Οι επιφανειοδραστικοί παράγοντες είναι αμφίφιλα μόρια, αποτελούμενα από μια υδρόφιλη κεφαλή και μια υδρόφοβη ουρά. Η ιδιαίτερη δομή τους τα καθιστά ικανά να μειώνουν τις επιφανειακές και διεπιφανειακές τάσεις, μεταξύ διαφορετικών υγρών φάσεων, αλλά και μεταξύ αέριων-υγρών φάσεων. Η ιδιότητα τους αυτή, σε συνδυασμό με την ικανότητά τους να δομούν γαλακτώματα ελαίων σε νερό (oil in water) ή νερού εντός ελαίων (water in oil), αποδεικνύεται ιδιαίτερα χρήσιμη και εν δυνάμει εφαρμόσιμη, σε πολλούς τομείς της σύγχρονης βιομηχανίας. Από την σύνθεση απορρυπαντικών ουσιών και προϊόντων προσωπικής υγιεινής, την παραγωγή φυτοφαρμάκων, παρασιτοκτόνων, ζιζανιοκτόνων και μυκητοκτόνων, έως τη σύνθεση φαρμακευτικών σκευασμάτων, αλλά και τη χρήση τους για την ανάκτηση ελαίων και τη βιοεξυγίανση χερσαίων και υδρόβιων συστημάτων, φαίνεται η υψηλή σημασία των ουσιών αυτών. Σήμερα, οι χημικοί επιφανειοδραστικοί παράγοντες χρησιμοποιούνται ευρέως στο εμπόριο, τόσο λόγω του χαμηλού κόστους παραγωγής τους, όσο και της αποδοτικότητάς τους. Ωστόσο, οι βιολογικά συντιθέμενοι επιφανειοδραστικοί παράγοντες, προσφέρουν μια πληθώρα πλεονεκτημάτων έναντι των αντίστοιχων χημικών. Είναι πιο συμβατοί με το περιβάλλον, λιγότερο τοξικοί, συντίθενται από μια πληθώρα μικροοργανισμών και διαρκώς ανακαλύπτονται νέοι βιοεπιφανειοδραστικοί παράγοντες με διαφορετικές ιδιότητες. Εάν η σύνθεσή τους συνδυαστεί με την παραγωγή κέρδους, τότε θα έχουν όλα τα φόντα να παραγκωνίσουν τους χημικά συντιθέμενους ανταγωνιστές τους. Ιδιαίτερα σημαντική είναι η σύνθεση βιοεπιφανειοδραστικών παραγόντων από ζύμες, καθώς οι μικροοργανισμοί αυτοί, στην πλειοψηφία τους, είναι ασφαλέστεροι από τα βακτήρια. Επιπλέον, η χρήση γλυκερόλης, που αποτελεί υδατοδιαλυτό υπόστρωμα, ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας, οδηγεί σε πλήρη απελευθέρωση των ουσιών αυτών στο μέσο καλλιέργειας, στις περιπτώσεις που αυτές παράγονται. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η ικανότητα έξι στελεχών ζυμών να αυξάνονται, να συσσωρεύουν ενδοκυτταρικά λιπίδια και να συνθέτουν βιοεπιφανειοδραστικούς παράγοντες παρουσία υποστρώματος γλυκερόλης. Η ανάπτυξη όλων των ζυμών ήταν ικανοποιητική, εκτός από την περίπτωση της C. tropicalis, η οποία δεν αναπτύχθηκε, στο παρόν υπόστρωμα. Επιπλέον συσσώρευσαν ενδοκυτταρικά λιπίδια σε διαφορετικά ποσοστά, η σύσταση των οποίων σε λιπαρά οξέα ήταν τυπική για αυτούς τους μικροοργανισμούς. Δύο εκ των στελεχών που μελετήθηκαν, τα C. curvatus και P. ciferrii, βρέθηκε να συνθέτουν βιοεπιφανειοδραστικούς παράγοντες με γαλακτωματοποιητική ικανότητα. Για την πρώτη δεν έχει αναφερθεί στο παρελθόν η ικανότητα σύνθεσης τέτοιων ουσιών, ωστόσο για τη δεύτερη, είναι γνωστό ότι συνθέτει πλήρως ακετυλιωμένες τετραακέτυλ-φυτοσφιγγοσίνες, που αποτελούν πρόδρομα μόρια των σφιγγολιπιδίων, σημαντικό κλάσμα λιπιδίων των κυτταρικών μεμβρανών στα θηλαστικά. / Surfactants are amphiphilic molecules, comprising of a hydrophilic head group and a hydrophobic tail group. Their unusual structure makes them capable of reducing surface tension at the air/water interfaces and the interfacial tension at oil/water interfaces. This ability, which is sometimes associated, in the case of emulsifiers, with the formation of oil-in-water or water-in-oil emulsions, is very useful in many areas of industry. Many detergents and personal care products, as well as, many herbicides, pesticides and fungicides utilize surfactants as main ingredients. Their antimicrobial and anti-adhesive properties, makes them possible pharmaceutical agents. They can be also used in oil recovery and bioremediation processes. All these usages prove the great importance of surfactant agents. Today most of the commercially used surfactants are chemically synthesized, due to their low cost and high yield. However, biosurfactants present many advantages over the chemical ones. The first are more compatible with the environment, they present lower toxicity, they can be synthesized by many different microorganisms and newly synthesized biosurfactants, with various abilities, are being discovered all time. As soon as their production gets accompanied with profit, they will become extremely competitive over the chemically synthesized surfactants. The synthesis of biosurfactants from yeasts is quite important. These microorganisms, in their majority, are safer than bacteria. In addition, using glycerol, which is a water soluble substrate, as the only carbon and energy source, leads biosurfactants to be fully secreted in the culture medium. In the present study, the ability of six yeast strains to grow, accumulate intracellular lipids and produce biosurfactants on the presence of glycerol, was investigated. Growth of all microorganisms studied was satisfying, except for C. tropicalis, which showed no significant growth, on the current medium. They also accumulated intracellular lipids in various amounts. The fatty acid composition of these lipids was typical of these microorganisms. Two of the yeast strains studied, namely C. curvatus και P. ciferrii, was found to produce biosurfactants with emulsifying ability. No previous literature exists about the first one, producing such kind of agents. However, P. ciferrii is known to produce fully acetylated tetraacetyl-phytosphingosines, which constitute precursors of sphingolipids, an important fraction of lipids of mammalian cell membranes.

Τα τελευταία χρόνια έχουν ενταθεί οι προσπάθειες για την ανάπτυξη νέων και φιλικών προς το περιβάλλον τεχνολογιών για την παραγωγή ενέργειας από ανανεώσιμες πηγές, όπως η ηλιακή ενέργεια, με χρήση ευρέως διαθέσιμων και χαμηλού κόστους πρώτων υλών, όπως το νερό και η βιομάζα. Μια πολλά υποσχόμενη διεργασία στην κατεύθυνση αυτή είναι η παραγωγή υδρογόνου μέσω της φωτοκαταλυτικής αναμόρφωσης προϊόντων και παραγώγων βιομάζας σε υδατικά αιωρήματα ημιαγωγών, κυρίως διοξειδίου του τιτανίου (TiO2). Στην παρούσα εργασία μελετάται η δυνατότητα ανάπτυξης φωτοκαταλυτών με βάση το TiO2, οι οποίοι θα χαρακτηρίζονται από υψηλότερη απόκριση στο ορατό και μεγαλύτερη ενεργότητα στην αντίδραση αναμόρφωσης των οργανικών ενώσεων. Οι φωτοκαταλύτες που μελετήθηκαν ήταν TiO2 (Degussa P25) ενισχυμένο με μικρές ποσότητες αμετάλλων (N, P) ή μετάλλων (Li, Na, K, Cs, Ca). Στα υλικά αυτά εναποτέθηκε λευκόχρυσος (0.5 wt.%) με στόχο τη μελέτη της επίδρασής του στη φωτοκαταλυτική ενεργότητα και εκλεκτικότητα Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της αντίδρασης της φωτοκαταλυτικής αναμόρφωσης της γλυκερόλης (εξ.1) σε αιώρημα καταλύτη 0.5% Pt/TiO2, το οποίο ακτινοβολείται με φως στην περιοχή που απορροφά το TiO2. (1) Από τα αποτελέσματα προκύπτει οτι :  H προσθήκη των αμετάλλων (Ν-Ρ) παρότι προκαλεί αύξηση της απόκρισης του φωτοκαταλύτη στο ορατό έχει αρνητικές επιπτώσεις στο ρυθμό παραγωγής υδρογόνου.  H προσθήκη του CaΟ οδηγεί στη δημιουργία νέων ζωνών στο ενεργειακό χάσμα του ημιαγωγού μετατοπίζοντας έτσι την περιοχή απορρόφησης του σε μήκη κύματος που αντιστοιχούν στο ορατό φάσμα, χωρίς όμως η μετατόπιση αυτή να συνοδεύεται από τη δημιουργία ημιαγωγών με βελτιωμένη φωτοκαταλυτική ενεργότητα.  H φωτοκαταλυτική ενεργότητα του TiO2 βελτιώνεται με την προσθήκη αλκαλίων σύμφωνα με την ακόλουθη σειρά TiO2<Na<Cs<Li<K.  Με άυξηση τόσο της έντασης της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, όσο και της συγκέντρωσης της γλυκερόλης αλλά και του φωτοκαταλύτη, ο ρυθμός παραγωγής υδρογόνου αυξάνεται / During the last years, intensive efforts have been made for the development of new and environmentally friendly technologies for energy production from renewable sources such as solar energy, using widely available and low cost raw materials, such as water and biomass. A well promising procedure to achieve this goal is the production of hydrogen through the photocatalytic reforming of products and derivatives of biomass in aqueous suspensions, mainly titanium dioxide (TiO2). In the present study, we investigated the potential of developing photocatalysts based on TiO2, that could be characterized by higher response to visible light and higher photocatalytic activity in the reforming of organic compounds. The photocatalysts studied were based on TiO2 (Degussa P25) dopped with small quantities of non-metals (N, P) or metals (Li, Na, K, Cs, Ca). The above were impregnated with platinum (Pt) 0.5 wt.%, in order to study its effect on the photocatalytic activity and selectivity. Moreover, a kinetic study of the reaction of glycerol reforming (Eq.1) in suspension of 0.5% Pt/TiO2 catalyst, irradiated by light in the absorption area of TiO2 was further performed (1) The results show that :  Although the addition of non-metals (N,P) causes an increase in the response of the photocatalyst in visible light, it also has a negative effect on the hydrogen production rate.  The addition of CaΟ results in the formation of new band gap zones of the semiconductor, shifting its absorption area into wavelengths that correspond to visible light, although this shift was not associated with the formation of semiconductors with improved photocatalytic activity.  The photocatalytic activity of TiO2 was improved by the addition of alkali according to the following order TiO2<Na<Cs<Li<K.  The rate of hydrogen production increases by increasing both the power of the induced irradiation, as well as the concentration of glycerol and photocatalyst.

Μελετήθηκε ο μεταβολισμός της γλυκερόλης στη ζύμη Yarrowia lipolytica ACA–DC 50109 με έμφαση στη μετατροπή της σε λιπίδια και κιτρικό οξύ, μεταβολικά προϊόντα που παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη βιοτεχνολογία. Σε καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, επί πολλαπλώς περιοριστικού μέσου, διαπιστώθηκε η ύπαρξη τριών διακριτών φάσεων αύξησης που χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά: η φάση βιοσύνθεσης κυτταρικής μάζας (κατά την οποία συντέθηκαν 4–4,5 g/l βιομάζας), η ελαιογόνος φάση (κατά την οποία πραγματοποιήθηκε συσσώρευση λιπιδίων 20–22% wt/wt επί ξηρής βιομάζας, 90% wt/wt των οποίων ήταν ουδέτερα) και η φάση παραγωγής κιτρικού οξέος (κατά την οποία εκκρίθηκαν στο περιβάλλον της αύξησης 14–30 g/l κιτρικού οξέος). Κατά τη διάρκεια των ανωτέρω φάσεων η ζύμη διήλθε από διάφορα μορφολογικά στάδια: μικρού μήκους αληθή μυκήλια και ψευδομυκήλια που κυριάρχησαν των κυττάρων ζύμης κατά τη φάση βιοσύνθεσης κυτταρικής μάζας, ευμεγέθη κύτταρα κατά τη φάση της ελαιογένεσης και μικρού μεγέθους κύτταρα ζύμης κατά τη φάση παραγωγής κιτρικού οξέος. Η γλυκερόλη διαπερνά την κυτταροπλασματική μεμβράνη με διευκολυνόμενη διάχυση και καταβολίζεται μέσω των αντιδράσεων της κινάσης της γλυκερόλης – GK και της NAD+ εξαρτώμενης αφυδρογονάσης της 3–P–γλυκερόλης. Την υψηλή ενεργότητα της NAD+ εξαρτώμενης ισοκιτρικής αφυδρογονάσης (NAD+–ICDH) κατά τη διάρκεια της φάσης βιοσύνθεσης κυτταρικής μάζας διαδέχθηκε σημαντική πτώση της ενεργότητάς της, επάγοντας τη λιπογένεση. Απρόσμενη αποδόμηση των αποθεματικών (ουδέτερων) λιπιδίων και σημαντική βιοσύνθεση γλυκολιπιδίων, σφιγγολιπιδίων και φωσφολιπιδίων – Ρ παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της φάσης παραγωγής κιτρικού οξέος, φάση κατά την οποία η ενεργότητα της GK είχε μειωθεί σημαντικά ενώ η ενεργότητα της NAD+–ICDH είχε σχεδόν μηδενιστεί. Το ελαϊκό οξύ ήταν το κυριότερο λιπαρό οξύ ενώ η φωσφατιδυλχολίνη – PC το κύριο Ρ. Σε συνεχές σύστημα καλλιέργειας επί θρεπτικού υλικού περιοριστικού σε άζωτο, βιοσυντέθηκαν περιορισμένες μόνο ποσότητες λιπιδίων (~10% wt/wt, επί της ξηρής βιομάζας), γεγονός που μπορεί αποδοθεί στο ότι δεν υπήρχε μια περιοχή του ειδικού ρυθμού αραίωσης (D, h–1) στην οποία τα ένζυμα – κλειδιά που εμπλέκονται στη λιπογένεση (όπως η ΑΤΡ:κιτρική λυάση – ATP:CL και το μηλικό ένζυμο – ME) να παρουσιάζουν συγχρόνως υψηλές ενεργότητες, ενώ η ενεργότητα της NAD+–ICDH μειώθηκε, όχι όμως σημαντικά, στους χαμηλούς D. Η ενεργότητα της ATP:CL χαρακτηρίστηκε από υψηλές τιμές (60–300 Units/mg DW) σε D 0,033 h–1 ενώ οι μέγιστες τιμές ενεργότητας του ME (650 Units/mg DW) εμφανίστηκαν σε D=0,104 h–1. Τα λιπίδια της ζύμης ήταν περισσότερο ακόρεστα σε ενδιάμεσες τιμές D. Σε όλους τους D η φωσφατιδυλαιθανολαμίνη – PE, η φωσφατιδυλινοσιτόλη – PI και η PC αντιπροσωπεύουν τις κυριότερες κλάσεις των Ρ. Όσον αφορά τη μορφολογία της ζύμης, βρέθηκε ότι σε D<0,055 h–1 επικρατούσαν αληθή μυκήλια και ψευδομυκήλια ενώ σε D 0,055 h–1 παρατηρήθηκαν μόνο κύτταρα ζύμης. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν επί θρεπτικού υλικού περιοριστικού σε άζωτο, σε D=0,026 h–1, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου – DO παρατηρήθηκε αυξημένο ποσοστό του κλάσματος των Ρ επί των ολικών λιπιδίων στις ακραίες σε τιμές DO ( 70% και 7%). Ανεξάρτητα των τιμών DO η PC ήταν η κλάση με το μεγαλύτερο ποσοστό, ακολουθούμενη από την PI και PE. Ειδικότερα το ποσοστό της ΡΕ παρουσιάστηκε ιδιαίτερα αυξημένο σε ενδιάμεσες τιμές DO (20% και 30%). Σε DΟ 50% επικρατούσαν αληθή μυκήλια και ψευδομυκήλια ενώ σε DΟ 50% εμφανίστηκαν στην καλλιέργεια περισσότερα κύτταρα ζύμης. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε D=0,026 h–1 βρέθηκε ότι ο περιορισμός της αύξησης από ιχνοστοιχεία όπως το μαγνήσιο και το ασβέστιο τα οποία εμπλέκονται σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες, είχαν δυσμενή επίδραση στη φυσιολογία της ζύμης, ωστόσο η σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα δεν επηρεάστηκε από τη φύση του περιοριστικού για την αύξηση παράγοντα. Η παρούσα διδακτορική διατριβή φιλοδοξεί να συμβάλει στη μελέτη της φυσιολογίας των ελαιογόνων μικροοργανισμών και στη χρήση της γλυκερόλης ως υποστρώματος σε μελλοντικές βιοτεχνολογικές εφαρμογές. / In this thesis the metabolism of glycerol in Yarrowia lipolytica ACA–DC 50109, with emphasis on glycerol conversion into value–added biotechnological products, such as single cell oils and citric acid, was studied. The growth of Y. lipolytica was studied in bioreactor batch cultures in multiple limited medium and three distinct phases were identified during growth cycle. In each phase, yeast cells were characterized by specific morphological and biochemical features: biomass formation phase (in which 4–4.5 g/l of biomass were synthesized), lipogenic phase (in which 20–22% lipids wt/wt in dry weight were accumulated in biomass, containing 90% wt/wt neutral lipids) and citric acid production phase (in which 14–30 g/l of citric acid were secreted in the growth environment). Distinct cellular forms of Y. lipolytica were developed during the above phases: in biomass formation phase short true mycelia and pseudo–mycelia were predominant while a few yeast–like cells were observed, in lipogenic phase large obese cells were predominant and in citric acid production phase cells size was diminished. Glycerol passes into the microbial cell by facilitated diffusion. Y. lipolytica successfully converts glycerol via phosphorylation pathway, in which glycerol kinase (GK) and glycerol–3–P–dehydrogenase are implicated. Though high activity of NAD+ dependent isocitric dehydrogenase (NAD+–ICDH) was detected during biomass formation phase, this activity was significantly decreased afterwards inducing lipogenesis. Surprisingly, storage (neutral) lipid turnover and synthesis of glycolipids, sphingolipids and phospholipids – Ρ simultaneously occurred with citric acid production, and happened when GK activity was considerably reduced and NAD+–ICDH activity was minimised. Oleic acid was the major fatty acid in all lipid fractions and phosphatidylcholine – PC was the main Ρ. In continuous culture in nitrogen limited medium Y. lipolytica accumulated low quantities of lipids (~10% w/w, in dry weight), maybe due to the fact that there was not a region of specific dilution rate (D, h–1) in which the key–enzymes that are implicated in lipogenesis (i.e. ΑΤΡ:citrate lyase – ATP:CL and malic enzyme – ME) presented simultaneously high activity while NAD+–ICDH activity was insignificantly decreased in low D. ATP:CL presented high activity (60–300 Units/mg DW) in D 0,033 h–1 while ME presented maximum activity (650 Units/mg DW) in D=0,104 h–1. Lipids were more unsaturated in intermediate D values while phosphatidylethanolamine – PE, phosphatidylinositol – PI and PC are the main Ρ classes. As far as the morphology is concerned, in D<0,055 h–1 short true mycelia and pseudo–mycelia were predominant in culture medium while in D 0,055 h–1 only yeast cells were observed. In experiments performed in nitrogen limited medium in D=0,026 h–1 in different dissolved oxygen – DO concentrations, it was found that in extreme DO values ( 70% and 7%) the percentage of P was increased. Independently the DO concentration PC was the main class followed by PI and PE. The morphology of Y. lipolytica was influenced by the different concentration of DO and it was observed that in DΟ 50% short true mycelia and pseudo–mycelia were predominant in culture medium while in DΟ 50% more yeast cells were appeared. In experiments performed in D=0,026 h–1, it was found that the absence of micronutrients from the growth medium, i.e. magnesium and calcium that are implicated in multiple cellular functions, had severe effects in yeast physiology, while the fatty acid composition of cellular lipids was not affected by the nature of the growth limiting factor. The present thesis aspires to contribute in the study of oleaginous microorganisms’ physiology and in use of glycerol as substrate in future biotechnological applications.