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Για περισσότερο από έναν αιώνα, οι εντερόκοκκοι προβληματίζουν τους ερευνητές ως προς την ταξινόμηση, τη λοιμογόνο ικανότητα, την επιδημιολογία και την ανθεκτικότητα τους στα αντιβιοτικά, αλλά και ως προς τη διασπορά τους στο περιβάλλον, αφού αυτή συνδέεται άμεσα με τη Δημόσια Υγεία. Οι εντερόκοκκοι, αποτελούν μέρος της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας ανθρώπων και ζώων και μπορούν να επιβιώσουν στο υδάτινο περιβάλλον για μεγάλο χρονικό διάστημα, κάτω από αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες. Στον άνθρωπο προκαλούν βακτηριαιμία, ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις του ουροποιητικού και άλλων συστημάτων. Μέσο διασποράς τους μπορεί να είναι και το περιβάλλον, γεγονός που καθιστά τη μελέτη της οικολογίας τους και την επιδημιολογική τους επιτήρηση ζωτικής σημασίας. Κατά τη χρονική περίοδο 10/2009-7/2010 στο νομό Αχαΐας, από 2115 δείγματα θαλάσσιου, επιφανειακού και πόσιμου ύδατος, 168 δείγματα βρέθηκαν θετικά για παρουσία εντερόκοκκων μετά από καλλιέργεια σε SB agar, δοκιμασία υδρόλυσης εσκουλίνης, αρνητική αντίδραση καταλάσης, ανάπτυξη σε 6,5% NaCl και βιοτυπία με Vitek. Επιπλέον, προσδορίστηκε η αντοχή στα αντιβιοτικά Penicilin, Erythromycin, Vancomycin, Teicoplanin, Chloramphenicol, Ciprofloxacin και Quinupristin/Dalfopristin. Ακολούθησε Pulsed-Field Gel Electrophoresis για την τυποποίηση των στελεχών σε κλώνους. Τέλος, πραγματοποιήθηκε συσχέτιση με αντίστοιχα κλινικά στελέχη ασθενών από το ΠΓΝΠ. Τα 121 από τα 168 δείγματα ανήκουν στο γένος των εντεροκόκκων, σύμφωνα με τον βιοχημικό φαινότυπο (50 E. faecalis, 43 E. faecium, 10 E. villorum, 9 E. gallinarum, 5 E. casseliflavus και 4 E.durans). To 85% των εντεροκόκκων ήταν ευαίσθητα στην Ρenicillin, το 17% στην Erythromycin, το 95% στην Vancomycin, το 100% στην Teicoplanin, το 70% στην Chloramphenicol και το 1% στην Ciprofloxacin. Συνολικά ταυτοποίηθηκαν σε κλώνους 76 από τα 105 στελέχη. Τα E. faecalis σε 2 ομάδες, τα E. faecium σε 5, τα E. gallinarum σε 3, τα E. villorum σε 1, τα E. casseliflavus σε 1 και τα E.durans σε 1. / For more than a century, there is great concern about enterococci, regarding the classification, pathogenicity, epidemiology and resistance to antibiotics, but also the distribution into the environment, since this fact is directly linked to Public Health. Enterococci are part of the normal intestinal flora of humans and animals and can survive in the aquatic environment for long periods under adverse environmental conditions. In humans, enterococci are leading causes of bacteraemia, endocarditis and urinary tract infections.. The environment is involved in their distribution, which makes the study of their ecology and the epidemiological surveillance of vital importance. During the period 10/2009-7/2010, in the geographic area of the prefecture of Achaia, 2115 samples from marine, surface and drinking water were collected and 168 of them were positive for the presence of enterococci according to inoculation in SB agar, bile-aesculin agar, negative catalase reaction, growth in 6,5% NaCl and biotyping with Vitek. Moreover, resistance to Penicillin, Erythromycin, Vancomycin, Teicoplanin, Chloramphenicol, Ciprofloxacin and Quinupristin / Dalfopristin was determined. Pulsed-Field Gel Electrophoresis was applied for clonal identification. Finally, a correlation with corresponding clonal types isolated from patients hospitalised at the University Hospital of Patras was performed. One hundrend and twenty-one out of 168 isolates were identified as enterococci, according to their biotypes (50 E. faecalis, 43 E. faecium, 10 E. villorum, 9 E. gallinarum, 5 E. casseliflavus and 4 E.durans). 85% of enterococci were sensitive to Penicillin, 17% to Erythromycin, 95% to Vancomycin, 100% to Teicoplanin, 70% to Chloramphenicol, and 1% to Ciprofloxacin. Overall 76 of the 105 strains were grouped. E. faecalis strains were classified into two PFGE types, E. faecium into five, E. gallinarum into three, E. villorum into one, E. casseliflavus into one and E.durans into one.

L’hème est une molécule essentielle à de nombreuses fonctions bactériennes. Cependant, cette molécule génère des radicaux libres qui lui confèrent des propriétés toxiques. Nous avons caractérisé les mécanismes de l’homéostasie de l’hème impliquant le transporteur d’efflux HrtBA. Chez L. lactis nous avons démontré que HrtBA empêche l’accumulation membranaire et intracellulaire d’hème exogène par un mécanisme ménaquinone dépendant. HrtBA est aussi présent chez de nombreux pathogènes. Chez S. agalactiae, la transcription de HrtBA est régulée par un système à deux composants HssRS. Le senseur HssS reconnait l’hème exogène internalisé. Pour élucider le rôle de l’hème de l’hôte dans la virulence de S. agalactiae, un modèle d’infection systémique chez la souris utilisant la luminescence (lux) et l’imagerie in vivo (IVIS) a été mis en place. Le suivi de la luminescence de bactéries hypersensibles à l’hème (ΔhrtBA) montre que l’hème de l’hôte est toxique et que la capacité de S. agalactiae à assurer son homéostasie est déterminante pour ’linfection. De manière similaire, en montrant que le métabolisme respiratoire est indispensable pour l’infection (ΔcydA), S. agalactiae dépend donc de sa capacité à acquérir l’hème de l’hôte pour être infectieuse. En utilisant le promoteur de HrtBA couplé à l’opéron lux, nous avons étudié la capacité de S. agalactiae à détecter et acquérir l’hème in vivo au cours de l’infection. Nos résultats montrent que l’hème de l’hôte est particulièrement biodisponible dans le foie. Au contraire dans le cerveau, l’hème n’est pas détecté par la bactérie. Nos résultats démontrent que l’hème de l’hôte est un paramètre important des capacités d’adaptation de S. agalactiae à son hôte lors de l’infection. Bloquer HrtBA ou le senseur d’hème HssS pourrait constituer une cible pour la recherche antibiotique chez S. agalactiae ou d’autres pathogènes. Enfin, nous avons démontré chez E. faecalis que l’expression de HrtBA est aussi dépendante d’un système à deux composants. Nous avons utilisé la même stratégie que pour S. agalactiae pour créer un senseur d’hème spécifique qui a permis de démontrer pour la première fois que E. faecalis rencontre et utilise l’hème du tractus digestif. / Heme is a redox-reactive molecule with essential function in bacterial metabolism. However, this molecule generates reactive oxygen species responsible for its toxicity. We characterized the mechanism of heme homeostasis involving the efflux transporter HrtBA. In L. lactis, we demonstrated that HrtBA prevents from membrane and intracellular accumulation of internalized exogenous heme thanks to a menaquinone dependent mechanism. HrtBA is also present in several pathogens. In S. agalactiae, the transcription of HrtBA is regulated by a two-component system HssRS. The HssS sensor recognizes internalized exogenous heme. To clarify the role of heme of the host in the virulence of S. agalactiae, a systemic infection model in mice using luminescence (lux) and in vivo imaging (IVIS) has been set up. The monitoring of luminescence generated by heme hypersensitive (ΔhrtBA) bacteria shows that heme of host is toxic and that the capability of S. agalactiae to control heme homeostasis is crucial for infection. In the same way, by demonstrating that respiratory metabolism is crucial for infection (ΔcydA), we demonstrated that S. agalactiae depends on its capacity to acquire the heme of the host to become infectious. By using the HrtBA promoter coupled with lux operon, we studied the capacity of S. agalactiae to detect and to acquire heme in vivo during the infection. Our results show that host heme is especially biodisponible in the liver. On the contrary, heme is not detected by bacteria in the brain. Our results prove that heme of the host is an important parameter for the adaptation of S. agalactiae to its host during infection. Blocking HrtBA or heme sensor HssS could so be a target for antibiotic research against S. agalactiae and other pathogens. Finally, we show in E. faecalis that HrtBA expression also depends on a two-component system. We used the same strategy as in S. agalactiae to create a specific heme sensor that allowed us to demonstrate for the first time that E. faecalis meets and uses heme in the digestive tract.

Les produits laitiers fermentés tels que les yaourts, les laits fermentés et les fromages frais, occupent une place importante dans l’économie française. La stabilité de ces produits et leurs chances d’exportation sont cependant limitées par de fréquentes altérations fongiques. De plus, l’augmentation des résistances de certains champignons aux conservateurs chimiques ainsi que la forte demande des consommateurs pour des produits dépourvus d’additifs poussent les industriels à en réduire l’ajout. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer des alternatives innovantes, telle que la bio-conservation. Les bactéries lactiques, utilisées depuis des millénaires dans la fermentation de nombreux aliments, et généralement reconnues comme inoffensives pour la santé, sont potentiellement de bonnes candidates pour la bio-conservation. Dans le but d’obtenir une ou deux souches de bactéries lactiques antifongiques, capables d’être compétitives au sein de produits laitiers fermentés tels que le yaourt, une collection de bactéries lactiques antifongiques a d’abord été constituée. Pour cela, un criblage de colonies isolées de laits crus de vache, de chèvre et de brebis a été effectué sur une période d’une année. Ce criblage, ciblé contre 4 champignons communément retrouvés dans les produits laitiers contaminés, a abouti à l’isolement de 1235 colonies de bactéries lactiques antifongiques. Ceci a permis d’évaluer la biodiversité des bactéries lactiques antifongiques d’une part, et celle des champignons, d’autre part, dans ces échantillons de lait, afin d’observer une éventuelle corrélation entre la présence de champignons et l’expression des activités antifongiques. L’influence de l’origine du lait, de la période d’échantillonnage, du milieu d’isolement et du champignon ciblé, sur le pourcentage de colonies actives isolées a été mise en évidence. Parmi les champignons ciblés, Pénicillium expansum était le plus facilement inhibé, et la majorité des colonies ont été isolées durant la troisième période d’échantillonnage, majoritairement sur les milieux à base de MRS. Les laits de vache et de chèvre se sont révélés être des réservoirs de bactéries lactiques antifongiques, contrairement aux laits de brebis. La majorité des bactéries lactiques antifongiques isolées et identifiées appartenait au genre Lactobacillus, majoritairement du groupe Lb. casei. Onze isolats, dont 10 appartenant au groupe Lb. casei, ont été sélectionnés selon l’intensité de leur activité antifongique et leur spectre d’action sur milieu MRS. Certaines de leurs propriétés technologiques ont été caractérisées, en vue de leur utilisation comme cultures protectrices dans des produits laitiers fermentés. Leur activité antifongique a également été testée dans le lait et dans le yaourt, contre 6 contaminants fongiques communément responsables d’altérations dans les yaourts. Une souche, Lb. harbinensis K.V9.3.1Np, a révélé de fortes activités antifongiques dans le yaourt contre 6 cibles fongiques. Les études complémentaires effectuées ont permis de montrer que la variation de certains paramètres technologiques (présence ou absence de saccharose, temps de fermentation) n’avait pas d’influence sur l’activité antifongique de cette souche. La découverte du potentiel antifongique de Lb. harbinensis K.V9.3.1Np est innovante. Cette espèce, isolée pour la première fois en 2005 d’un produit fermenté végétal, n’avait encore jamais été décrite comme présentant des activités antimicrobiennes. Sa forte activité antifongique dans le yaourt fait de Lb. harbinensis K.V9.3.1Np un bon candidat pour la bioconservation de produit(s) laitier(s) fermenté(s). / Fermented dairy products such as yogurt, fermented milks and fresh cheeses are of great importance in the French economy. The stability of these products and export opportunities are however limited by frequent fungal spoilages. In addition, the increase of fungal resistances to Chemical preservatives and the strong consumer demand for products deprived of Chemical additives are pushing manufacturers to reduce the quantities of added Chemical preservatives in these products. In this context, it is necessary to develop alternatives to classical food preservation methods, such as biopreservation. Lactic acid bacteria (LAB), used for millennia for diverse food fermentations, and generally recognized as safe for human health, can potentially be used for biopreservation. In order to select 1 or 2 LAB strains with antifungal activity capable to compete in fermented dairy products such as yogurt, a collection of antifungal LAB was first created. This was done by screening colonies isolated from cow, goat and ewe raw milk samples over a one-year period. This screening step, targeted against 4 fungi found in contaminated dairy products, resulted in the isolation of 1235 antifungal colonies. The biodiversity of the isolated antifungal LAB was then determined along with that of the fungi found in the different raw milks, in order to observe a possible correlation between the presence of fungi and the expression of antifungal activities. The influence of milk origin, sampling period, isolation medium and targeted fungus on the percentage of isolated active colonies was highlighted and clearly showed that both cow and goat milks were reservoirs of antifungal LAB. Among the targeted fungi, P. expansum was more easily inhibited, and the majority of colonies were isolated during the third sampling period, mainly on MRS-based media. The majority of identified antifungal LAB belonged to the genus Lactobacillus, mainly to the Lb. casei group. Eleven isolates, including 10 belonging to the Lb. casei group, were selected from these lactobacilli, according to their activity level and action spectrum in MRS medium. Some of their technological properties were characterized for their potential use as protective cultures in fermented dairy products and their antifungal activity was tested in milk and yogurt. To do this, 6 fungal contaminants commonly encountered in yogurt spoilage were used. A particular strain, Lb. harbinensis K.V9.3.1Np, showed a strong antifungal activity in yogurt. Additional experiments showed that the variation of technological parameters (presence or absence of sugar, fermentation time) had no influence on the antifungal activity of this strain. This is the first time that an antifungal potential has been observed for Lb. harbinensis, a species isolated for the first time in 2005 from a fermented vegetable product. Because of its effectiveness in yogurt, Lb. harbinensis K.V9.3.1Np is a promising strain for biopreservation of fermented dairy product(s).