Les produits laitiers fermentés tels que les yaourts, les laits fermentés et les fromages frais, occupent une place importante dans l’économie française. La stabilité de ces produits et leurs chances d’exportation sont cependant limitées par de fréquentes altérations fongiques. De plus, l’augmentation des résistances de certains champignons aux conservateurs chimiques ainsi que la forte demande des consommateurs pour des produits dépourvus d’additifs poussent les industriels à en réduire l’ajout. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer des alternatives innovantes, telle que la bio-conservation. Les bactéries lactiques, utilisées depuis des millénaires dans la fermentation de nombreux aliments, et généralement reconnues comme inoffensives pour la santé, sont potentiellement de bonnes candidates pour la bio-conservation. Dans le but d’obtenir une ou deux souches de bactéries lactiques antifongiques, capables d’être compétitives au sein de produits laitiers fermentés tels que le yaourt, une collection de bactéries lactiques antifongiques a d’abord été constituée. Pour cela, un criblage de colonies isolées de laits crus de vache, de chèvre et de brebis a été effectué sur une période d’une année. Ce criblage, ciblé contre 4 champignons communément retrouvés dans les produits laitiers contaminés, a abouti à l’isolement de 1235 colonies de bactéries lactiques antifongiques. Ceci a permis d’évaluer la biodiversité des bactéries lactiques antifongiques d’une part, et celle des champignons, d’autre part, dans ces échantillons de lait, afin d’observer une éventuelle corrélation entre la présence de champignons et l’expression des activités antifongiques. L’influence de l’origine du lait, de la période d’échantillonnage, du milieu d’isolement et du champignon ciblé, sur le pourcentage de colonies actives isolées a été mise en évidence. Parmi les champignons ciblés, Pénicillium expansum était le plus facilement inhibé, et la majorité des colonies ont été isolées durant la troisième période d’échantillonnage, majoritairement sur les milieux à base de MRS. Les laits de vache et de chèvre se sont révélés être des réservoirs de bactéries lactiques antifongiques, contrairement aux laits de brebis. La majorité des bactéries lactiques antifongiques isolées et identifiées appartenait au genre Lactobacillus, majoritairement du groupe Lb. casei. Onze isolats, dont 10 appartenant au groupe Lb. casei, ont été sélectionnés selon l’intensité de leur activité antifongique et leur spectre d’action sur milieu MRS. Certaines de leurs propriétés technologiques ont été caractérisées, en vue de leur utilisation comme cultures protectrices dans des produits laitiers fermentés. Leur activité antifongique a également été testée dans le lait et dans le yaourt, contre 6 contaminants fongiques communément responsables d’altérations dans les yaourts. Une souche, Lb. harbinensis K.V9.3.1Np, a révélé de fortes activités antifongiques dans le yaourt contre 6 cibles fongiques. Les études complémentaires effectuées ont permis de montrer que la variation de certains paramètres technologiques (présence ou absence de saccharose, temps de fermentation) n’avait pas d’influence sur l’activité antifongique de cette souche. La découverte du potentiel antifongique de Lb. harbinensis K.V9.3.1Np est innovante. Cette espèce, isolée pour la première fois en 2005 d’un produit fermenté végétal, n’avait encore jamais été décrite comme présentant des activités antimicrobiennes. Sa forte activité antifongique dans le yaourt fait de Lb. harbinensis K.V9.3.1Np un bon candidat pour la bioconservation de produit(s) laitier(s) fermenté(s). / Fermented dairy products such as yogurt, fermented milks and fresh cheeses are of great importance in the French economy. The stability of these products and export opportunities are however limited by frequent fungal spoilages. In addition, the increase of fungal resistances to Chemical preservatives and the strong consumer demand for products deprived of Chemical additives are pushing manufacturers to reduce the quantities of added Chemical preservatives in these products. In this context, it is necessary to develop alternatives to classical food preservation methods, such as biopreservation. Lactic acid bacteria (LAB), used for millennia for diverse food fermentations, and generally recognized as safe for human health, can potentially be used for biopreservation. In order to select 1 or 2 LAB strains with antifungal activity capable to compete in fermented dairy products such as yogurt, a collection of antifungal LAB was first created. This was done by screening colonies isolated from cow, goat and ewe raw milk samples over a one-year period. This screening step, targeted against 4 fungi found in contaminated dairy products, resulted in the isolation of 1235 antifungal colonies. The biodiversity of the isolated antifungal LAB was then determined along with that of the fungi found in the different raw milks, in order to observe a possible correlation between the presence of fungi and the expression of antifungal activities. The influence of milk origin, sampling period, isolation medium and targeted fungus on the percentage of isolated active colonies was highlighted and clearly showed that both cow and goat milks were reservoirs of antifungal LAB. Among the targeted fungi, P. expansum was more easily inhibited, and the majority of colonies were isolated during the third sampling period, mainly on MRS-based media. The majority of identified antifungal LAB belonged to the genus Lactobacillus, mainly to the Lb. casei group. Eleven isolates, including 10 belonging to the Lb. casei group, were selected from these lactobacilli, according to their activity level and action spectrum in MRS medium. Some of their technological properties were characterized for their potential use as protective cultures in fermented dairy products and their antifungal activity was tested in milk and yogurt. To do this, 6 fungal contaminants commonly encountered in yogurt spoilage were used. A particular strain, Lb. harbinensis K.V9.3.1Np, showed a strong antifungal activity in yogurt. Additional experiments showed that the variation of technological parameters (presence or absence of sugar, fermentation time) had no influence on the antifungal activity of this strain. This is the first time that an antifungal potential has been observed for Lb. harbinensis, a species isolated for the first time in 2005 from a fermented vegetable product. Because of its effectiveness in yogurt, Lb. harbinensis K.V9.3.1Np is a promising strain for biopreservation of fermented dairy product(s).

L'objectif de ce travail était de sélectionner de manière rationnelle une bactérie probiotique par la mise en place d'un crible ainsi que d'étudier et de comprendre l'impact du potentiel d'oxydoréduction (Eh) et du bullage de gaz sur la survie de Bifidobacterium bifidum dans un produit laitier fermenté. Nous avons tout d’abord développé des techniques de sélection des bactéries sur des critères de viabilité / vitalité (analyse par cytométrie en flux) ainsi que sur des critères de fonctionnalité (pouvoir antioxydant). Nous avons pu sélectionner des souches d'intérêt industriel ainsi qu'une souche d'étude académique, Bifidobacterium bifidum.Nous avons ensuite étudié l'effet de la modification du Eh par bullage de gaz sur la survie de B. bifidum dans un produit laitier fermenté. Les laits fermentés conditionnés sous atmosphère anaérobie (Azote) et/ou réductrice (Azote-Hydrogène) permettent une meilleure survie de la souche au cours du stockage (28 jours – 4 °C) par rapport au Contrôle. Puis, nous avons analysé l'effet d'une croissance sous différents Eh sur la viabilité en milieu modèle et la fonctionnalité de B. bifidum. Une croissance en condition anaérobie et/ou réductrice permet d’améliorer à la fois la résistance aux stress (stress oxydant d’ordre physiologique, stress aux sels biliaires et stress côlon), le pouvoir réducteur (sels de tétrazolium), le pouvoir antioxydant (test KRL et test des comètes) et l’adhérence par rapport au Contrôle. Une modulation des propriétés biochimiques membranaires sous Azote et sous Azote-Hydrogène pourraient expliquer ces phénomènes. L’augmentation des composés thiols exofaciaux et l’augmentation des acides gras insaturés à longues chaines est observée pour des cellules produites sous conditions Azote et Azote-Hydrogène. Ainsi ces conditions de croissance présentent une amélioration majeure de l’effet probiotique de B. bifidum, à la fois d’un point de vue de sa résistance aux stress que d’un point de vue de sa fonctionnalité / The aim of this work was to select rationally a probiotic strain by setting up a screening method as well as study and understand the impact of the redox potential (Eh) and gas bubbling on the survival of Bifidobacterium bifidum in a fermented dairy product. In a first time, we have developed selection techniques of probiotic bacteria on the criteria of viability / vitality (flow cytometry analysis) and on the criteria of functionality (antioxidant). We were able to select strains of industrial interest as well as an academic strain, Bifidobacterium bifidum.Secondly, we have studied effect of modifying redox potential by gas bubbling on the survival of B. bifidum in a fermented dairy product. Thus, fermented milk manufactured under anaerobic condition (Nitrogen,) and/or under reducing one (Nitrogen-Hydrogen) allow a better survival of the probiotic strain during the storage (28 days) at 4 °C compared with the Control fermented milk. Yogurt starter strains are not impacted. Then, we have analysed the effect of a growth under various Eh on the viability in model medium and the functionality of B. bifidum. A growth under anaerobic and/or reducing condition thus improved resistance to stress (physiological oxidative stress, bile salts and intestinal stress) the reducing power (tetrazolium salts) and the antioxidant power (KRL test and comet assay) compared with the Control. The adhesion to Caco-2 cells under these conditions is also improvedModulation of biochemical membrane properties under Azote and Azote-Hydrogen conditions could explain these phenomena. An increase in the proportion of exofacial thiol groups and in the proportion of unsaturated fatty acids with long chain was observed for cells produced under Nitrogen and Nitrogen-Hydrogen. These growth conditions present a major improvement for the probiotic effect of B. bifidum, regarding its resistance to stress and its functionality

Parmi les bactéries lactiques, Lactococcus lactis est la plus utilisée en fabrication fromagère. Actuellement, les ferments lactiques sont majoritairement choisis pour leurs propriétés acidifiantes, protéolytiques et aromatiques. Un autre paramètre majeur est le potentiel redox (Eh). En effet, un Eh réducteur est souvent associé à une bonne qualité aromatique. L’activité réductrice de L. lactis pourrait donc être un nouveau paramètre à prendre en compte dans la maitrise du Eh dans la fabrication des produits laitiers fermentés. Néanmoins, les mécanismes impliqués dans l’activité réductrice de L. lactis demeurent encore inconnus. L’objectif de ce présent travail de thèse a été de les découvrir. Tout d’abord, nous avons développé des milieux de culture gélosé de discrimination redox utilisant des sels de tétrazolium pour cribler une banque de mutants aléatoires de L. lactis. Ceci a permis de démontrer la participation partielle de la chaine de transport d’électrons (Ménaquinones) dans l’activité réductrice de L. lactis. Ensuite, l’approche biochimique nous a permis de déterminer les composés biochimiques principaux contribuant à la diminution du Eh vers des valeurs très réductrices. La présence de groupements thiols exofaciaux est responsable du Eh réducteur atteint par L. lactis. Enfin, l’analyse protéomique utilisant un marquage spécifique des protéines thiols de surface a mis en évidence la présence d’une dizaine de protéines exposant des groupements thiols exofaciaux potentiellement impliquées dans l’activité réductrice de L. lactis. Les thiols sont connus pour être de très puissants antioxydants ce qui confère à L. lactis un intérêt supplémentaire à prendre en considération dans l’élaboration des produits laitiers fermentés. / Among the Lactic Acid Bacteria, Lactococcus lactis is the most used in cheese making. Nowadays, starters are used mainly for their acidifying, proteolytic and flavor properties. Another important parameter is the redox potential (Eh). Indeed, reducing Eh is often related to good flavor properties. The reducing activity of L.lactis should be therefore a new parameter to take into account in the monitoring of Eh during dairy fermented products making. Nevertheless, the mechanisms involved in the reducing activity of L.lactis are still unknown. The aim of this work was to understand them. First of all, we have developed tetrazolium salts agar plate media in order to screen a random bank of mutants of L. lactis on their redox capacities. These media allowed us to demonstrate the partial implication of the electron transport chain (Menaquinone) in the reducing activities of L. lactis. Secondly, we have determined the biochemical compounds involved in the decrease of Eh to very reducing values thanks to a biochemical approach. Exofacial thiol groups are mainly responsible for the reducing Eh reached by L.lactis. Lastly, a proteomical analysis using a specific staining of thiols surface proteins revealed the presence of about ten proteins displaying thiols exofacials groups. These proteins might be involved in the reducing activity of L.lactis. Thiols are known to be very strong antioxidants which confer to L. lactis an additional interest to consider in dairy products making.

L'objectif de ce travail était de sélectionner de manière rationnelle une bactérie probiotique par la mise en place d'un crible ainsi que d'étudier et de comprendre l'impact du potentiel d'oxydoréduction (Eh) et du bullage de gaz sur la survie de Bifidobacterium bifidum dans un produit laitier fermenté. Nous avons tout d'abord développé des techniques de sélection des bactéries sur des critères de viabilité / vitalité (analyse par cytométrie en flux) ainsi que sur des critères de fonctionnalité (pouvoir antioxydant). Nous avons pu sélectionner des souches d'intérêt industriel ainsi qu'une souche d'étude académique, Bifidobacterium bifidum.Nous avons ensuite étudié l'effet de la modification du Eh par bullage de gaz sur la survie de B. bifidum dans un produit laitier fermenté. Les laits fermentés conditionnés sous atmosphère anaérobie (Azote) et/ou réductrice (Azote-Hydrogène) permettent une meilleure survie de la souche au cours du stockage (28 jours - 4 °C) par rapport au Contrôle. Puis, nous avons analysé l'effet d'une croissance sous différents Eh sur la viabilité en milieu modèle et la fonctionnalité de B. bifidum. Une croissance en condition anaérobie et/ou réductrice permet d'améliorer à la fois la résistance aux stress (stress oxydant d'ordre physiologique, stress aux sels biliaires et stress côlon), le pouvoir réducteur (sels de tétrazolium), le pouvoir antioxydant (test KRL et test des comètes) et l'adhérence par rapport au Contrôle. Une modulation des propriétés biochimiques membranaires sous Azote et sous Azote-Hydrogène pourraient expliquer ces phénomènes. L'augmentation des composés thiols exofaciaux et l'augmentation des acides gras insaturés à longues chaines est observée pour des cellules produites sous conditions Azote et Azote-Hydrogène. Ainsi ces conditions de croissance présentent une amélioration majeure de l'effet probiotique de B. bifidum, à la fois d'un point de vue de sa résistance aux stress que d'un point de vue de sa fonctionnalité