The carbonylation reaction is an alternative method to transform glycerol into novel derivatives and materials. Using catalytic [RhCl(CO2)2 and BU4N[Ir(CO2Cl2] glycerol and its triacetate-ester triacetin were successfully carb onlyated. The conversion with [RhCl(CO2)2] gave various carboxylic acid like buteonic acid, critonic acid, butyric acid and iso-butyric acid and also allylacetate, allyiodide, iso-propylacetate and iso-propyliodide.

The purpose of this research was to achieved selective hydrogenolysis of glycerol to 1,2-PDO (1,2-propanediol). Hydrogenolysis of glycerol was investigated in batch and trickle flow fixed bed continuous reactors. Raney catalysts and carbon supported precious catalysts were tested in the batch reactor. Ru/C and oxide-supported catalysts were tested in a continuous reactor. Parametric studies were performed and kinetics parameters were estimated with Raney copper catalyst in a batch reactor and with Cu/Al2O3 in a continuous reactor. The network of glycerol hydrogenolysis was studied on Cu/Al2O3. Cu/Al2O3 was investigated in the continuous reactor. Preparation methods, Cu loading and Cu catalyst support effects were studied. Catalyst characterization was performed to find out the factors that affected catalyst performance. Cu/Al2O3 catalyst was further modified by adding small amounts of Co and Ni to enhance the activity. The factors that affect the catalyst deactivation were also investigated. Raney Cu in the batch reactor and Cu/Al2O3 in the continuous reactor were the catalysts most selective to 1,2-PDO for glycerol hydrogenolysis. Cu catalyst on Al2O3 support of 18 wt % Cu loading prepared by co-precipitation method with ammonia is the most efficient catalyst for glycerol hydrogenolysis to 1,2-PDO. Catalyst characterization shows that the Cu/Al2O3 activity is related to the active Cu surface area on alumina support and the selectivity to 1,2-PDO is constant for the Cu/Al2O3 with different Cu surface area. Small amounts of Ni or Co improve the Cu/Al2O3 activity. The most effective deactivation factor for Cu/Al2O3 is coking or oxygenates on the spent catalyst.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης της γλυκερόλης η οποία αποτελεί ένα σημαντικό παραπροϊόν της βιομηχανίας του βιοντήζελ. Συνήθως αντιστοιχεί στο 10% της παραγόμενης ποσότητας του βιοντήζελ. Αυτό το γεγονός συντέλεσε στην υπερβολική αύξηση της παραγωγής της γλυκερόλης σε παγκόσμιο επίπεδο. Η περίσσεια της γλυκερόλης δε μπορεί να απορροφηθεί από τους συνηθισμένους βιομηχανικούς κλάδους που τη χρησιμοποιούν. Επομένως θα πρέπει να βρεθεί τρόπος αξιοποίησης αυτού του συσσωρευμένου παραπροϊόντος. Η κλασική μέθοδος επεξεργασίας αφορά τη χημική οδό μέσω της οποίας η γλυκερόλη μπορεί να μετατραπεί σε άλλα χημικά μόρια. Από την άλλη πλευρά βιοχημικές διεργασίες όπως η αναερόβια χώνευση, η ζύμωση αλλά και η μικροβιακή κυψελίδα καυσίμου μπορούν να μετατρέψουν τη γλυκερόλη σε μεθάνιο, υδρογόνο και ηλεκτρικό ρεύμα αντίστοιχα. Οι διεργασίες αυτές, οι οποίες αποτέλεσαν και το αντικείμενο έρευνας της διατριβής, είναι λιγότερο δαπανηρές από τις χημικές και επιβαρύνουν λιγότερο το περιβάλλον. Η διεργασία της αναερόβιας χώνευσης διεξήχθη σε συμβατικό αντιδραστήρα τύπου CSTR και σε ταχύρυθμο τύπου PABR. Στα πειράματα μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης της γλυκερόλης στο ρυθμό παραγωγής του μεθανίου. Από τα αποτελέσματα που λήφθησαν φάνηκε ότι ο CSTR δεν άντεχε οργανική φόρτιση πέραν των 0.25 g COD/L/d, ενώ από την άλλη πλευρά ο PABR λειτούργησε σε υπερ 10-πλάσια φόρτιση της τάξης των 3 g COD/L/d με παραγωγή μεθανίου 0.982 ± 0.089 L/L/d. Με το πέρας της πειραματικής διαδικασίας ακολούθησε μοντελοποίηση της διεργασίας, αρχικά για την περίπτωση του CSTR και κατόπιν χρησιμοποιήθηκε το ίδιο μοντέλο με τροποποίηση για την περίπτωση του PABR. Η ζυμωτική παραγωγή του υδρογόνου διεξήχθη επιτυχώς σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου. Μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης της γλυκερόλης και η επίδραση του αρχικού pH στην παραγωγή του υδρογόνου. Βρέθηκε ότι η μέγιστη παραγωγή υδρογόνου, 27.3 mL H2/ g COD γλυκερόλης, προήθλε όταν η αρχική συγκέντρωση είχε τεθεί στα 8.3 g COD/L. Η ζυμωτική παραγωγή υδρογόνου φάνηκε να ευνοείται σε pH γύρω από το 6.5. Εν συνεχεία, εξετάστηκε η ζυμωτική παραγωγή υδρογόνου σε συνεχή αντιδραστήρα. Η παραγωγή του υδρογόνου ήταν υπερβολικά ασταθής, γεγονός που πιθανότατα να οφείλεται στην απομάκρυνση της υδρογονοπαραγωγού βιομάζας από τον αντιδραστήρα σε συνδυασμό με την παρουσία υδρογονοκαταναλωτών μικροοργανισμών. Για την παραγωγή ηλεκτρικού ρεύματος από γλυκερόλη χρησιμοποιήθηκε μικροβιακή κυψελίδα καυσίμου διάταξης Η-type σε συνθήκες διαλείποντος έργου. Μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης της γλυκερόλης στην παραγωγή ηλεκτρικού ρεύματος. Παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση των 3.2 g COD/L απέφερε τη μέγιστη απόδοση Coulomb (CE) 34.09 %. Η περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης οδήγησε σε μείωση της CE. Αυτό ίσως να οφείλεται σε κινητικό περιορισμό που υπέστησαν οι ηλεκτροχημικά ενεργοί μικροοργανισμοί όταν εκτέθηκαν σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκερόλης. / This study focused on the valorization of glycerol which is an important by-product of the biodiesel industry corresponding to 10 % of the produced biodiesel amount. This fact contributed to the increase of the global production of biodiesel, to a point at which the industries which traditionally consumed glycerol could not absorb. This situation should be overcome through new outlets on glycerol exploitation. Usually, glycerol is treated by chemical processes in order to form new chemical compounds. On the other side, biochemical processes like anaerobic digestion and fermentation or the technology of microbial fuel cells could potentially transform glycerol into methane, hydrogen and electric current respectively. These processes, which are the subject of this Ph.d, are preferable to their chemical counterparts due to the low energy demand and reduced environmental pollution. The anaerobic digestion process was conducted in a conventional CSTR reactor and in a high rate reactor, the PABR. The experiments dealt with the effect of glycerol concentration on the methane production rate. The obtained results showed that the CSTR could not withstand organic loadings above 0.25 g COD/L/d, however PABR operated at organic loading 10 times higher than CSTR such as 3 g COD/L/d and resulted to a methane production rate of 0.982 ± 0.089 L/L/d. A model was developed for both the CSTR and the PABR digesters. Fermentative hydrogen production was conducted successfully in batch reactors. The effect of the initial glycerol concentration and initial pH on hydrogen production was studied. A maximum yield, 27.3 mL H2/ g COD glycerol, was obtained when glycerol concentration was 8.3 g COD/L and the pH 6.5. Moreover, the fermentation of glycerol took place in a CSTR in order to investigate the continuous production of hydrogen. Hydrogen production was unstable, possibly due to the washout of proper biomass from the reactor. For electricity generation from glycerol, an H-type microbial fuel cell was used in batch mode. The effect of the initial glycerol on the electric current was studied. A maximum Coulombic efficiency (CE) 34.09% was obtained at a glycerol concentration of 3.2 g COD/L. A further increase of glycerol drove to a drop of the CE. Probably, this happened since the electrochemical microorganisms were inhibited by the high glycerol concentration.

Μελετήθηκε ο μεταβολισμός της γλυκερόλης στη ζύμη Yarrowia lipolytica ACA–DC 50109 με έμφαση στη μετατροπή της σε λιπίδια και κιτρικό οξύ, μεταβολικά προϊόντα που παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη βιοτεχνολογία. Σε καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, επί πολλαπλώς περιοριστικού μέσου, διαπιστώθηκε η ύπαρξη τριών διακριτών φάσεων αύξησης που χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά: η φάση βιοσύνθεσης κυτταρικής μάζας (κατά την οποία συντέθηκαν 4–4,5 g/l βιομάζας), η ελαιογόνος φάση (κατά την οποία πραγματοποιήθηκε συσσώρευση λιπιδίων 20–22% wt/wt επί ξηρής βιομάζας, 90% wt/wt των οποίων ήταν ουδέτερα) και η φάση παραγωγής κιτρικού οξέος (κατά την οποία εκκρίθηκαν στο περιβάλλον της αύξησης 14–30 g/l κιτρικού οξέος). Κατά τη διάρκεια των ανωτέρω φάσεων η ζύμη διήλθε από διάφορα μορφολογικά στάδια: μικρού μήκους αληθή μυκήλια και ψευδομυκήλια που κυριάρχησαν των κυττάρων ζύμης κατά τη φάση βιοσύνθεσης κυτταρικής μάζας, ευμεγέθη κύτταρα κατά τη φάση της ελαιογένεσης και μικρού μεγέθους κύτταρα ζύμης κατά τη φάση παραγωγής κιτρικού οξέος. Η γλυκερόλη διαπερνά την κυτταροπλασματική μεμβράνη με διευκολυνόμενη διάχυση και καταβολίζεται μέσω των αντιδράσεων της κινάσης της γλυκερόλης – GK και της NAD+ εξαρτώμενης αφυδρογονάσης της 3–P–γλυκερόλης. Την υψηλή ενεργότητα της NAD+ εξαρτώμενης ισοκιτρικής αφυδρογονάσης (NAD+–ICDH) κατά τη διάρκεια της φάσης βιοσύνθεσης κυτταρικής μάζας διαδέχθηκε σημαντική πτώση της ενεργότητάς της, επάγοντας τη λιπογένεση. Απρόσμενη αποδόμηση των αποθεματικών (ουδέτερων) λιπιδίων και σημαντική βιοσύνθεση γλυκολιπιδίων, σφιγγολιπιδίων και φωσφολιπιδίων – Ρ παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της φάσης παραγωγής κιτρικού οξέος, φάση κατά την οποία η ενεργότητα της GK είχε μειωθεί σημαντικά ενώ η ενεργότητα της NAD+–ICDH είχε σχεδόν μηδενιστεί. Το ελαϊκό οξύ ήταν το κυριότερο λιπαρό οξύ ενώ η φωσφατιδυλχολίνη – PC το κύριο Ρ. Σε συνεχές σύστημα καλλιέργειας επί θρεπτικού υλικού περιοριστικού σε άζωτο, βιοσυντέθηκαν περιορισμένες μόνο ποσότητες λιπιδίων (~10% wt/wt, επί της ξηρής βιομάζας), γεγονός που μπορεί αποδοθεί στο ότι δεν υπήρχε μια περιοχή του ειδικού ρυθμού αραίωσης (D, h–1) στην οποία τα ένζυμα – κλειδιά που εμπλέκονται στη λιπογένεση (όπως η ΑΤΡ:κιτρική λυάση – ATP:CL και το μηλικό ένζυμο – ME) να παρουσιάζουν συγχρόνως υψηλές ενεργότητες, ενώ η ενεργότητα της NAD+–ICDH μειώθηκε, όχι όμως σημαντικά, στους χαμηλούς D. Η ενεργότητα της ATP:CL χαρακτηρίστηκε από υψηλές τιμές (60–300 Units/mg DW) σε D 0,033 h–1 ενώ οι μέγιστες τιμές ενεργότητας του ME (650 Units/mg DW) εμφανίστηκαν σε D=0,104 h–1. Τα λιπίδια της ζύμης ήταν περισσότερο ακόρεστα σε ενδιάμεσες τιμές D. Σε όλους τους D η φωσφατιδυλαιθανολαμίνη – PE, η φωσφατιδυλινοσιτόλη – PI και η PC αντιπροσωπεύουν τις κυριότερες κλάσεις των Ρ. Όσον αφορά τη μορφολογία της ζύμης, βρέθηκε ότι σε D<0,055 h–1 επικρατούσαν αληθή μυκήλια και ψευδομυκήλια ενώ σε D 0,055 h–1 παρατηρήθηκαν μόνο κύτταρα ζύμης. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν επί θρεπτικού υλικού περιοριστικού σε άζωτο, σε D=0,026 h–1, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου – DO παρατηρήθηκε αυξημένο ποσοστό του κλάσματος των Ρ επί των ολικών λιπιδίων στις ακραίες σε τιμές DO ( 70% και 7%). Ανεξάρτητα των τιμών DO η PC ήταν η κλάση με το μεγαλύτερο ποσοστό, ακολουθούμενη από την PI και PE. Ειδικότερα το ποσοστό της ΡΕ παρουσιάστηκε ιδιαίτερα αυξημένο σε ενδιάμεσες τιμές DO (20% και 30%). Σε DΟ 50% επικρατούσαν αληθή μυκήλια και ψευδομυκήλια ενώ σε DΟ 50% εμφανίστηκαν στην καλλιέργεια περισσότερα κύτταρα ζύμης. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε D=0,026 h–1 βρέθηκε ότι ο περιορισμός της αύξησης από ιχνοστοιχεία όπως το μαγνήσιο και το ασβέστιο τα οποία εμπλέκονται σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες, είχαν δυσμενή επίδραση στη φυσιολογία της ζύμης, ωστόσο η σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα δεν επηρεάστηκε από τη φύση του περιοριστικού για την αύξηση παράγοντα. Η παρούσα διδακτορική διατριβή φιλοδοξεί να συμβάλει στη μελέτη της φυσιολογίας των ελαιογόνων μικροοργανισμών και στη χρήση της γλυκερόλης ως υποστρώματος σε μελλοντικές βιοτεχνολογικές εφαρμογές. / In this thesis the metabolism of glycerol in Yarrowia lipolytica ACA–DC 50109, with emphasis on glycerol conversion into value–added biotechnological products, such as single cell oils and citric acid, was studied. The growth of Y. lipolytica was studied in bioreactor batch cultures in multiple limited medium and three distinct phases were identified during growth cycle. In each phase, yeast cells were characterized by specific morphological and biochemical features: biomass formation phase (in which 4–4.5 g/l of biomass were synthesized), lipogenic phase (in which 20–22% lipids wt/wt in dry weight were accumulated in biomass, containing 90% wt/wt neutral lipids) and citric acid production phase (in which 14–30 g/l of citric acid were secreted in the growth environment). Distinct cellular forms of Y. lipolytica were developed during the above phases: in biomass formation phase short true mycelia and pseudo–mycelia were predominant while a few yeast–like cells were observed, in lipogenic phase large obese cells were predominant and in citric acid production phase cells size was diminished. Glycerol passes into the microbial cell by facilitated diffusion. Y. lipolytica successfully converts glycerol via phosphorylation pathway, in which glycerol kinase (GK) and glycerol–3–P–dehydrogenase are implicated. Though high activity of NAD+ dependent isocitric dehydrogenase (NAD+–ICDH) was detected during biomass formation phase, this activity was significantly decreased afterwards inducing lipogenesis. Surprisingly, storage (neutral) lipid turnover and synthesis of glycolipids, sphingolipids and phospholipids – Ρ simultaneously occurred with citric acid production, and happened when GK activity was considerably reduced and NAD+–ICDH activity was minimised. Oleic acid was the major fatty acid in all lipid fractions and phosphatidylcholine – PC was the main Ρ. In continuous culture in nitrogen limited medium Y. lipolytica accumulated low quantities of lipids (~10% w/w, in dry weight), maybe due to the fact that there was not a region of specific dilution rate (D, h–1) in which the key–enzymes that are implicated in lipogenesis (i.e. ΑΤΡ:citrate lyase – ATP:CL and malic enzyme – ME) presented simultaneously high activity while NAD+–ICDH activity was insignificantly decreased in low D. ATP:CL presented high activity (60–300 Units/mg DW) in D 0,033 h–1 while ME presented maximum activity (650 Units/mg DW) in D=0,104 h–1. Lipids were more unsaturated in intermediate D values while phosphatidylethanolamine – PE, phosphatidylinositol – PI and PC are the main Ρ classes. As far as the morphology is concerned, in D<0,055 h–1 short true mycelia and pseudo–mycelia were predominant in culture medium while in D 0,055 h–1 only yeast cells were observed. In experiments performed in nitrogen limited medium in D=0,026 h–1 in different dissolved oxygen – DO concentrations, it was found that in extreme DO values ( 70% and 7%) the percentage of P was increased. Independently the DO concentration PC was the main class followed by PI and PE. The morphology of Y. lipolytica was influenced by the different concentration of DO and it was observed that in DΟ 50% short true mycelia and pseudo–mycelia were predominant in culture medium while in DΟ 50% more yeast cells were appeared. In experiments performed in D=0,026 h–1, it was found that the absence of micronutrients from the growth medium, i.e. magnesium and calcium that are implicated in multiple cellular functions, had severe effects in yeast physiology, while the fatty acid composition of cellular lipids was not affected by the nature of the growth limiting factor. The present thesis aspires to contribute in the study of oleaginous microorganisms’ physiology and in use of glycerol as substrate in future biotechnological applications.