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Synthesis of new dicinnamoyl quinic acid derivatives and analogs and the evaluation of their potential as biopesticides / Synthèse de dérivés et analogues des acides dicinnamoyl quiniques nouvelle et évaluation de leur activité insecticideLi, Xiubin 28 April 2016 (has links)
L'utilisation de pesticides conventionnels, en particulier les pesticides chimiques de synthèse, a considérablement réduit les pertes de récoltes et a connu un succès commercial. Cependant, l'utilisation excessive de pesticides chimiques qui manquent de toxicité spécifique a provoqué une série de problèmes environnementaux et de santé publique. L'intérêt de la recherche vers de nouveaux biopesticides naturels avec de nouveaux modes d'actions vise à un meilleur équilibre entre l'efficacité des pesticides et la réduction des méfaits possibles pour l'environnement et les humains. Les plantes sont une source importante de biopesticides. Les acides chlorogéniques (CQA), isolés à partir de diverses plantes et présentent in vivo et in vitro un large spectre d'activités biologiques, ont attiré l'attention avec un potentiel comme biopesticides basé sur la toxicité brevetée de l'acide 3,5-di-O-caféoylquinique contre les larves de Myzus persicae. L'étude des propriété insecticides notamment la mode d'action et l'étude de certaines relations structure-activité pourrait bénéficier de la synthèse de différents dérivés et analogues de CQA. Des analogues des acides 4-désoxy-3,5-dicinnamoy quiniques et 3,4- et 4,5-dicinnamoylquiniques naturels ont été synthétisés. Sept analogues dans la série 4-désoxy ont été soumis à des essais insecticides et deux composés présentent une activité insecticide plus élevée que l'acide 3,5-dicaféoylquinique naturel. Comme perspectives à ce travail, confirmer l'activité des composés synthétisés sur d'autres espèces de pucerons d'importance agronomique pourrait être réalisé. De plus, d’autres collaborations avec des biologistes pourraient être établies afin d’évaluer d'autres activités des composés synthétisés ou les utiliser comme outils pour étudier des mécanismes de biosynthése. / The use of conventional pesticides, especially the synthetic chemical pesticides, has greatly reduced the crop losses and gained a commercial success. However, the excessive use of pesticides lacking toxic specificity has caused a series of environmental and public health problems. The research interest toward new naturally-occurring biopesticides with novel modes of actions aims at a better balance between the efficiency of pesticide and reducing possible harms to environment and humans. Botanicals are an important source of biopesticides. Cinnamoyl quinic acids (CQA), isolated from various plants and shown to exhibit in vivo and in vitro a wide spectrum of biological activities, have attracted the attention with potential as biopesticides based on the patented toxicity of 3,5-di-O-caffeoylquinic acid against the larvae of Myzus persicae. The investigation of the insecticidal activity of CQA including their mode of action and the study of some structure-activity relationships could benefit from the synthesis of different CQA derivatives and analogs. A series of natural CQA derivatives natural 3,4- and 4,5-dicinnmamoylquinic acid derivatives but also analogs like 4-deoxy-3,5-dicinnamoylquinic acids were so synthesized. Seven targeted 4-deoxy CQA analogs were subjected to insecticidal assays, and two compounds were found to exhibit higher insecticidal activities than natural 3,5-dicaffeoylquinic acid. As perspectives to this work, confirming the activity of the synthesized compounds on other aphid species of agronomic importance could be performed. Furthermore, other collaborations could be established with biologists dedicated to measure other bioactivities of the synthesized compounds or use them as tools to investigate various biological pathways.
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Immune and developmental regulations in host-symbiont interactions in the cereal weevil Sitophilus spp. / Régulations immunitaires et développementales dans les interactions hôtes-symbiotes chez le charançon des céréales Sitophilus spp.Maire, Justin 05 December 2018 (has links)
La symbiose est un phénomène ubiquitaire dans la nature et joue un rôle évolutif majeur. Alors que la communauté scientifique reconnaît désormais l’importance des associations symbiotiques dans de nombreux processus biologiques et pathologiques chez les animaux, la compréhension des mécanismes de contrôle, de tolérance et de modulation des populations symbiotiques est un enjeu majeur. Pour aborder ces questions, j’ai étudié l’association entre le charançon Sitophilus et la bactérie intracellulaire Sodalis pierantonius. Sitophilus héberge son endosymbiote dans des cellules spécialisées, les bactériocytes, regroupées en un organe, le bactériome. En retour, S. pierantonius fournit à son hôte des nutriments présents en faibles quantités dans son alimentation, les céréales. S. pierantonius étant immunogène pour son hôte, dans un premier chapitre, j’ai étudié les régulations immunitaires spécifiques au bactériome assurant le maintien de l’homéostasie immunitaire. J’ai dans un premier temps montré que la compartimentalisation des endosymbiotes, limitant les contacts immunitaires avec l’hôte, repose sur l’expression IMD-dépendante d’un peptide antimicrobien, une régulation similaire aux réponses immunitaires aux pathogènes. Ensuite, j’ai montré comment l’immunogénicité des endosymbiotes, via son peptidoglycane, est limitée par des Protéines de Reconnaissance du PeptidoGlycane (PGRP). Le peptidoglycane symbiotique ne semble pas être reconnu dans le bactériome, et sa reconnaissance systémique est contenue par l’action locale de PGRP-LB. Cette protéine clive le peptidoglycane symbiotique, empêchant ainsi l’activation chronique du système immunitaire systémique. Dans un deuxième chapitre, j’ai étudié comment, au cours de la métamorphose, le bactériome se réorganise complètement. Le bactériome larvaire se dissocie, les bactériocytes migrent le long de l’intestin et forment de multiples nouveaux bactériomes. Une approche de dual-RNAseq nous a permis de révéler l’implication à la fois de l’hôte et du symbiote dans ce remodelage morphologique. Les résultats obtenus durant cette thèse montrent l’impact incommensurable des bactéries sur des processus immunitaires et développementaux, et sur l’évolution des animaux en général. / Symbiosis is ubiquitous in nature and plays a crucial role in evolution. As the scientific community is becoming increasingly aware of the importance of such associations in both biological and pathological processes in animals, understanding how symbiotic populations are controlled, tolerated, and modulated, is becoming a major stake. To address these questions, I studied the mutualistic association between the weevil Sitophilus and the intracellular bacterium Sodalis pierantonius. Sitophilus houses S. pierantonius in specialized host cells, the bacteriocytes, which group together in an organ, the bacteriome. In return, S. pierantonius provides its host with nutrients scarecely present in its cereal-based diet. S. pierantonius being immunogenic for its host, I studied in a first chapter how specific bacteriome immune regulations ensure the maintenance of host immune homeostasis. In a first part, I showed that endosymbiont compartmentalization, which limits host-endosymbiont immune contacts, relies on the IMD-dependent expression of one antimicrobial peptide, a regulation similar to that of immune responses in pathogenic conditions. Then, I showed how endosymbiont immunogenicity, via its peptidoglycan, is tamed by PeptidoGlycan Recognition Proteins (PGRPs). While symbiotic peptidoglycan would not be recognized within the bacteriome, its systemic recognition is circumscribed by PGRP-LB local action. PGRP-LB cleaves symbiotic peptidoglycan, thereby preventing a chronical and detrimental activation of the host systemic immunity. In a second chapter, I studied how, during metamorphosis, the bacteriome is completely remodeled. The larval bacteriome dissociates, bacteriocytes migrate along the midgut, and settle in multiple new bacteriomes. A dual-RNAseq approach allowed us to pinpoint both host and symbiont implication in this drastic morphological reorganization. The results obtained during this PhD show the immeasurable impact bacteria bear on host immune and developmental processes, and more generally on animal evolution.
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Régulations immunitaires et cellulaires impliquées dans le maintien et le contrôle des bactéries endosymbiotiques du charançon des céréales du genre Sitophilus spp. / Maintenance and control of the endosymbionts of the cereal weevil Sitophilus spp. through immunity and cell processesMasson, Florent 30 November 2015 (has links)
Plusieurs insectes se développant dans des milieux nutritionnellement déficients vivent en symbiose durable avec des bactéries intracellulaires (endosymbiotes) qui complémentent leur alimentation et améliorent leur pouvoir adaptatif. Alors que ces associations ont été largement étudiées sur les plans physiologiques et évolutifs, peu de travaux se sont consacrés à l’étude des mécanismes impliqués dans la tolérance et le contrôle des endosymbiotes par l’hôte. L’objectif de cette thèse est d’étudier, chez les charançons des céréales du genre Sitophilus, les particularités moléculaires et immunitaires du bactériome, un organe que l’insecte développe pour héberger les symbiotes et les isoler de sa réponse immunitaire systémique. Le bactériome du charançon exprime une réponse immunitaire modulée : des études transcriptomiques ont montré que les effecteurs de l’immunité sont peu exprimés dans cet organe, à l’exception d’un gène codant un peptide antimicrobien, la coléoptéricine A. Cette dernière interagit avec les endosymbiotes et participe à leur confinement intracellulaire. Dans une première partie, j’ai montré avec une approche d’interférence à l’ARN que l’expression du gène colA serait contrôlée par un système original qui impliquerait les gènes relish et tollip. Cette régulation « interne » au bactériome semble assurer le maintien des endosymbiotes et l’homéostasie de l’organe. Afin de comprendre comment le bactériome répond à une infection par les bactéries exogènes, j’ai suivi par RT-qPCR l’expression de gènes effecteurs de l’immunité dans le bactériome après injection systémique de bactéries à Gram positif ou négatif. Ceci a mis en évidence une réponse « externe », induite en cas d’infection, et qui aurait un rôle de protection des endosymbiotes contre les bactéries exogènes. Enfin, je me suis consacré à l’étude des changements de régulation accompagnant le passage du stade larvaire au stade adulte, marqué par une symbiose très dynamique. Le nombre d’endosymbiotes augmente fortement pendant les premiers jours de vie imaginale, puis diminue jusqu’à leur élimination complète par recyclage autophagique. Une analyse RNAseq a permis d’identifier les voies de signalisation dont l’activité accompagne cette dynamique. Une approche de RT-qPCR a également montré que l’immunité du bactériome est maintenue à un faible niveau d’activation pendant tout le processus de recyclage. Ce travail montre qu’au cours de leur évolution, les insectes ont sélectionné plusieurs stratégies pour assurer le maintien et l’ajustement de leur charge endosymbiotique en fonction de leurs besoins physiologiques : une signalisation immunitaire assurerait le confinement intracellulaire des endosymbiotes, et un ensemble de processus cellulaires incluant l’apoptose et l’autophagie semble être en associé aux voies métaboliques pour assurer le contrôle de la dynamique bactérienne et garantir le compromis bénéfice/coût de la symbiose. / Many insect species living on nutritionally unbalanced media depend on intracellular mutualistic bacteria, called obligatory endosymbionts, for their development and reproduction. Endosymbionts are housed in specialized host cells called bacteriocytes, that group together to form the bacteriome organ. Although such associations have been widely investigated on a physiological and evolutionary point of view, little is known about the mechanisms involved in the tolerance and the control of endosymbionts by the host. This work aims at deciphering the molecular and immune specificities of the bacteriome using the model system Sitophilus oryzae, the cereal weevil, and its obligate endosymbiont Sodalis pierantonius. The weevil bacteriome expresses a modulated immune response: transcriptomic studies showed that immune effector genes were lowly expressed despite the massive bacterial presence, with the exception of colA, a gene encoding for Coleoptericin A, an antimicrobial peptide. Coleoptericin A interacts with endosymbionts and participates in their intracellular seclusion. In a first chapter, I used RNA interference to demonstrate that colA gene expression may be controlled by an original system involving the genes relish and tollip. This “internal” regulation for endosymbiont control seems to maintain bacteriome homeostasis. In a second chapter, in order to understand how the bacteriome responds to an infection by exogenous bacteria, I followed up by RT-qPCR the expression of immune effector genes in the bacteriome after injection of Gram positive and Gram negative bacteria. This highlighted an “external” immune response, inducible upon infections, which may enable endosymbiont protection against exogenous intruders. In a third and last chapter, I focused on the regulation changes that accompany the switch from the larval stage to the imaginal stage, the latter being characterized by a very dynamic symbiosis. Endosymbiont load drastically increases during the first days of imaginal life, then rapidly decreases until complete elimination of the bacteria by autophagic recycling. RNAseq analysis allowed the identification of signaling pathways linked to this dynamic. A complementary RT-qPCR approach also showed that bacteriome immunity was laid low during the whole recycling process. This work shows that several strategies have been selected during host-symbiont coevolution to ensure the maintenance of the endosymbionts and the adjustment of their population depending on the insects physiological needs: immunity allows the intracellular seclusion in the bacteriocytes, and cell processes including autophagy and apoptosis are associated to metabolic pathways to control the endosymbiotic dynamics and secure the cost and benefit trade-off of symbiosis.
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Etude d’un insecticide naturel nommé PA1b : Mécanisme d’action et expression hétérologue / Study of a natural insecticide named PA1b : Mechanism of action and heterologous expressionEyraud, Vanessa 26 February 2014 (has links)
Dans un contexte où l’utilisation de substance chimique en agriculture est de plus en plus décriée, il est nécessaire de trouver de nouveaux moyens de protections des cultures, tout en maintenant une agriculture économiquement performante. Ainsi, un peptide extrait de graines de pois nommée PA1b (Pea Albumin 1 sous-unité b), présentant une forte activité insecticide a été découvert au laboratoire. PA1b provoque chez l’insecte modèle du laboratoire, le charançon des céréales Sitophilus sp., 100% de mortalité. L’action de PA1b passe par la liaison à un récepteur présent chez les charançons sensibles, et cette liaison est absente chez les charançons résistants ; ce récepteur est une pompe à protons nommée V-ATPase pour Vacuolar ATPase. Elle est composée de 14 sous-unités organisées en deux complexes protéiques nommés V1 (intracellulaire) et V0 (membranaire). PA1b agissant à l’extérieur des cellules seul le complexe V0 composé des sous - unités a, c, d et e pouvait être le récepteur de notre toxine. Mon premier objectif de thèse a été de comprendre le mode d’action de PA1b, en identifiant d’abord la ou les sous-unités réceptrices de PA1b, puis en recherchant par quel mécanisme la liaison de PA1b induit la mort de l’insecte. Nous avons cloné chez le charançon tous les gènes du complexe Vo, puis j’ai complémenté des levures déficientes pour ces gènes. Ce travail, mais également celui réalisé en collaboration avec d’autres équipes, nous a permis de proposer un modèle de perception de PA1b qui implique les sous-unités c et e de la V-ATPase, et permet également de proposer des hypothèses pour les différentes résistances au peptide. Par des méthodes d’immunohistologie et de biochimie, j’ai ensuite montré de manière concordante que la liaison de PA1b à la V-ATPase déclenche un phénomène d’apoptose qui conduit à la mort cellulaire, puis à la mort de l’insecte. Le second objectif de ma thèse était la mise en place d’un système de production hétérologue de PA1b. Grâce à l’expression hétérologue par infiltration de feuille de tabac (Nicotiana benthamiana) nous avons mis en place une technique de production efficace de la protéine PA1b. Après avoir déterminé les parties du gène codant PA1b nécessaires à la production de la protéine fonctionnelle, le système de production a ensuite été simplifié par la construction d’une cassette d’expression. Ainsi six isoformes de PA1b présents chez le pois, dont l’activité individuelle restait inconnue, ont été produits et testés, permettant de montrer que le caractère amphiphile de PA1b était primordial pour son activité. Par cette technique nous avons mis en place un système de production rapide et efficace permettant de tester la toxicité de nombreux isoformes de PA1b. Ce travail sera une aide précieuse pour le projet, dont l’un des objectifs majeurs est l’optimisation de PA1b, c’est-à-dire de déterminer la séquence peptidique la plus toxique. / In a context where chemical pesticides are increasingly criticized, new crops protection strategies that do not affect agriculture efficiency and productivity, must be found. A new peptide extracted from pea (Pisum sativum) seeds, named PA1b (Pea albumin 1 subunit b), and showing an important insecticide activity, was discovered in our laboratory. PA1b induces 100% mortality in our insect model, the cereal weevil, Sitophilus sp. PA1b acts by interacting with a receptor, this interaction is present in sensitive weevil, but not present in resistant weevil. The PA1b receptor is the vacuolar H+ -ATPase (V-ATPase), a multi-subunit proton pump. The V-ATPase is composed of two functional protein complexes named V1 (in the cytoplasm) and V0 (in the membrane). As PA1b is known to act only in the extracellular space, thus only the V0 complex, composed on the subunits a, c, d and e, can be the toxin receptor. The first aim of this thesis is to understand the PA1b mode of action: (i) identifying the subunit(s) acting as the receptor(s), (ii) understanding how the binding mechanism of PA1b on the receptor lead to the insect death. The weevil V0 complex genes were cloned and we used them for a functional complementation tests in yeasts strains deleted for these genes. Our data, together with those obtained through collaboration, lead to the proposal of model for the PA1b perception signaling which would involve subunits c and e of the V-ATPase. The identification of the PA1b receptor allows us to propose a hypothetical model explaining resistance mechanism to the peptide. Using immunohistology and biochemistry methods, we showed that PA1b-receptor interaction induced cells death triggered by apoptosis thus leading to insect death. The second aim of this thesis was the development of a PA1b heterologous production system. Through Agrobacterium tumefaciens mediated transient transformation by infiltration in tobacco leaves (Nicotiana benthamiana) an efficient system for PA1b production was developed. After identification of the essential parts of the complex PA1 gene necessary for efficient PA1b production, we created an expression cassette to simplify our heterologous production system. We used the system to produce six pea PA1b-isoformes with unknown individual toxic activity. The isoforms toxicity was experimentally determined, and our data showed that the amphiphilic properties of PA1b are essential for the maintenance of its toxic activity. For the first time, we implemented a quick and efficient production system, which allows to produce and to test many naturals or synthetics PA1b isoforms. This work will be useful to achieve one of the most important objectives of the research on this molecule, that is the identification.
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Développement embryonnaire du puceron Acyrthosiphon pisum : caractérisation de voies métaboliques et gènes clé dans les interactions trophiques avec Buchnera aphidicola / Embryonic development of the pea aphid Acyrthosiphon pisum : characterisation of metabolic pathways and key-genes regulating its trophic interaction with Buchnera aphidicolaRabatel, Andréane 12 December 2011 (has links)
Les pucerons sont parmi les principaux ravageurs des cultures dans les régions tempérées. Leur succès comme parasites de plantes repose sur leur fort potentiel reproductif dû à la parthénogénèse durant le printemps et l'été ainsi qu’à la symbiose avec Buchnera aphidicola. Cette bactérie symbiotique obligatoire fournit aux pucerons les acides aminés essentiels qui sont déficients dans leur alimentation déséquilibrée (la sève élaborée des plantes), et contribue ainsi à leur développement et reproduction. Le premier volet de ce travail de thèse a consisté à déterminer les besoins en acides aminés des différents stades embryonnaires, afin d’identifier des facteurs clé de l’association symbiotique au cours du développement du puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Cette étude, conduite sur des embryons prélevés in vivo ou mis en culture in vitro, a révélé i) des exigences métaboliques évoluant au cours de développement du puceron, ii) une dépendance au compartiment maternel pour l’approvisionnement des embryons en acides aminés, et iii) de forts besoins en acides aminés aromatiques, notamment en tyrosine, pour les stades embryonnaires tardifs et le premier stade larvaire précoce. Le deuxième volet de cette thèse a alors eu pour objectif l’identification de gènes cibles à l’intérieur des voies révélées par l’approche métabolique. A l’aide d’une puce à ADN dédiée au génome du d’A. pisum, les profils d’expression des gènes du puceron ont été analysés au cours de son développement embryonnaire. L’analyse fonctionnelle des différents groupes de gènes montre que ceux liés au métabolisme des acides aminés présentent de hauts niveaux d’expression et des variations significatives entre les différents stades. La voie métabolique des acides aminés aromatiques et tout particulièrement les gènes menant à la synthèse de la tyrosine, ainsi que les gènes/voies liés à la formation et à la maturation de la cuticule, sont parmi les plus sollicités chez les embryons tardifs. L’ensemble des résultats obtenus par les approches métabolique et transcriptomique suggère une synthèse et une accumulation de tyrosine au cours du développement embryonnaire, en vue de son utilisation comme précurseur pour la sclérotisation et le tannage cuticulaire après la ponte. Le dernier volet de ce travail de thèse a consisté en une analyse fonctionnelle du rôle du gène ACYPI007803, codant l’enzyme catalysant la synthèse de la tyrosine à partir de la phénylalanine, par la technique d’ARN interférence (RNAi). Une augmentation de la mortalité des larves pondues par les femelles traitées est corrélée à la diminution de l’expression du gène cible dans les compartiments symbiotiques (les chaines embryonnaires et les bactériocytes maternels) et confirme le rôle clé du gène ACYPI007803 dans le développement des embryons chez le puceron du pois. / Aphids are among the main crop pests in temperate regions. Their success as parasites of plants is based on their strong reproductive output due to parthenogenetic reproduction during spring and summer and to their symbiosis with Buchnera aphidicola. This obligatory symbiotic bacterium supplies aphids with essential amino acids poorly available in their unbalanced food (the phloem sap of plants), and so contributes to their development and reproduction. The first part of this work consisted in determining amino acid needs of different embryonic stages, in order to identify key factors of the symbiotic association during the pea aphid development. This study, led on embryos taken in vivo or cultivated in vitro in culture media, allowed us to identify: i) the evolution of metabolic requirements of embryos during development, ii) a dependence of embryos from the maternal compartment for their supply in amino acids, and iii) strong needs in aromatic amino acids, particularly in tyrosine, of the late embryonic stages and the early first larval stage of the pea aphid. The second part of this thesis had for objective the identification of key genes inside pathways revealed by the metabolic approach. Using a dedicated oligonucleotides microarray, the gene expression profiles of the aphid were analysed during the development of the insect. The functional analysis of different gene groups showed that genes involved in amino acids metabolism are globally over-expressed, but they also showed significant transcriptional regulations in the switches between the different stages studied here. The metabolic pathway of aromatic amino acids and particularly the genes involved in the biosynthesis of tyrosine, as well as genes / pathways involved in the formation and the maturation of the cuticle, were among the most solicited in the late embryos. These transcriptomic results, taken together with those obtained by the metabolic approach, suggest that the amino acid tyrosine is synthesized and accumulated by the pea aphid during its embryonic development, in order to later be used as precursor for the sclerotization and the cuticular tanning, processes that occur after insect laying. The last part of this work consisted in a functional analysis of the gene ACYPI007803, coding the enzyme catalysing the tyrosine synthesis from the phenylalanine, by using the RNA interference (RNAi) technique. An increase of the mortality of larvae laid by the treated females was correlated with the decrease of the expression of the target gene in the symbiotic compartments (the embryonic fraction and the maternal bacteriocytes) so confirming the key role of the ACYPI007803 gene in the development of the pea aphid embryos.
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