in serum at early stages of the sub-clinical infection (5 days post inoculation (PI)). In contrast, IL-10 in serum could only be sporadically detected, suggesting that increased levels of this cytokine are not characteristic of PCV2 sub-clinically infected pigs. With regards to the acquired immunity to PCV2, humoral responses were developed mostly between the second and third week PI, characterized by the production of PCV2 total and neutralizing antibodies (NA), appearing NA later than total antibodies. Cell-mediated immunity developed within the first two weeks PI and it was demonstrated that both Cap and Rep proteins of PCV2 are involved in its development. In the second part of this thesis (Studies III and IV), the immunogenicity and efficacy of a commercial PCV2a-based sub-unit vaccine used in one- and two-dose schedules was evaluated in conventional piglets. Results from these studies demonstrated that vaccination induced the development of humoral and cell-mediated responses and significantly reduced viremia, shedding, and viral load in tissues upon challenge with either PCV2a or PCV2b isolates. It was also found that maternally derived PCV2 antibodies (MDA) protect against PCV2 infection and influence the humoral response developed after vaccination. Results from study IV suggest that pigs with IPMA titres below 5 log2 are potentially more susceptible to PCV2 infection. Besides, IPMA titres beyond 10 log2 were seen to interfere with the development of antibodies following PCV2 vaccination. Based on these observations a "vaccination window" was proposed, defined as the range of antibody titres at which piglets should be vaccinated to minimize interference with MDA and, at the same time, ensure the development of protective immunity before PCV2 exposure.

El gen precore-core del virus de la hepatitis B (VHB) se transcribe en dos ARN diferentes (ARNcore y ARNprecore) por la presencia en el promotor básico para este gen (PBC) de elementos que dirigen independientemente la síntesis de estos dos ARN. En la región precore del mismo gen se han descrito mutaciones que impiden la síntesis del HBeAg. Objetivos: 1.Estudiar en pacientes con hepatitis crónica B y portadores asintomáticos (p.a.) del VHB las concentraciones de ADN-VHB y HBeAg, el genotipo viral y la lesión histológica hepática. Relacionar con la presencia de mutaciones en el PBC y precore. 2. En pacientes con infección por VHB, VHC y/o VHD, determinar la concentración de ADN-VHB, ARN-VHC y ARN-VHD, genotipo viral y distribución de mutaciones en el PBC y precore del VHB. Pacientes: Objetivo 1: 182 HBsAg(+):116 hepatitis crónica: 30 HBeAg(+) con ALT elevada (14 HCA y 2 CH), 58 HBeAg(-) con ALT elevada (24 HCA y 10 CH), 28 ALT fluctuante (ALTf): 27 HBeAg(-) y 1 HBeAg(+) (6 HCA); 66 p.a. HBeAg(-). Objetivo 2: 175 Hepatitis crónica: 65 Coinfecciones (25 VHB/VHC, 18 VHB/VHD y 22 VHB/VHC/VHD) y 110 Infección aislada (55 VHB y 55 VHC). Métodos: VHB: HBsAg (EIA), HBeAg/Anti-HBe (RIA), cuantificación del HBeAg (RIA), determinación cualitativa del ADN-VHB (doble PCR), cuantificación del ADN-VHB (PCR en tiempo real), genotiopado VHB y mutaciones en PBC y precore (doble PCR y secuenciación). VHC: Anti-VHC (EIA), determinación cualitativa del ARN-VHC (RT-PCR), cuantificación del ARN-VHC (monitor test), genotipado VHC (RT-PCR-DEIA).VHD: Anti-HD (RIA), determinación cualitativa del ARN-VHD (RT-PCR), genotipado VHD (secuenciación). Resultados y conclusiones: 1. Mutaciones en el PBC en nuestra área: 72% en la hepatitis crónica HBeAg(-), 47% en hepatitis crónica HBeAg(+) y 52% en p.a. 2. La mutación mayoritaria en el PBC fue la sustitución de una G por una A en la posición 1764 (95% de las secuencias mutadas): su análisis sería el más sensible y suficiente para el estudio global del PBC. 3. Los pacientes con mutaciones en el PBC presentaron menor concentración de HBeAg: mutaciones en el PBC disminuyen pero no anulan la expresión del HBeAg; pero la presencia de estas mutaciones no afectaba a la concentración de ADN-VHB. 4. Las variantes de la región precore que impiden la expresión del HBeAg se detectaron preferentemente en la hepatitis crónica HBeAg(-) y, en proporción inferior, en p.a. Las variantes más frecuentes: posiciones 1896 (73% de las secuencias mutadas) y 1814-1817 (23% de las secuencias mutadas); para el estudio de la región precore es necesario realizar el análisis de estas mutaciones. 5. Análisis conjunto del PBC y precore: únicamente la presencia de mutaciones en las posiciones 1896 y 1899 del precore está asociada con mayores concentraciones de VHB. Las mutaciones en el PBC y/o precore están relacionadas con el estadío HBeAg(-) y la cirrosis hepática (posiciones 1764, PBC, y 1899, precore) y permite diferenciar a nivel molecular la hepatitis crónica ALTf del p.a. del VHB. 6. El genotipo A, mayoritario en el grupo HBeAg(+) con ALT elevada, y el genotipo D en HBeAg(-) con ALT elevada. La prevalencia de ambos genotipos era similar en ALTf y p.a. La presencia de mutaciones en el PBC se relacionó con el genotipo A mientras que en el precore con el genotipo D. En cada grupo de pacientes la carga viral era independiente del genotipo. 7. En las coinfecciones por VHB y VHC se observó una inhibición mutua entre ambos, con un mayor efecto inhibidor del VHC sobre el VHB. En la coinfección triple, el VHD actúa como dominante, e inhibe mayormente al VHC. La interacción entre los distintos virus no está influida por los genotipos. La coinfección por el VHC se relacionó con menor proporción de mutaciones en el PBC y precore del VHB. / The precore-core gen of the (HBV) is transcribed in 2 differents mRNAs (RNAcore and RNAprecore) by the action of differents elements in the basic core promoter for this gen (BCP). In the precore region of the same gen have been showed mutations able to abolish the synthesis of HBeAg. Aims: 1.To stablish in patients with chronic hepatitis B and HBV assymptomatic patients (AP), HBV-DNA and HBeAg concentrations, HBV genotype and the liver histologycal injury. Relation with mutations in BCP and precore. 2. To stablish in patients with HBV, HCV and/or HDV infection, the HBV-DNA, HCV-RNA and HDV-RNA concentrations, viral genotype and the presence of BCP and precore mutations. Patients: Aim 1: 182 HBsAg(+):116 chronic hepatitis: 30 HBeAg(+) with rised ALT (14 ACH and 2 HC), 58 HBeAg(-) with elevated ALT (24 ACH and 10 HC), 28 fluctuating ALT (ALTf): 27 HBeAg(-) and 1 HBeAg(+) (6 ACH); 66 HBeAg(-) AP. Aim 2: 175 chronic hepatitis: 65 Coinfections (25 HBV/HCV, 18 HBV/HDV and 22 HBV/HCV/HDV) and 110 isolated infections (55 HBV and 55 HCV). Methods: HBV: HBsAg (EIA), HBeAg/Anti-HBe (RIA), HBeAg quantification (RIA), HBV-DNA qualitative determination (nested-PCR), HBV-DNA cuantification (real time PCR), HBV genotype and mutations in BCP and precore (nested-PCR and sequenciation). HCV: Anti-HCV (EIA), HCV-RNA qualitative determination (RT-PCR), HCV-RNA quantification (monitor test), HCV genotype (RT-PCR-DEIA).HDV: Anti-HD (RIA), HDV-RNA qualitative determination (RT-PCR), HDV genotype (sequenciation). Results and conclusions: 1. BCP mutations in our area: 72% in HBeAg(-) chronic hepaititis, 47% in HBeAg(+) chronic hepatitis and 52% in AP. 2. The more prevalent mutation in BCP was the substitution of G to A in 1764 (95% in BCP mutated sequences): this analysis would be sufficient to the overall study of BCP. 3. Patients with BCP mutations presented a lower HBeAg concentration: BCP mutations reduce but not abolish HBeAg expression; nevertheless these mutations ware not related with HBV-DNA levels. 4. The precore region variants that abolish HBeAg expression was detected preferably in HBeAg(-) chronic hepatitis and, in a lower proportion, in AP. The more frequent variants: positions 1896 (73% in precore mutated sequences) and 1814-1817 (23% in precore mutated sequences): to study the presence of precore mutations is necessary to performance the analysis of these two regions. 5. Combined analyses of BCP and precore: only the presence of mutations in 1896 and 1899 was related with highers HBV-DNA concentrations. BCP and/or precore mutations was related with the HBeAg(-) state and HC (1764 position -BCP- and 1899 - precore-) and allow the differenciation between ALTf and AP in a molecular level. 6. Genotype A was found more frequently in HBeAg(+) with rised ALT, and genotypo D in HBeAg(-) with elevated ALT. The frequency of these genotypes was similar in ALTf and AP. BCP mutations were related with genotype A and precore mutations with genotypo D. In each group of patients HBV-DNA leves ware not associated with genotype. 7. A mutual nhibitory action between HBV and HCV in this dual coinfection was showed, with a stronger inhibitory effect of HCV over replication of HBV. HDV had a dominant role in triple coinfection, and seemed to exert a higher negative influence on HCV replication than on HBV. The interaction between the differents virus was not affected by the genotypes. HCV coinfection was related with a lower proportion of patients with BCP and precore mutants.