La conversion de la protéine prion cellulaire (PrPC) en protéine prion scrapie (PrPSc) est à l’origine des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). La toxicité de la PrPSc est restreinte aux neurones et implique la déviation de la (des) fonction(s) de la PrPC. Une action neurospécifique de la PrPC est le recrutement de la src kinase Fyn. Dans ce travail, nous montrons que la PrPC est capable de mobiliser une autre src kinase, Lyn, via la cavéoline (cav) dans les neurones. Une cible du couplage PrPC-cav-Lyn, restreint aux corps cellulaires, est la kinase GSK3ß. L’inactivation de GSK3ß par la PrPC intervient dans la régulation des fonctions neuronales, en limitant l’activité du récepteur sérotoninergique 1B. D’autre part, nous montrons que dans les cellules infectées par les prions, l’accumulation de PrPSc induit le recrutement constitutif de la plateforme PrPC-cav-Fyn, à l’origine d’un stress oxydant. Ce gain de fonction entraine notamment un défaut de clivage par la metalloprotéase MMP-9, dont une des conséquences est l’accumulation du peptide Aß. Un autre impact de l’infection est la suractivation de la kinase PDK1, qui génère une perte de fonction de la metalloprotéase TACE. Dans des neurones « Alzheimer », on observe également cette cascade délétère, qui dépend de la PrPC. L’inhibition de PDK1 dans des modèles d’infection par les prions ou de maladie d’Alzheimer permet de rétablir l’activité d’alpha-clivage de TACE vis-à-vis de ses substrats, la PrPC, APP et le récepteur au TNF-alpha. L’effet bénéfique observé in vivo permet de définir PDK1 comme une cible thérapeutique potentielle pour les EST et la maladie d’Alzheimer. En résumé, ce travail illustre comment une meilleure connaissance de la fonction de signalisation de la PrPC peut permettre de progresser dans la compréhension des mécanismes de neurodégénérescence associés non seulement aux maladies à prions, mais également à la maladie d’Alzheimer. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are characterized by the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into its scrapie isoform (PrPSc). PrPSc-mediated toxicity is restricted to neurons and results from the subversion of PrPC function(s). Some neuronal specificity of PrPC signaling relates to its coupling to the Fyn src kinase. In this work, we report that PrPC has the capacity to mobilize another src kinase, Lyn, via caveolin in neurons. A downstream effector of the PrPC-cav-Lyn signaling complex, which is spatially restricted to cell bodies, is the GSK3ß kinase. The inactivation of GSK3ß by PrPC takes part to the control of neuronal functions by negatively regulating the activity of the serotonin 1B receptor. Furthermore, we show that in prion-infected cells, PrPSc constitutively activates the PrPC-cav-Fyn platform, leading to oxidative-stress conditions. This toxic gain of PrPC function induces a defect in metalloproteinase MMP-9 activity, leading to increased Aß levels. Another impact of prion infection is the overactivation of the PDK1 kinase, which results in the loss of function of the TACE metalloproteinase. PDK1 overactivation is also observed in neurons from Alzheimer’s disease model mice, and is shown to be PrPC dependent. PDK1 inhibition in models of prion infection or Alzheimer’s disease restores TACE-mediated alpha-cleavage of PrPC, APP and TNF-alphareceptor. Since positive effects of PDK1 inhibition are observed in vivo, our data posit PDK1 as a putative therapeutic target to combat TSE disorders and Alzheimer’s disease. In summary, achieving a better knowledge of PrPC signaling function may help to improve our understanding of the mechanisms sustaining neurodegeneration in prion and Alzheimer’s diseases.

Dans cette thèse nous avons étudié le stade débutant de la maladie d'Alzheimer par deux approches distinctes. D'un point de vue fondamental, nous avons étudié le rôle des oligomères d'Aß dans un modèle d'injection intracérébrale de ces espèces solubles chez la souris sauvage. Nous avons notamment montré que ces injections engendraient chez l'animal des désordres mnésiques aigus et réversibles qui s'apparentent à la maladie d'Alzheimer. Nous avons aussi mis en évidence une diminution d'expression d'une protéine post-synaptique (PSD95), une augmentation de la phosphorylation de la protéine Tau et une hyperactivation neuronale induites par ces injections, Ces modifications histo-fonctionnelles généralisées concordent avec le profil de dissémination diffus des solutions peptidiques injectées comme en atteste la mise en évidence de peptide Aß dans des régions distantes du site d'injection en immunohistochimie mais aussi en spectrométrie de masse. D'un point de vue clinique nous avons étudié la valeur du Rappel Libre/Rappel Indicé 16 items (RLRI16), un test de mémoire épisodique, au sein d'une cohorte de patients consultant pour une plainte mnésique ayant participé à un essai thérapeutique multicentrique national. Dans cette cohorte, le RLRI16 s'est avéré être le meilleur prédicteur de la survenue d'une démence d'Alzheimer probable dans les 5 ans qui ont suivi son administration. Le grand nombre de participants, la durée de l'étude et le mode de recrutement (par les généralistes) nous ont permis de proposer des valeurs seuils qui pourront aider le clinicien dans sa pratique quotidienne et permettront de définir des critères d'inclusion dans de nouveaux essais thérapeutiques. / We studied the early phase of Alzheimer’s disease with two approaches, experimental and clinical. Firstly, experimentally, we injected Aβ oligomers in the brain of wild type mice. We showed that these soluble species elicited memory impairment reminiscent of those found in AD although in our case they were both acute and reversible. We also evidenced a decrease in the expression of a postsynaptic protein (PSD95), an increase in the phosphorylation of Tau and a neuronal hyperactivity one week after these injections. These histo-functional changes were observed throughout the brain. The diffusion of the Aß injectate shown by immunohistochemistry and by mass spectrometry imaging was widespread. Clinically, we confirmed the usefulness of a memory test, the Free and Cued Selective Reminding Test (FCSRT) to predict the risk of dementia of the Alzheimer’s type (DAt) up to 5 years prior to its onset. This was made possible by the study of a cohort of patients who consulted for memory complaints and were then included in a multicentric national clinical trial conducted in France. In this cohort, the FCSRT proved to be the best predictor of the further conversion to a DAt. The large number of participants, length of the follow-up and recruitment type (mainly by the general practitioners) allowed us to derive thresholds to be used by clinicians in their daily practice or as inclusion criteria in new clinical trials.

GPR50, an X-linked orphan G protein-coupled receptor (GPCR), is a risk factor for bipolar disorder (BD) in female subjects. It has been shown that GPR50 plays a part in neurite outgrowth, glucocorticoid receptor signalling and leptin signalling by interacting with major factors involved in these events. Yeast two-hybrid screens have identified multiple putative GPR50 interactors involved in neurodevelopment, stress response and apoptosis, lipid and glucose metabolism, as well as regulation of NMDA receptors and GABA transmission. Among these interactors, RTN3, RTN4, SREBP2 and SNX6 are known regulators of β-secretase (BACE1), a key enzyme in Aβ generation, myelination of the central/peripheral nerve, and neurite outgrowth/synapse formation. Preliminary data indicated that GPR50 expression significantly increased endogenous BACE1 activity in HEK293 cells, so I hypothesised that there is a functional interaction between the two. In this thesis, I investigated the relationship between GPR50 and BACE1 by identifying the effects of GPR50 on BACE1 expression and function, which may provide an explanation of GPR50’s potential association with psychiatric disorders and Alzheimer’s disease. Firstly, studies on expression levels revealed that when GPR50 was over-expressed, BACE1 protein expression was up-regulated in SH-SY5Y cells, but down-regulated in HEK293 cells, suggesting a differentiated regulative system between cell lines. Then I confirmed the physical association between endogenous GPR50 and BACE1 in HEK293 cells by co-localisation and co-immunoprecipitation studies. Their putative interaction sites were located at the plasma membrane and the filopodia/lamellipodia-like structures in HEK293 cells, and at the neurites in mouse primary neuronal cells. Subcellular fractionation of adult mouse brain revealed that endogenous Gpr50 and Bace1 were co-fractionated in the presynaptic vesicles. Secondly, I showed that, in contrast to HEK293 cells, GPR50 overexpression had no effects on β-secretase activity in mouse primary cortical neurons. However, the BD-associated variant GPR50del significantly decreased β-secretase activity compared to the more common variant GPR50, and showed a trend of diminishing β-secretase activity compared to the control condition. Subcellular fractionation experiments showed that in HEK293 cells, there was an increased ratio of mature BACE1 against immature BACE1 localised in the plasma membrane fractions, indicating a role in regulation of BACE1 trafficking to one of its putative activity sites; whereas in mouse primary cortical neurons, GPR50del increased co-fractionation of immature Bace1 with endoplasmic reticulum (ER) marker calreticulin, thus potentially retarding the maturation of Bace1. Importantly, the regulative trend of GPR50/GPR50del on β-secretase activity is cell line-specific and is highly correlated to their effects on β-secretase intracellular distribution. Thirdly, I found that the mRNA levels of human GPR50 and BACE1 were negatively correlated in the dorsolateral prefrontal cortex of female subjects sampled after birth. Mouse Gpr50 and Bace1 mRNA levels were negatively correlated across the telencephalon regions, and had a trend of negative correlation across the hypothalamic regions. Co-localisation of the two proteins was detected in multiple mouse brain regions, with the strongest co-localised signals occurring in CA2 pyramidal neurons, arcuate hypothalamic nucleus and dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Finally, preliminary experiments in Alzheimer’s disease model TgSwDI mice, suggested that the expression level of Gpr50 in layer V of the entorhinal cortex was positively correlated with Aβ deposition. Decreased Gpr50 expression was identified in the hippocampus of 9 months transgenic animals compared with age-matched controls. This indicates that Gpr50 expression might be altered in this mouse model co-ordinately with Aβ deposition. The findings in this thesis provide further evidence of GPR50’s correlation to psychiatric illnesses and its interaction with enzyme BACE1 highlights a potential link to neurodegenerative disease.

La maladie d’Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente chez l’Homme et constitue un enjeu économique et de santé publique majeur. Les cerveaux de patients atteints présentent une atrophie corticale associée à deux types de lésions : les dégénérescences neurofibrillaires, constituées de protéines Tau agrégées, et les plaques amyloïdes, composées majoritairement de peptides amyloïde beta Aß agrégés. Les peptides Aß et leur agrégation seraient à l’origine de la pathogenèse. Afin d’éclaircir les mécanismes moléculaires à la base de la toxicité d’Aß, nous avons construit un modèle de toxicité d’Aß dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce modèle a permis d’établir que la toxicité d’Aß dans la levure est intimement liée à sa sécrétion et au trafic vésiculaire. Ce modèle nous a également permis de réaliser une étude structure-toxicité du peptide et de mettre en évidence des éléments en cis importants pour la toxicité d’Aß. Une nouvelle voie d’agrégation des peptides toxiques en structure riche en feuillet ß anti-parallèle a pu ainsi être mise en évidence. Le modèle de toxicité d’Aß et l’existence de variants très toxiques d’Aß dans la levure nous a permis de réaliser des cribles génétiques afin de rechercher les éléments modulant la toxicité d’Aß in vivo. Le trafic vésiculaire, en particulier l’endocytose via le remodelage du cytosquelette d’actine, un complexe responsable de la formation de vésicules intraluminales appelé ESCRT, forment autant de pistes à étudier pour améliorer notre compréhension de la toxicité d’Aß. / Alzheimer’s disease is the most common neurodegenerative disease. This pathology is caused by aggregation of Aß peptides. The exact mechanism of neuronal cell dysfunction in Alzheimer’s disease is poorly understood and numerous models have been used to decipher the mechanisms leading to cellular death. In order to clarify the molecular mechanisms underlying the toxicity of Aß, we generated a new model to study Aß toxicity in yeast Saccharomyces cerevisiae. In our model, Aß toxicity is closely related to its secretion and its intracellular traffic. Indeed, when Aß is targeted to the secretory pathway, it is able to produce toxic species. Interestingly, we demonstrated also that even if Aß is addressed to the secretory pathway, it is still able to form cytoplasmic aggregates. Moreover, with this model, we generated new highly toxic mutants of Aß by random mutagenesis. In order to correlate structural conformation ‘signature’ to Aß toxicity, we performed a structure-toxicity study of these new variants. In vitro, we demonstrated that a new anti-parallel aggregation pathway is associated with highly toxic mutants of Aß. Then, using our Aß yeast model and also these harmful variants, we performed genetic screens in order to identify candidate genes able to modulate Aß toxicity in vivo. Given these different screens, we found that vesicular trafficking, endocytosis via actin cytoskeleton remodeling, and ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Tansport) open new avenues to improve our understanding of Aß toxicity.

Die biologischen Grundlagen und sozioökonomischen Auswirkungen der Alzheimerschen Erkrankung (Alzheimer‘s Disease; AD) sind ein aktuelles Thema unserer immer älter werdenden Gesellschaft. Doch bis heute sind nicht alle pathophysiologischen Vorgänge erforscht, um diese Erkrankung in ihrer Ursache zu verstehen und damit Ansätze für eine adäquate Therapie zu ermöglichen. Eine weit verbreitete Theorie zur Krankheitsentstehung ist die Amyloid-Kaskaden-Hypothese, die ß-Amyloid (Aß)-Peptiden eine zentrale Rolle bei der Alzheimer-Pathogenese zuspricht. Diese Aß-Peptide entstehen durch proteolytische Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins (amyloid precursor protein; APP) und sind auch im Gehirn von nicht-dementen älteren Menschen nachweisbar. Neue Forschungsergebnisse legen nahe, dass bestimmte posttranslationale Modifikationen des Aß-Peptids zu verringertem Abbau, erhöhter Aggregation und gesteigerter Neurotoxizität beitragen. Eine solche besonders pathogene Aß-Variante ist Pyroglutamat-Aß (pE-Aß). Es entsteht durch N-terminale Verkürzung von Aß um zwei Aminosäuren und folgende Zyklisierung des N-terminalen Glutamats zu Pyroglutamat (pE). Eine Möglichkeit die Bildung, den Transport und die Ablagerung von pE-Aß im Gehirn verstorbener Alzheimer-Patienten und im Gehirn von Versuchstieren mit Amyloid-Pathologie zu untersuchen, ist die Verwendung spezifischer Antikörper. Ziel dieser Arbeit war es, vier neue monoklonale Antikörper hinsichtlich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Gehirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie zu untersuchen. Für diese Untersuchungen wurden transgene Mäuse des Stammes Tg2576 verwendet. Diese exprimieren humanes APP der neuronalen Isoform mit 695 Aminosäuren mit der sogenannten schwedischen Doppelmutation KM670/671NL. Diese Mutation sorgt dafür, dass APP ein besseres Substrat für die amyloidogene Prozessierung ist und verstärkt Aß gebildet wird. Tg2576-Mäuse entwickeln ab einem Alter von 11 bis 13 Monaten Alzheimer-typische Amyloidablagerungen im Neokortex und im Hippocampus. In der vorgelegten Arbeit wurden Mäuse im Alter von 16, 18 und 21 Monaten untersucht, um zu prüfen ob mit den neuen pE-Aß-Antikörpern die in anderen Arbeiten beschriebene Zunahme der Aß-Pathologie im Alterungsprozess dargestellt werden kann. Als Kontrollen wurden gleichaltrige Wurfgeschwister, die das Transgen nicht exprimieren, verwendet. Pro Altersstufe wurden zwei transgene Mäuse und ein Wildtyp-Tier untersucht. Die vier neuen zu charakterisierenden monoklonalen pE-Aß-Antikörper wurden von der Firma Probiodrug AG, Halle/Saale zur Verfügung gestellt. Sie wurden durch Immunisierung von C57Bl6-Mäusen mit einem Hexapeptid aus dem N-Terminus von pE-Aß (Sequenz pEFRHDS) generiert. Diese vier monoklonalen Antikörper besaßen verschiedene IgG-Subtypen: Klon K6 (IgG1), Klon K17 (IgG2b), Klon K24 (IgG1), Klon F8 (IgG3). Vergleichend wurde ein pE-Aß-Antikörper der Firma Synaptic Systems (Klon 2-48) vom Subtyp IgG1 verwendet. Auswahl der untersuchten Gehirne – „Gefäßhintergrund“. Durch ungleichmäßige Perfusion und Fixierung der Gehirne kann es zu einer unerwünschten Färbung von Blutgefäßen kommen, wodurch die Quantifizierung von Plaques erschwert wird. Um dies zu vermeiden wurden die Gehirne von 13 Mäusen hinsichtlich dieses Kriteriums mittels Immunhistochemie mit dem pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems untersucht und anschließend ausschließlich Tiere ohne oder mit sehr geringem Gefäßhintergrund verwendet. Eignung der neuen monoklonalen primären pE-Aß-Antikörper. Es wurde eine Versuchsreihe angefertigt, um die immunhistochemischen Färbungen der vier neuen monoklonalen pE-Aß-Antikörper an Mäusegewebe zu testen und diese mit dem etablierten Synaptic Systems Antikörper zu vergleichen. Die Testreihe zeigte erwartungsgemäß, dass der Synaptic Systems pE-Aß-Antikörper, aber auch die neuen Antikörper K6, K17 und F8 eine gute, jedoch auch unterschiedlich intensive Plaquefärbung erbrachten. Der Antikörper K24 wurde aus den weiteren Versuchsreihen ausgeschlossen, da keine Plaquefärbung nachweisbar war. Verdünnungsreihen der primären pE-Aß-Antikörper. Die verwendete Konzentration eines Antikörpers kann die Intensität der spezifischen Färbung, aber auch die Hintergrundfärbung stark beeinflussen. Deshalb galt es festzulegen, in welchen Verdünnungen die neuen primären pE-Aß-Antikörper zur Quantifizierung der Plaquefläche im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse eingesetzt werden sollten. Für jeden einzelnen Antikörper wurde eine Verdünnungsreihe (1:100; 1:250; 1:500) angefertigt und die Verdünnung bestimmt, welche die beste immunhistochemische Visualisierung der Aß-Ablagerungen ermöglicht. Dies war für den Klon K6 1:100, für Klon K17 1:250 und für Klon F8 1:250. Verwendung geeigneter Sekundär-Antikörper. Kommerziell verfügbare Sekundär-Antikörper gegen Maus-IgGs erkennen entweder alle IgG-Subytpen, oder sind gegen einzelne IgG-Subtypen gerichtet. Um geeignete Sekundär-Antikörper zum Nachweis der pE-Aß-Antikörper für die Plaque-Darstellung zu identifizieren, wurden verschiedene Verdünnungen (1:200 und 1:400) von nicht-Subtyp-spezifischen und von Subtyp-spezifischen biotinylierten Esel-anti-Maus IgGs getestet. Dabei zeigte sich, dass in jedem Fall die biotinylierten subtypspezifischen sekundären Esel anti-Maus Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 die geringste Hintergrundfärbung und das deutlichste Signal erbrachten. Deshalb wurden nur diese für die folgenden Versuchsreihen eingesetzt. Quantifizierung der Plaque-Beladung im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse. Um die Plaque-Beladung in definierten Hirnstrukturen APP-transgener Tg2576-Mäuse zu quantifizieren, wurden für jeden der vier untersuchten pE-Aß-Antikörper (Synaptic Systems, K6, K17 und F8) in drei Altersstufen (16, 18 und 21 Monate) in neun verschiedenen koronalen Schnittebenen immunhistologische Färbungen durchgeführt. Die Schnittebenen befanden sich auf Ebenen, die folgende Strukturen enthalten: 1 Präfrontaler Kortex, 2 Basales Vorderhirn, 3 anteriore Kommissur, 4 Nucleus basalis, 5 Hippocampus anterior, 6 Hippocampus posterior, 7 Locus coeruleus anterior, 8 Locus coeruleus posterior, 9 kaudaler Hirnstamm. Dies ermöglichte es, in verschiedenen Hirnregionen die Ablagerung von pE-Aβ während des Alterungsprozesses zu untersuchen. Es wurden für jede Hirnregion die aufeinanderfolgenden Schnitte für die vier primären Antikörper ausgewählt, sodass ein Maximalabstand von 120 µm zwischen den Färbungen der pE-Aß-Antikörper besteht, da jeder Schnitt eine Dicke von 30 µm aufwies. Da je Altersstufe zwei Tiere analysiert wurden, ergeben sich pro Antikörper und Altersstufe 18 gefärbte und quantifizierte Schnitte, demzufolge resultiert pro untersuchtem Antikörper eine Gesamtzahl von 54 Schnitten. Die Gesamtzahl der ausgewerteten Schnitte dieser Arbeit beträgt 224. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms BZ-II-Analyzer, einer Analysesoftware des Digitalmikroskops Keyence. Durch eine Aufnahme des kompletten Hirnschnitts und Markierung der Plaquefläche konnte deren prozentualer Anteil an der Hirnschnittfläche bestimmt werden. Betrachtet man die vier Antikörper untereinander, wird erkennbar, dass der pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems in jeder Altersstufe die größte Plaquefläche darstellt. Die pE-Aß-Antikörper K17 und F8 zeigen eine geringere und untereinander ähnliche Plaquefläche. Der K6 Antikörper weist die geringste Plaquefläche nach. Im Altersgang ist für alle untersuchten pE-Aß-Antikörper eine Zunahme der markierten Plaquefläche nachweisbar. Die untersuchten Gehirnschnittebenen sind unterschiedlich stark von pE-Aß-Ablagerungen betroffen. Die am weitesten rostral gelegene Schnittebene mit präfrontalem Kortex weist besonders viele pE-Aß-Ablagerungen auf, während die darauf folgende Schnittebene deutlich weniger pE-Aß-Ablagerungen zeigt. Danach gibt es Richtung kaudal wieder eine Zunahme der pE-Aß-Ablagerungen. In den Schnittebenen 7, 8 und 9 wurden keine pE-Aß-Ablagerungen nachgewiesen. Doppelmarkierungen von pE-Aß-Antikörpern verschiedener IgG-Subtypen und mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8. Um nachzuweisen, ob alle untersuchten pE-Aß-Antikörper dieselben Strukturen darstellen, wurde eine Versuchsreihe mit Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen angefertigt. Obwohl die primären monoklonalen pE-Aß-Antikörper alle in der Maus generiert wurden, erlaubten die verschiedenen IgG-Subtypen eine Doppelmarkierung mit Subtypen-spezifischen Sekundärantikörpern. Dabei zeigte sich, dass alle pE-Aß-Antikörper dieselben Anteile von Aβ-Ablagerungen erkennen. Um nachfolgend zu zeigen, welche Anteile der Aβ-Ablagerungen von den pE-Aβ-Antikörpern erkannt werden, wurden Doppelmarkierungen der verschiedenen pE-Aß-Antikörper mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8 angefertigt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die pE-Aβ-Peptide im Zentrum der Aβ-Ablagerungen befinden. In dieser Arbeit konnten vier neue monoklonale Antikörper bezüglich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Hirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie charakterisiert werden. Während der Klon K24 für die Plaquedarstellung ungeeignet ist, wurden für die Klone K17 und F8 vergleichbare, wenn auch geringere Plaqueflächen nachgewiesen als für den kommerziell verfügbaren Antikörper von Synaptic Systems. Der pE-Aß-Antikörper K6 markierte die geringste Plaquefläche. Dies könnte auf eine höhere Spezifität oder auf eine geringere Sensitivität von K17, F8 und K6 gegenüber dem Synaptic Systems Antikörper zurückzuführen sein. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen pE-Aß könnte es möglich sein, einen Impfstoff zu entwickeln, der gegen eine besonders toxische Aβ-Peptid-Variante gerichtet ist. Eine Immunisierung im Frühstadium der AD würde zwar nicht die Erkrankung in ihrem Ursprung heilen, könnte aber deren Verlauf verlangsamen. Zudem ist es denkbar, spezifische Antikörper gegen besonders neurotoxische pE-Aß-Varianten für die klinische Diagnosestellung zu etablieren.

<p>QC 20150922</p>

Die biologischen Grundlagen und sozioökonomischen Auswirkungen der Alzheimerschen Erkrankung (Alzheimer‘s Disease; AD) sind ein aktuelles Thema unserer immer älter werdenden Gesellschaft. Doch bis heute sind nicht alle pathophysiologischen Vorgänge erforscht, um diese Erkrankung in ihrer Ursache zu verstehen und damit Ansätze für eine adäquate Therapie zu ermöglichen. Eine weit verbreitete Theorie zur Krankheitsentstehung ist die Amyloid-Kaskaden-Hypothese, die ß-Amyloid (Aß)-Peptiden eine zentrale Rolle bei der Alzheimer-Pathogenese zuspricht. Diese Aß-Peptide entstehen durch proteolytische Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins (amyloid precursor protein; APP) und sind auch im Gehirn von nicht-dementen älteren Menschen nachweisbar. Neue Forschungsergebnisse legen nahe, dass bestimmte posttranslationale Modifikationen des Aß-Peptids zu verringertem Abbau, erhöhter Aggregation und gesteigerter Neurotoxizität beitragen. Eine solche besonders pathogene Aß-Variante ist Pyroglutamat-Aß (pE-Aß). Es entsteht durch N-terminale Verkürzung von Aß um zwei Aminosäuren und folgende Zyklisierung des N-terminalen Glutamats zu Pyroglutamat (pE). Eine Möglichkeit die Bildung, den Transport und die Ablagerung von pE-Aß im Gehirn verstorbener Alzheimer-Patienten und im Gehirn von Versuchstieren mit Amyloid-Pathologie zu untersuchen, ist die Verwendung spezifischer Antikörper. Ziel dieser Arbeit war es, vier neue monoklonale Antikörper hinsichtlich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Gehirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie zu untersuchen. Für diese Untersuchungen wurden transgene Mäuse des Stammes Tg2576 verwendet. Diese exprimieren humanes APP der neuronalen Isoform mit 695 Aminosäuren mit der sogenannten schwedischen Doppelmutation KM670/671NL. Diese Mutation sorgt dafür, dass APP ein besseres Substrat für die amyloidogene Prozessierung ist und verstärkt Aß gebildet wird. Tg2576-Mäuse entwickeln ab einem Alter von 11 bis 13 Monaten Alzheimer-typische Amyloidablagerungen im Neokortex und im Hippocampus. In der vorgelegten Arbeit wurden Mäuse im Alter von 16, 18 und 21 Monaten untersucht, um zu prüfen ob mit den neuen pE-Aß-Antikörpern die in anderen Arbeiten beschriebene Zunahme der Aß-Pathologie im Alterungsprozess dargestellt werden kann. Als Kontrollen wurden gleichaltrige Wurfgeschwister, die das Transgen nicht exprimieren, verwendet. Pro Altersstufe wurden zwei transgene Mäuse und ein Wildtyp-Tier untersucht. Die vier neuen zu charakterisierenden monoklonalen pE-Aß-Antikörper wurden von der Firma Probiodrug AG, Halle/Saale zur Verfügung gestellt. Sie wurden durch Immunisierung von C57Bl6-Mäusen mit einem Hexapeptid aus dem N-Terminus von pE-Aß (Sequenz pEFRHDS) generiert. Diese vier monoklonalen Antikörper besaßen verschiedene IgG-Subtypen: Klon K6 (IgG1), Klon K17 (IgG2b), Klon K24 (IgG1), Klon F8 (IgG3). Vergleichend wurde ein pE-Aß-Antikörper der Firma Synaptic Systems (Klon 2-48) vom Subtyp IgG1 verwendet. Auswahl der untersuchten Gehirne – „Gefäßhintergrund“. Durch ungleichmäßige Perfusion und Fixierung der Gehirne kann es zu einer unerwünschten Färbung von Blutgefäßen kommen, wodurch die Quantifizierung von Plaques erschwert wird. Um dies zu vermeiden wurden die Gehirne von 13 Mäusen hinsichtlich dieses Kriteriums mittels Immunhistochemie mit dem pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems untersucht und anschließend ausschließlich Tiere ohne oder mit sehr geringem Gefäßhintergrund verwendet. Eignung der neuen monoklonalen primären pE-Aß-Antikörper. Es wurde eine Versuchsreihe angefertigt, um die immunhistochemischen Färbungen der vier neuen monoklonalen pE-Aß-Antikörper an Mäusegewebe zu testen und diese mit dem etablierten Synaptic Systems Antikörper zu vergleichen. Die Testreihe zeigte erwartungsgemäß, dass der Synaptic Systems pE-Aß-Antikörper, aber auch die neuen Antikörper K6, K17 und F8 eine gute, jedoch auch unterschiedlich intensive Plaquefärbung erbrachten. Der Antikörper K24 wurde aus den weiteren Versuchsreihen ausgeschlossen, da keine Plaquefärbung nachweisbar war. Verdünnungsreihen der primären pE-Aß-Antikörper. Die verwendete Konzentration eines Antikörpers kann die Intensität der spezifischen Färbung, aber auch die Hintergrundfärbung stark beeinflussen. Deshalb galt es festzulegen, in welchen Verdünnungen die neuen primären pE-Aß-Antikörper zur Quantifizierung der Plaquefläche im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse eingesetzt werden sollten. Für jeden einzelnen Antikörper wurde eine Verdünnungsreihe (1:100; 1:250; 1:500) angefertigt und die Verdünnung bestimmt, welche die beste immunhistochemische Visualisierung der Aß-Ablagerungen ermöglicht. Dies war für den Klon K6 1:100, für Klon K17 1:250 und für Klon F8 1:250. Verwendung geeigneter Sekundär-Antikörper. Kommerziell verfügbare Sekundär-Antikörper gegen Maus-IgGs erkennen entweder alle IgG-Subytpen, oder sind gegen einzelne IgG-Subtypen gerichtet. Um geeignete Sekundär-Antikörper zum Nachweis der pE-Aß-Antikörper für die Plaque-Darstellung zu identifizieren, wurden verschiedene Verdünnungen (1:200 und 1:400) von nicht-Subtyp-spezifischen und von Subtyp-spezifischen biotinylierten Esel-anti-Maus IgGs getestet. Dabei zeigte sich, dass in jedem Fall die biotinylierten subtypspezifischen sekundären Esel anti-Maus Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 die geringste Hintergrundfärbung und das deutlichste Signal erbrachten. Deshalb wurden nur diese für die folgenden Versuchsreihen eingesetzt. Quantifizierung der Plaque-Beladung im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse. Um die Plaque-Beladung in definierten Hirnstrukturen APP-transgener Tg2576-Mäuse zu quantifizieren, wurden für jeden der vier untersuchten pE-Aß-Antikörper (Synaptic Systems, K6, K17 und F8) in drei Altersstufen (16, 18 und 21 Monate) in neun verschiedenen koronalen Schnittebenen immunhistologische Färbungen durchgeführt. Die Schnittebenen befanden sich auf Ebenen, die folgende Strukturen enthalten: 1 Präfrontaler Kortex, 2 Basales Vorderhirn, 3 anteriore Kommissur, 4 Nucleus basalis, 5 Hippocampus anterior, 6 Hippocampus posterior, 7 Locus coeruleus anterior, 8 Locus coeruleus posterior, 9 kaudaler Hirnstamm. Dies ermöglichte es, in verschiedenen Hirnregionen die Ablagerung von pE-Aβ während des Alterungsprozesses zu untersuchen. Es wurden für jede Hirnregion die aufeinanderfolgenden Schnitte für die vier primären Antikörper ausgewählt, sodass ein Maximalabstand von 120 µm zwischen den Färbungen der pE-Aß-Antikörper besteht, da jeder Schnitt eine Dicke von 30 µm aufwies. Da je Altersstufe zwei Tiere analysiert wurden, ergeben sich pro Antikörper und Altersstufe 18 gefärbte und quantifizierte Schnitte, demzufolge resultiert pro untersuchtem Antikörper eine Gesamtzahl von 54 Schnitten. Die Gesamtzahl der ausgewerteten Schnitte dieser Arbeit beträgt 224. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms BZ-II-Analyzer, einer Analysesoftware des Digitalmikroskops Keyence. Durch eine Aufnahme des kompletten Hirnschnitts und Markierung der Plaquefläche konnte deren prozentualer Anteil an der Hirnschnittfläche bestimmt werden. Betrachtet man die vier Antikörper untereinander, wird erkennbar, dass der pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems in jeder Altersstufe die größte Plaquefläche darstellt. Die pE-Aß-Antikörper K17 und F8 zeigen eine geringere und untereinander ähnliche Plaquefläche. Der K6 Antikörper weist die geringste Plaquefläche nach. Im Altersgang ist für alle untersuchten pE-Aß-Antikörper eine Zunahme der markierten Plaquefläche nachweisbar. Die untersuchten Gehirnschnittebenen sind unterschiedlich stark von pE-Aß-Ablagerungen betroffen. Die am weitesten rostral gelegene Schnittebene mit präfrontalem Kortex weist besonders viele pE-Aß-Ablagerungen auf, während die darauf folgende Schnittebene deutlich weniger pE-Aß-Ablagerungen zeigt. Danach gibt es Richtung kaudal wieder eine Zunahme der pE-Aß-Ablagerungen. In den Schnittebenen 7, 8 und 9 wurden keine pE-Aß-Ablagerungen nachgewiesen. Doppelmarkierungen von pE-Aß-Antikörpern verschiedener IgG-Subtypen und mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8. Um nachzuweisen, ob alle untersuchten pE-Aß-Antikörper dieselben Strukturen darstellen, wurde eine Versuchsreihe mit Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen angefertigt. Obwohl die primären monoklonalen pE-Aß-Antikörper alle in der Maus generiert wurden, erlaubten die verschiedenen IgG-Subtypen eine Doppelmarkierung mit Subtypen-spezifischen Sekundärantikörpern. Dabei zeigte sich, dass alle pE-Aß-Antikörper dieselben Anteile von Aβ-Ablagerungen erkennen. Um nachfolgend zu zeigen, welche Anteile der Aβ-Ablagerungen von den pE-Aβ-Antikörpern erkannt werden, wurden Doppelmarkierungen der verschiedenen pE-Aß-Antikörper mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8 angefertigt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die pE-Aβ-Peptide im Zentrum der Aβ-Ablagerungen befinden. In dieser Arbeit konnten vier neue monoklonale Antikörper bezüglich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Hirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie charakterisiert werden. Während der Klon K24 für die Plaquedarstellung ungeeignet ist, wurden für die Klone K17 und F8 vergleichbare, wenn auch geringere Plaqueflächen nachgewiesen als für den kommerziell verfügbaren Antikörper von Synaptic Systems. Der pE-Aß-Antikörper K6 markierte die geringste Plaquefläche. Dies könnte auf eine höhere Spezifität oder auf eine geringere Sensitivität von K17, F8 und K6 gegenüber dem Synaptic Systems Antikörper zurückzuführen sein. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen pE-Aß könnte es möglich sein, einen Impfstoff zu entwickeln, der gegen eine besonders toxische Aβ-Peptid-Variante gerichtet ist. Eine Immunisierung im Frühstadium der AD würde zwar nicht die Erkrankung in ihrem Ursprung heilen, könnte aber deren Verlauf verlangsamen. Zudem ist es denkbar, spezifische Antikörper gegen besonders neurotoxische pE-Aß-Varianten für die klinische Diagnosestellung zu etablieren.

Alzheimer’s disease (AD), the most common form of dementia is associated with fibril formation of amyloid-ß peptides (Aß). Aß, proteolytically derived from Aß precursor protein (AßPP), is the major component of amyloid plaques in AD brains. Familial British and Danish dementias (FBD and FDD) share pathological and clinical characteristics with AD, and the underlying mechanisms are associated with amyloid formation of mutant peptides released from the Bri2 protein. Bri2 interacts with AßPP and its BRICHOS domain has been shown to delay Aß40 and Aß42 fibril formation and toxicity in vitro and in vivo. This makes Bri2 BRICHOS a promising anti-amyloid chaperone and a potential treatment strategy for AD. Furthermore, Bri2 BRICHOS possesses a general chaperone activity as it suppresses non-fibrillar aggregation of destabilized citrate synthase (CS). Recent findings show that Bri2 BRICHOS produced in E.coli can form different molecular weight assemblies, ranging from monomers to dimers and poly-disperse oligomers. The oligomers inhibit CS aggregation, whereas the monomers and dimers are more efficient against Aß42 fibrillation and neurotoxicity, respectively. The work in this thesis shows that similar Bri2 BRICHOS quaternary structures are formed in eukaryotic cells as in E.coli. Larger BRICHOS oligomers were found in cell media, derived from proteolytically processed endogenous Bri2 in SH-SY5Y cells, as well as in human embryonic kidney (HEK293) cells transfected with a Bri2 BRICHOS construct. Recombinant human Bri2 BRICHOS mutants with one or none of the two strictly conserved cysteine residues were studied. All mutant monomers become proteolytically degraded during purification, but form stable oligomers. Single Cys to Ser mutants form stable disulfide-dependent dimers that differ in ability to prevent Aß42 fibrillation, the most stable mutant (C164S) being even more efficient than the wildtype Bri2 BRICHOS dimer. This result suggests that intra or intermolecular disulfide(s) and oligomerization affect Bri2 BRICHOS stability and activity towards Aß42 fibril formation.

Amyloid beta (Aβ) has been postulated to be the principle initiator of the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Therefore, understanding the underlying mechanisms of Aβ induced neurotoxicity in the early stages of AD would be essential for finding potential therapeutic targets of AD. Aβ-binding alcohol dehydrogenase (ABAD) has been shown to be a mitochondrial binding site for Aβ. Expression of ABAD has been found to be increased in brains of AD sufferers. Two dimensional electrophoresis studies have revealed that endophilin 1 was upregulated in Tg mAPP/ABAD mice brains as compared to Tg mAPP, Tg ABAD and non-Tg mice brains. Increased expression of endophilin 1 has also been found in brains of AD patients as compared to non-demented control brain tissues. Endophilin1 has been reported to regulate c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation. In this study, expression of dominant negative forms of endophilin 1 (DN-endophilin 1) in mouse cortical neurons exhibited a significant reduction of Aβ induced JNK activation. Furthermore, using cell counting methods, it was shown that the transfection of DN-endophilin 1 increased neuron survival after Aβ treatment. Aβ has also been proposed to disrupt the interaction of ABAD and Cyclophilin D (CypD), which would trigger mitochondrial permeable transition, thereby leading to neurotoxicity. For fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis of the interaction of ABAD and CypD, a mitochondria targeted, EYFP tagged ABAD plasmid (pMito-ABAD-EYFP) and an ECFP tagged CypD (pCypD-ECFP) plasmid were developed. Positive FRET signals in SK-N-SH cells co-expressing pMito-ABAD-EYFP and pCypD-ECFP indicated that ABAD interacts with CypD in the mitochondria of mammalian cells. RAGE (receptor for advanced glycation end products) has been reported to bind to Aβ and mediate the toxic effects of Aβ peptides on neurons and microglia. It has been shown previously that Tg mAPP/DN-RAGE mice display preserved cognitive function as compared to Tg mAPP mice. To investigate possible mechanisms involved in rescuing cognitive function by RAGE blockage, two dimensional electrophoresis was used to analyze differential protein expression between Tg mAPP and Tg mAPP/DN-RAGE mice cortex. Altered expression of four proteins, including NADH dehydrogenase flavoprotein 2 (NDUFV2), glyoxalase 1 (GLO1), proteasome subunit beta type 4 (PSMB4, or β7 subunit of proteasome) and nitrilase family, member 2 (Nit2) have been observed between Tg mAPP/DN-RAGE mice cortex and Tg mAPP mice cortex. NDUFV2 is a 24kDa subunit of complex 1 which is involved in ATP synthesis. GLO1 is a cytosolic enzyme that plays a role the glutathione-dependent detoxification of α-oxoaldehydes, such as methylglyoxal. PSMB4 is a subunit of the 26s proteosome which is in the degradation of ubiquitinylated proteins. The function of Nit2 is still unclear.