Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A planta Calotropis procera pertencente à famÃlia Asclepiadaceae à encontrada em vasta extensÃo do Nordeste Brasileiro. à uma planta laticÃfera e sua produÃÃo endÃgena de lÃtex à extraordinÃria. Embora haja na literatura cientÃfica diversas publicaÃÃes que relatam o potencial medicinal de diversas partes da planta, principalmente de seu lÃtex, nÃo hà ainda uma abordagem bioquÃmica e funcional de seu fluido laticÃfero. Esta pesquisa foi desenvolvida no sentido de proceder a um estudo bioquÃmico parcial de atividades endÃgenas da fraÃÃo protÃica majoritÃria do lÃtex e de avaliar seus efeitos inseticidas sobre diferentes modelos de pragas agrÃcolas. A fraÃÃo protÃica majoritÃria do lÃtex foi preparada a partir de um protocolo previamente desenvolvido no laboratÃrio em que sÃo envolvidas etapas de centrifugaÃÃo e diÃlise. A fraÃÃo protÃica isenta de borracha e de molÃculas de baixa massa molecular foi testada para atividades enzimÃticas endÃgenas proteolÃticas, quitinÃsicas e a-amilÃsica e atividades inibitÃrias para proteases e a-amilase. Ensaios enzimÃticos de digestÃo das proteÃnas do lÃtex por extratos digestivos de insetos foram tambÃm realizados. Bioensaios utilizando-se dietas artificiais contendo diferentes proporÃÃes das proteÃnas do lÃtex Ãntegras, digeridas por pronase ou aquecidas a 98 ÂC foram realizados com seis insetos pertencentes a quatro ordens. Nos bioensaios foram avaliados parÃmetros tais como desenvolvimento, sobrevivÃncia, tempo de emergÃncia dos indivÃduos alÃm de ser avaliado o efeito cumulativo de proteÃnas do lÃtex na dieta por sucessivas geraÃÃes. Na fraÃÃo protÃica do lÃtex foram encontradas atividades proteolÃticas do tipo cisteÃnica e serÃnica, alÃm de atividade quitinolÃtica. NÃo foi detectada atividade a-amilÃsica. SoluÃÃes de proteÃnas do lÃtex nÃo exibiram atividade inibitÃria do tipo a-amilÃsica e tripsÃnica ou quimiotripsÃnica. ApÃs tratamento tÃrmico, proteÃnas do lÃtex ainda solÃveis foram capazes de inibir a atividade da papaÃna. Posteriormente esta atividade inibitÃria foi capaz de inibir as atividades proteolÃticas de Callosobruchus maculatus e Dysdercus peruvianus. As proteÃnas do lÃtex foram inseticidas para C. maculatus, Zabrotes subfasciatus, Anticarsia gemmatalis e Ceratitis capitata enquanto que nÃo foram para Spodoptera frugiperda e D. peruvianus. NÃo houve efeito deletÃrio acumulativo em insetos submetidos a uma dieta contendo proteÃnas do lÃtex durante seis geraÃÃes. Quando digeridas por pronase e aquecidas por 30 min a 98 ÂC, a aÃÃo inseticida das proteÃnas do lÃtex ainda foi mantida sobre o C. maculatus. As proteÃnas do lÃtex foram completamente resistentes à proteÃlise por enzimas digestivas de Dysdercus peruvianus e Callosobruchus maculatus. Entretanto, a aÃÃo proteolÃtica endÃgena do lÃtex promoveu a proteÃlise do extrato enzimÃtico de C. maculatus embora isto nÃo tenha ocorrido no extrato intestinal de D. peruvianus. O lÃtex de C. procera apresenta forte atividade proteolÃtica e resistÃncia à proteÃlise por enzimas digestivas de insetos. Atividade quitinolÃtica foi tambÃm observada. O lÃtex possui atividade inseticida para diferentes pragas agrÃcolas e esta atividade parece estar associada à presenÃa de um inibidor de atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica, alÃm da presenÃa de quitinases e elevada atividade proteolÃtica endÃgena. Assim, a fraÃÃo protÃica do lÃtex pode ser considera como parte constituinte da defesa da planta contra insetos. / The plant Calotropis procera belonging to Asclepiadaceae is found around a vast extension of the Northeast from Brazil. It is a lactifers plant and its endogenous production of latex is admirable. Despite continuous reports appearing in the literature give mention to the medicinal properties of different parts of the plant, including the latex, there is not scientific approaches comprising biochemical of functional aspects of the latex from C. procera. The aims this work was determine the presence of endogenous enzymatic activities and inhibitory activity against different proteases and a-amylase, to evaluate insecticidal properties against different crop pests and to correlate enzymatic content and insecticidal action with possible role of the latex in protecting the plant to insect pathogens. The major soluble protein fraction from the latex was prepared following the protocol previously defined that includes centrifugations and dialysis steps. The protein fraction devoided of rubber and low molecular mass molecules was assayed to the presence of endogenous proteolytic activities as well as a-amylase activity. Even, the presence of inhibitor of such activities was investigated. Additionally the latex proteins were submitted to proteolysis by digestive content of different insects. Bioassays base on artificial diets with different contents of native, pronase digested or heated treated (98 ÂC) latex proteins were performed against six insects belonging to 4 different orders. Increment in bodyweight of larvae, time of development and percentage of survive were the parameters considered to analyze detrimental effects of latex proteins upon insects. The effect of latex proteins upon Callosbruchus maculatus insects by continuous exposure until F-6 generation was reached was performed. It was found strong endogenous proteolytic activity and latex proteins were resistent to proteolysis by insect digestive extracts. In addition chitinolytic activity was also detected. The latex exhibited insecticidal activity against different insect groups and this effect may be correlated to the presence of a cysteine protease inhibitor associated to its proteolytic properties and chitinolytic activity. It is suggested that the protein fraction of the latex from Calotropis procera plays a relevant role in defending the plant against pathogens.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-20T11:43:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1150678 bytes, checksum: 5ac766f88d369f0f72b4652b22015206 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-20T11:43:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1150678 bytes, checksum: 5ac766f88d369f0f72b4652b22015206 (MD5) Previous issue date: 2016-06-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O estudo da interação inseto-planta tem se mostrado um caminho promissor no controle de pragas. No entanto para um controle efetivo de pragas, tornou-se necessário o conhecimento da relação entre os insetos e sua microbiota associada. Esta interação entrou em foco quando os primeiros estudos provaram a dependência direta do hospedeiro de sua microbiota. Este estudo teve como objetivos caracterizar a diversidade microbiológica associada simbioticamente com o inseto herbívoro Anticarsia gemmatalis e suas consequências em termos de atividade proteolítica digestiva quando alimentado com diferentes dietas de soja suscetíveis e resistentes. Foram encontradas diferenças para a microbiota simbionte alimentadas com os diferentes cultivares de soja, (suscetível controle, estresse hídrico suscetíveis e resistência a insetos (IAC 17 e IAC 24)). Observamos a predominância dos filos Firmicutes e Proteobactérias para as bactérias e Ascomycota e Chytridiomycota para fungos. Em todos os grupos, foram observadas 210 unidades operacionais taxonômicos (OTUs) para bactérias e 110 OTUs para fungos. Os dados mostram que a dieta é determinante na composição da microbiota, sendo agrupadas em diferentes quadrantes, quando analisados por Escalonamento Multidimensional não paramétrico (nMDS), existindo OTUs bem estabelecidos para cada tipo de dieta. No entanto, não foram observadas diferenças para a atividade proteolítica das enzimas isoladas do intestino de Anticarsia gemmatalis alimentada com os diferentes cultivares de soja. Foi verificado a predominância de uma classe de enzimas para a atividade amidolítica e esterolítica, uma vez que não foi observado diferenças nos valores de Km entre os tratamentos. Análise de componente principal agrupou os tratamentos em três grupos distintos, apesar das diferentes dietas não ser determinante no perfil enzimático. Apesar da dieta ser determinante na pressão seletiva sobre a microbiota, ela não foi capaz de modular a resposta das proteases digestivas de Anticarsia gemmatalis. Estudos posteriores poderão acrescentar subsídios no entendimento do papel adaptativo de cada um. / The plant-insect interaction study has proven to be a promising way to control pests. However, for effective pest control, it has become necessary to know the relationship between insects and their associated microbiota. This interaction came into focus when the first studies proved the direct dependence of the host of their microbiota. This study aimed to characterize the microbial diversity associated symbiotically with herbivorous insect Anticarsia gemmatalis and its consequences in terms of digestive proteolytic activity when fed with different soybean diets susceptible and resistant. Differences were found for the symbiont microbiota fed with different soybean cultivars (susceptible control, susceptible water stress and insect resistance (IAC 17 and IAC 24)). We observed the prevalence of phyla Firmicutes and Proteobacteria for bacteria, and Ascomycota and Chytridiomycota for fungi. In all groups, we observed 210 taxonomic units (OTUs) for bacteria and 110 OTUs for fungi. The diversity and richness of data shows that the diet is critical in the composition of the microbiota, being grouped in different quadrants when analyzed by non-Metric Multidimensional Scaling (NMDS), there are OTUs well established for each type of diet. However, no differences were observed for the proteolytic activity of enzymes isolated from the intestine Anticarsia gemmatalis fed with different soybean cultivars. It was found the prevalence of a class of enzymes for amidolytic and esterolytic activity, since it was not observed differences in their Km values between treatments. Analysis principal component grouped the treatments on three separate groups, despite different diets not be determinative in the enzymatic profile. Although the diet is crucial in the selective pressure on the microbiota, she was not able to modulate the response of digestive proteases Anticarsia gemmatalis. Further studies may add subsidies on understanding the adaptive role of each.