The oxidation of methane to methanol by methanotrophs is catalysed by the enzyme methane monooxygenase (MMO). In some methanotrophs two distinct MMOs are found; a membrane bound particulate (pMMO) and a cytoplasmic soluble (sMMO) methane monooxygenase. The intracellular location of MMO is dependent on the copper-to-biomass ratio. pMMO is expressed when the copper-to-biomass ratio is high (>0.25 IlM) and sMMO is expressed when the copper-to-biomass ratio is low «0.25 IlM). Although a great deal of information is known about the expression of MMO with respect to copper, the molecular mechanism regulating this 'copper-switch' is unknown. The aim of this study was to gain further insights into the regulation of MMO expression by copper ions. The complete sMMO operon, including the regulatory genes, mmoR and mmoG were cloned and sequenced from Methylosinus sporium. The genes encoding sMMO are present as single copy in methanotrophs. In this study, duplicate copies of the mmoX gene encoding for the a-subunit of the hydroxylase were characterised at the molecular and biochemical level. Mutational analysis indicated that the second copy was not essential for sMMO expression and also gave insights into the role of the water soluble pigment in siderophore-mediated iron-acquisition. sMMO-minus mutants were complemented by heterologous expression of sMMO genes from Methylosinus trichosporium and Methylococcus capsulatus. These experiments demonstrated the amenability of Ms. sporium to genetic manipulations facilitating its use as an alternative model organism for molecular analysis of MMO regulation. To aid transcriptional analysis of the MMO operons, a series of integrative and broad-host range promoter probe vectors, containing g{p, xylE, kmR or lacZ, were constructed and tested with the copper repressible sMMO 0'54 promoter. The usefulness of these reporter genes for the high-throughput detection of sMMO mutants was also assessed. The expression of LacZ in Mc. capsulatus via the sMMO 0'54 promoter yielded a powerful genetic screen for sMMO mutants. This system was coupled with transposon mutagenesis for surveying the genome on a global scale for sMMO regulatory genes and served as an alternative assay system for detecting sMMO expression. This assay system had the specific advantage in that it was more sensitive and in this context, it was selective for sMMO-minus mutants defective only at the transcriptional level. In collaboration with Robert Csaki (University of Szeged), a transposon mutagenesis protocol was established from which a number of sMMOminus mutants were identified. Genetic tools developed in this study were used to investigate copper mediated transcriptional regulation of the pMMO 0'70 promoter, sMMO 0'54 promoter and its regulatory genes, mmoR and mmoG. Transcription of the pMMO operon was shown to be constitutive. The sMMO 0'54 promoter was reconfirmed to be copper repressible and mmoR and mmoG were shown to be essential for transcription initiation from the sMMO 0'54 promoter, but were not regulated themselves by copper at the transcriptional level. All of these data were confirmed by constructing chromosomal gene fusions with various reporter genes, RT-PCR and RNA dot-blotting. The availability of the Mc. capsulatus genome sequence during this study allowed targeted mutagenesis to be carried out on copper targets responsible for copper transport. 'Knock-out' mutants of a copper transporting gene and a non-ribosomal peptide synthetase gene responsible for the putative biosynthesis of methanobactin, which is believed to be involved in delivering copper to pMMO, were constructed. The phenotypes of these mutants with regards to MMO expression are yet to be analysed.

Les Archaea hyperthermophiles sont des micro-organismes particulièrement adaptés à la vie à très haute température. Les températures élevées sont responsables de la création de diverses lésions à l’ADN. Pourtant, le taux de mutations spontanées chez l’Archaea Sulfolobus solfataricus est proche de celui mesuré chez des organismes mésophiles. Ceci laisse suggérer que les Archaea doivent être équipées de mécanismes spécialisés efficaces dans la reconnaissance et réparation des dommages à l’ADN. La réplication de l’ADN est un mécanisme fonctionnellement conservé dans les trois domaines du Vivant assuré par des enzymes clefs, les ADN polymérases. A ce jour, chez Pyrococcus abyssi (Pab), Euryarchaea hyperthermophile, deux familles de pol ont été identifiées, une pol réplicative de la famille B, présente dans les trois règnes du Vivant et une pol réplicative la famille D, spécifique de l’embranchement des Euryarchaea. Tous les membres de la famille B des pols archéennes possèdent une signature structurale unique impliquée dans la reconnaissance spécifique des bases endommagées (uracile et hypoxanthine). Ce doctorat a permis de démontrer que cette poche pouvait également accommoder les bases canoniques (A, T, C, G) contribuant ainsi à la haute fidélité de ces enzymes. Des structures cristallographiques à très haute résolution de l’ADN polymérase B (PabPolB) ont permis d’identifier la présence d’un ion métallique divalent situé à proximité de cette poche de reconnaissance. Il a été suggéré que cet ion modulerait la reconnaissance des bases désaminées et le glissement de l’ADN polymérase au cours de la synthèse d’ADN. De plus, nous avons montré que les ions catalytiques divalents ont un rôle central dans la modulation des propriétés intrinsèques de PabPolB. L’ion calcium est utilisé par PabPolB pour mener à bien la synthèse d’ADN mais engendre des caractéristiques cinétiques différentes de celles conférées par l’ion magnésium universel. D’autre part, nous avons déterminé pour la première fois chez un organisme archéen la concentration intracellulaire de dNTPs et NTPs. Leurs concentrations sont relativement plus élevées que celles mesurées par exemple chez l’eucaryote Saccharomyces cerevisiae, suggérant un mécanisme constitutif de réaction de protection à des agressions de l’ADN. L’ensemble de ces résultats participe à la compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent la maintenance de l’intégrité du génome et, donc, de la vie des organismes hyperthermophiles. / Hyperthermophilic Archaea that thrive under harsh environments (elevated temperature, pH shifts, andionizing radiations) are supposed to be exposed to massive DNA damages. However, the mutations frequencies in hyperthermophilic Archaea are comparable with those of other microorganisms (1) indicating they are equipped with unique and efficient molecular mechanisms to ensure their genome integrity. DNA replication is an essential and conserved process among the three domains of life. DNA polymerases are central enzymes involved in the joining of deoxyribonucleoside 5′-triphosphates (dNTPs) to form the growing DNA chain. In Pyrococcus abyssi (Pab), two familiesDNA polymerases have been described as replicases, one family B (PabPol B) with structural diversity and common mechanisms among all organisms in the three domains of life, and one family D found exclusively in Euryarchaea. All members of archaeal family B DNA polymerases possess a unique structural feature involved in the recognition of deaminated bases (uracil and hypoxanthine) called uracil-pocket. During my PhD, it has been shown that not only deaminated but also canonical bases (A, T, C, G) could enter this pocket in PabPolB. We therefore renamed it as the base-checking pocket and proposed a role in the high fidelity of PabPolB. High-resolution crystal structures of PabPolBhig hlighted the presence of divalent metal ion to the proximity of the base-checking pocket. It has been suggested that thismetal ion may modulate the recognition of deaminated bases and the translocation of PabPolB on DNA during DNAsynthesis. Moreover, the crucial role of metal ion on DNA synthesis and exonuclease activity by PabPolB has beenevaluated. DNA polymerisation in the presence of calcium was as effective as the universal magnesium ion while showing different time-course kinetics. For the first time, intracellular concentrations of nucleotides (dNTPs and NTPs) have been determined in an archaeal microorganism. dNTPs and NTPs concentrations seem rather elevated for Pab than in the eukaryotic Saccharomyces cerevisiae cells, suggesting a constitutive mechanism for protecting the genome from DNAdamage. Overall, these results contributed to unravel specific molecular mechanisms involved in the maintenance of the genome integrity with a particular emphasis on molecules (DNA polymerases, dNTPs and NTPs) crucial for cellular life.

Depuis la découverte des sources hydrothermales en 1977, un petit nombre d'études ont permis l'isolement et la caractérisation de micro-organismes pouvant résister à de hautes pressions et températures. Parmi ceux-ci, Pyrococcus yayanosii, une archée hyperthermophile de l'ordre des Thermococcales est issue du site Ashadze (dorsale medio-atlantique) à 4100 m de profondeur. Cette espèce représente le premier organisme à la fois hyperthermophile et piézophile strict décrit à ce jour. Elle ne peut en effet se diviser à des pressions inférieures à 20 MPa et sa pression optimale de croissance est de 52 MPa. Afin d'étudier les mécanismes que met en oeuvre cette espèce pour se développer sous hautes pressions, des expériences de transcriptomique (puces à ADN) et protéomique (LC-MS/MS) ont été entreprises à différentes pressions notamment sub- et supraoptimales. La distinction entre les effets « stress » et « adaptations » à la pression a été effectué en comparant les résultats obtenus chez une autre Thermoccocale proche, Pyrococcus furiosus, qui est piézosensible. La détermination des pressions sub et supra optimales a été préalablement effectuée sur une large gamme de pression hydrostatique. Des analyses génomiques ont aussi été effectuées sur les Thermococcales en général et ses deux espèces en particulier et montrent des différences importantes au niveau des voies de biosynthèse des acides aminés ainsi que des transporteurs membranaires. Les analyses transcriptomiques et protéomiquesmontrent que P. yayanosii joue essentiellement sur ses mécanismes de production d'énergie (métabolisme del'hydrogène), de mobilité (chimiotactisme), de traduction (protéines ribosomales) ainsi que sur ses mécanismes de défense (CRISPR/cas). P. furiosus met en place des mécanismes se basant aussi sur la traduction et la mobilité (archaellum). Il semble que ces derniers puissent ainsi être considérés comme des réponses aux stress, alors que la modulation énergétique uniquement présente chez P. yayanosii soit plus un « shift » métabolique permettant à la cellule de s'adapter aux différentes conditions de pression de son environnement. / No

Suite à la découverte récente des sources hydrothermales les plus profondes de la planète au niveau de laFosse des Caïmans, des échantillons hydrothermaux y ont été prélevés en vue de cultiver des microorganismes de ce site encore peu documenté. Des cultures d’enrichissement ont été réalisées à partir de ces échantillons en vue d’isoler de nouveaux taxons microbiens ayant des métabolismes clés des cycles biogéochimiques du soufre et du carbone ou une physiologie particulière (piézophilie). Parmi les isolats obtenus, il y avait notamment une nouvelle archée hyperthermophile anaérobie sulfo-réductrice, désignée comme CDGST, qui provenait du champ hydrothermal Beebe, à 4964 m de profondeur. Cette souche, affiliée au genre Thermococcus, présentait une certaine plasticité physiologique et se démarquait de ses plus proches parents du point de vue de sa physiologie.Elle a été caractérisée en détails aux niveaux métabolique, physiologique et génomique. Cette souche estpiézophile et possède la plus large gamme de pression de croissance jamais décrite pour un organisme. Elle se développe de manière optimale à 75°C, pH 6,0 et sous une pression hydrostatique de 50 MPa, la pression in situ de son habitat naturel. Elle appartient à une nouvelle espèce qui a été appelée Thermococcus piezophilus sp.nov. Son génome a été séquencé et annoté.La croissance de ce nouvel isolat est efficace de pression atmosphérique jusqu’à au moins 120 MPa, et la souche croît avec plus de difficultés jusqu'à 130 MPa. Aucun autre microorganisme, qu’il soit psychrophile, mésophile ou hyperthermophile ne possède une telle gamme de pression de croissance. Pour cette raison, les mécanismes d’adaptation de cette souche à la pression ont été étudiés par une approche de transcriptomique.Cette souche s’adapte aux variations de pression notamment en modulant sa production et sa conversion d’énergie (transporteurs, hydrogénases, etc.) en fonction de la pression. / Following the recent discovery of the world’s deepest hydrothermal vents at the Cayman Trough, hydrothermal samples were taken for culturing microorganisms of this site still poorly documented. Enrichment cultures were performed using these samples to isolate new microbial taxa having key metabolisms of biogeochemical cycles of carbon and sulfur or a particular physiology (piezophily). Among the isolates, there was a new hyperthermophilic and anaerobic sulfur-reducing archaea, designated as CDGST, originating from the hydrothermal field Beebe, at 4964 m depth. This strain belonged to the Thermococcus genus. It exhibited some physiological plasticity and was distinguishable from its closest relatives from the point of view of its physiology. It has been characterized in great details at metabolic, physiological and genomics levels. This strain is piezophilic and has the broadest range pressure for growth ever described for an organism. It grows optimally at 75°C, pH 6.0 and under a hydrostatic pressure of 50 MPa, the in situ pressure of its natural habitat. It belongs to a new species that was called Thermococcus piezophilus sp. nov. Its genome has been sequenced and annotated.The growth of this new isolate is effective from atmospheric pressure to at least 120 MPa, and the strain grows with more difficulties up to 130 MPa. No other organism, whether psychrophilic, mesophilic or hyperthermophilic has such a range of growth pressure. For this reason, the adaptation mechanisms to pressure of the strain were studied by a transcriptomic approach. This strain adapts to pressure variations, by modulating notably its energy production and energy conversion (carriers, hydrogenases, etc.) depending on the pressure.

Dans les trois domaines du vivant, que constituent les bactéries, les eucaryotes et les archées, une molécule a la capacité souveraine de gouverner la vie, la mère à l’origine de tous les mécanismes biologiques, l’ADN. S’il est évident de dire que le maintien de l’intégrité des génomes est essentiel à la vie, il existe deux systèmes qui le permettent, la réplication et la réparation de l’ADN. La fidélité de ces derniers est finement influencée par la disponibilité (ratio et balance) des précurseurs nucléotidiques désoxyribonucléotides (dNTPs) et ribonucléotides (rNTPs) au cours du cycle cellulaire. Même si la concentration intracellulaire en nucléotides est largement documentée chez les eucaryotes et les bactéries, ça n’est malheureusement pas le cas chez les archées. En ce qui concerne l’étude de la maintenance génomique, un groupe d’archées a intéressé les chercheurs de par leurs capacités à survivre dans des milieux dits extrêmes. Pyrococcus abyssi est l’une d’entre elles qui depuis de nombreuses années sert de modèle biologique pour répondre aux questions de la stabilité de l’ADN à haute température. Cette étude est centrée sur cette thématique et particulièrement sur les caractéristiques fonctionnelles des ADN polymérases: PolD, PolB et le complexe p41/p46. Initialement, le contenu en nucléotides a été évalué dans des cellules en phase exponentielle de croissance par la technique de chromatographie couplée à une double détection en spectrométrie de masse (zicHILIC-MS-MS). Les résultats montrent que le contenu en rNTPs est de 20 fois supérieur à celui en dNTPs. Pour cette raison, la discrimination sélective des dNTPs par les ADN polymérases est mise à l’épreuve. Même si, des mécanismes permettent d’exclure les rNMPs durant la synthèse de l’ADN, de récentes études ont montrées que des rNMPs étaient incorporés par des ADN pols. Ainsi, le ratio en nucléotides obtenu a été utilisé pour l’analyse de son effet sur la synthèse d’ADN par les ADN Pols et les extraits cellulaires de P. abyssi. Les résultats démontrent clairement que les rNMPs sont incorporés par l’ADN polymérase PolD. Puis, les conséquences de la présence des rNMPs dans l’ADN sur la réplication ont été étudiées et ont mis en évidence que les extraits cellulaires, tout comme les ADN Pols de P. abyssi étaient capables de « passer » un rNMP présent dans l’ADN. Pour finir, une étude de l’incorporation préférentielle de chaque dNMP et rNMP a été menée démontrant que la complémentarité des bases était respectée même lors de l’incorporation de rNMPs. Enfin, la caractérisation de la petite sous-unité, DP1, de PolD a permis de montrer sa capacité à retirer des rNMPs grâce à son activité de relecture, suggérant un premier rempart à la présence de rNMPs dans l’ADN. Pour conclure, ces résultats montrent que la présence de rNMPs dans l’ADN est un phénomène conservé dans les trois domaines du vivant. / In the three domains of life that include Bacteria, Eukarya and Archaea, one molecule has the sovereign ability to govern life, and not the least one, the mother of all biological mechanisms, DNA. Maintaining the integrity of genomes is obviously essential for life, and faithful DNA replication and repair are the guarantees. The fidelity of these two processes may vary depending on the availability and levels (balance and ratio) of deoxyribonucleotides (dNTPs) and ribonucleotides (rNTPs) during the cell-cycle. Even if intracellular concentration of nucleotides is largely documented in Eukarya and Bacteria, it remains limited in Archaea. From many years one group of Archaea is of great interest for studying genomic maintenance, because of its ability to survive in extremes environments. Pyrococcus abyssi is one of them that is used as biological model for deciphering the stability of DNA at elevated temperature in LM2E. The present work focuses on genomic integrity and particularly on the functional characterization of the three DNA polymerases: PolD, PolB and the p41/p46 complex. Initially, the nucleotide pool has been evaluated in exponentially growing cells using the highly sensitive method that combined chromatography and mass spectrometry (zicHILIC-MS-MS). The results show that rNTPs content is 20-fold higher than dNTPs. For that reason, fidelities of DNA polymerases are challenged to select the correct dNTP over the most abundant rNTP during DNA synthesis. Despite the fact that some mechanisms allow the exclusion of rNTPs from entry to the Pol active site, recent findings indicate that ribonucleotides are incorporated by different DNA Pols with surprisingly high frequency. In this work, the obtained intracellular balance and ratio of rNTPs and dNTP have been used to analyze their effect on DNA synthesis by P. abyssi DNA Pols and cell-free extracts. Our results clearly demonstrate that rNTP incorporation is detectable with distinct efficiencies among DNA pols. Secondly, the consequences of the presence of rNMPs in a DNA template on DNA polymerisation has been examined and highlights that cell-free extracts are able to bypass a single rNMP as well as replicative DNA polymerases. To strengthen that study, single nucleotide incorporation opposite rNMP or dNMP has been carried out and the results demonstrate that replicative Pyrococcus abyssi DNA Pols can basepair the complementary rNTPs opposite dNMPs, and vice-versa, the complementary dNTPs opposite rNMPs.Furthermore, the preliminary results obtained about the nucleolysis activities of the PolD small subunit, DP1, show that the DNA polymerase D is able to remove rNMPs from a DNA strand, suggesting a first level of protection against ribonucleotide contamination of DNA. Definitely, these data indicate that the presence of transient embedded rNMPs in genomic DNA represents a universally conserved phenomenon across Archaea, Bacteria and Eukarya.

Haloferax volcanii est une archée appartenant au phylum euryarchaeota et à la classe des Halobacteriales. Les mécanismes liés à la réplication et à la réparation chez les archées sont très similaires à ceux rencontrés chez les eucaryotes, faisant d’H. volcanii un des organismes modèle pour l’étude de la réplication et de la biologie des archées, notamment car de nombreux outils génétiques sont disponibles chez cet organisme. De plus, H. volcanii possède la particularité de pouvoir avoir toutes ses origines de réplication supprimées, soulevant beaucoup de questions sur les mécanismes impliqués. Plusieurs hypothèses ont été émises sur la façon dont cette souche initie sa réplication, basées soit sur la dérivation des mécanismes liés à la réparation de l’ADN, soit sur un mécanisme d’initiation de la réplication indépendant des origines. Afin d’étudier ces mécanismes liés à la réplication, j’ai construit une souche d’H. volcanii capable d’incorporer des analogues de la thymidine dans l’ADN lors de sa synthèse grâce à la délétion de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la thymidine. Des temps de cultures courts de la souche en présence d’un analogue permet son incorporation au niveau des zones actives de réplication pour marquer spécifiquement l’ADN néosynthétisé. L’immunodétection de l’analogue incorporé à l’ADN, en travaillant en cellule entière avec un microscope à fluorescence, permet la localisation de l’ADN néosynthétisé, reflétant ainsi les régions où la réplication est active. Ces analyses révèlent majoritairement 2 à 3 régions de réplication actives dans des cellules en prolifération, sans localisation particulière. Ces régions ont déjà été observées en étudiant la localisation d’une protéine clé de la réplication (RPA2) fusionnée à la protéine verte fluorescente GFP, confirmant sa localisation aux zones actives de réplication. Une étonnante variabilité observée d’une cellule à l’autre et suggère une initiation probabiliste de la réplication. Il est également étonnant de n’observer qu’aussi peu de zones actives de réplication, comparé au fort taux de polyploïdie de cette souche. Se pose alors la question de ce à quoi correspondent ces zones de réplication. Pour cela, j’ai développé chez H. volcanii la technique de peignage moléculaire permettant d’isoler des molécules individuelles d’ADN et révéler spécifiquement les analogues incorporés pour pouvoir déterminer le nombre de copies du chromosome qui sont actives lors de la réplication, ainsi que le nombre d’origines actives sur chacune des copies. J’ai également développé une technique de Time-lapse dans le but de suivre ces régions au cours du temps en observant les divisions cellulaires directement sous le microscope. / Haloferax volcanii is an archaea belonging to the phylum euryarchaeota and the class Halobacteriales. The mechanisms related to replication and repair in archaea are very similar to those found in eukaryotes, making H. volcanii a relevant model organisms for the study of replication and archaeal biology, especially since many genetic tools are available. Interestingly, all replication origins can be removed from the chromosome of H. volcanii, raising many questions about the mechanisms involved. Several hypotheses have been proposed on how this strain initiates its replication, either relying on recombination-dependent replication initiation or an origin-independent mechanism. In order to study these replication-related mechanisms, I have constructed a strain of H. volcanii able to incorporate thymidine analogues into DNA during its synthesis by deleting genes involved in the thymidine biosynthesis pathway. A short-time cultures of the strain in the presence of an analogue allows its incorporation in nascent DNA. By immunodetection of the analog coupled to fluorescence microscopy observation of whole cells, it is possible to investigate the localization of neosynthesized DNA,which reflect the regions where replication is active. These analyses revealed mainly 2 to 3 active replication regions per cell, without any particular location. These regions had already been observed by studying the localization of a key replication protein (RPA2) fused to the fluorescent green protein GFP, confirming its location in active replication areas. A surprising variability in the number of replication foci from one cell to another was observed, suggesting a probabilistic initiation of replication. It is also surprising to observe so few active replication areas compared to the high polyploidy of this strain. This raises the question of what these replication areas correspond to. For further understanding, I developed for H. volcanii molecular combing, to isolate individual DNA molecules and specifically reveal incorporated analogues to determine the number of copies of the chromosome that are being replicated, as well as the number of active origins on each of the copies. I have also developed time-lapse approach to track these regions over time by monitoring cell proliferation directly under the microscope.