Ureases são enzimas que realizam hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono e são isoladas de plantas, fungos e bactérias. A urease de C. ensiformis (JBU) tem algumas atividades biológicas independentes da sua atividade enzimática, como por exemplo: agregação plaquetária e efeito inseticida. O efeito inseticida é devido à liberação de um peptídeo interno por enzimas digestivas específicas dos insetos. Este peptídeo foi isolado, caracterizado e um análogo recombinante foi obtido e denominado Jaburetox-2Ec. Somente insetos com enzimas digestivas acídicas, como catepsinas, são capazes de liberar o peptídeo tóxico a partir da hidrólise de JBU. Insetos com enzimas básicas do tipo tripsina não são suscetíveis pois não há formação do peptídeo tóxico. Ninfas de D. peruvianus são sensíveis aos efeitos da JBU enquanto adultos não são. Este trabalho teve como objetivo estudar as diferenças enzimáticas entre os dois estágios do inseto para elucidar o processamento diferencial da JBU. Realizando a hidrólise in vitro da JBU com o homogeneizado de intestino de ninfas e adultos foi visto que tanto adultos como ninfas hidrolisam a JBU, mas somente ninfas liberam o peptídeo tóxico identificado pelo anticorpo específico anti-Jaburetox-2Ec. Ainda, através de ensaios enzimáticos utilizando substratos fluorogênicos e inibidores específicos, foi observada uma diferença no pH ótimo de atividade e na susceptibilidade a inibidores das enzimas digestivas presentes nos dois estágios. Substratos fluorogênicos correspondentes às regiões flanqueadoras do peptídeo dentro da JBU intacta foram desenhados e testados com os dois homogeneizados, o que também revelou que os homogeneizados dos dois estágios têm ação diferencial sobre estes substratos, sendo que ninfas liberariam mais eficientemente a extremidade Nterminal do peptídeo quando comparado aos adultos. Verificamos ainda que, em estudos eletrofisiológicos utilizando a técnica de “Planar Lipid Bilayer”, tanto a JBU como o Jaburetox-2Ec são capazes de se inserir em membrana lipídica planar, formando canais iônicos. Os canais formados pela JBU apresentaram quatro níveis de condutância majoritárias e seletividade para íons cloreto. / Ureases are enzymes that hydrolyze urea in ammonium and carbon dioxide and they have been isolated from plants, fungi and bacteria. Jackbean urease, from Canavalia ensiformis (JBU) displays biological activities unrelated from its enzymatic activity, as platelet aggregation and insecticide effect. This insecticide effect is due to the release of an internal peptide by insect specific digestive enzymes. This peptide was isolated, characterized and the recombinant peptide obtained was called Jaburetox- 2Ec. Only insects that rely on cathepsin-like digestive enzymes are able to hydrolyze JBU and release the toxic peptide. Insects with alkaline enzymes like tripsins are not susceptible because they don’t release the toxic peptide. Nymphs of D. peruvianus are susceptible to JBU effects while adults are not. The goal of this work was to study the enzymatic differences between both insect stages to elucidate JBU’s differential processing. In vitro hydrolysis were performed with nymphs and adults midgut homogenates and we observed that both adults and nymphs hydrolyze JBU but only nymphs are able to release the toxic peptide identified by Jaburetox-2Ec antibodies. Furthermore, in enzymatic assays using different fluorogenic substrates and specific inhibitors a difference in optimum pH and susceptibility to inhibitors of the digestive enzymes in both stages was observed. Fluorogenic substrates corresponding to the flanking regions of the peptide inside the intact JBU were produced and tested with both homogenates. Homogenates from both stages have differential action upon these substrates, considering that nymphs hydrolyses more efficiently the N-terminal of the peptide compared to adults. In electrophysiological studies using the Planar Lipid Bilayer technique we verify that JBU and Jaburetox-2Ec are able to insert in planar lipid membrane forming ionic channels. JBU’s channels display four major conductance levels and selectivity for chloride íons.

As sementes de Canavalia ensiformis são fonte de várias proteínas de interesse bioquímico e biotecnológico, como urease (JBU) e a canatoxina (CNTX). Ureases são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise de uréia em amônia e carbamato encontradas em plantas, fungos e bactérias. A canatoxina, uma proteína tóxica isolada a partir da mesma semente em 1981 por Carlini & Guimarães é uma isoforma de urease. A CNTX e a urease possuem atividade inseticida, sendo que o efeito entomotóxico se deve à produção de fragmentos das proteínas, gerados pela ação das enzimas digestivas dos insetos. Apenas grupos de insetos com digestão baseada em enzimas acídicas são suscetíveis à toxina. O mecanismo de ação da CNTX e peptídeos gerados a partir da sua hidrólise não está claramente elucidado. Considerando o potencial das isoformas de ureases de C. ensiformis e peptídeos derivados para desenvolvimento de inseticidas, é importante investigar os mecanismos de ação e os órgãos ou tecidos–alvos de sua toxicidade nos insetos. Esse trabalho teve como objetivo testar diferentes protocolos visando a imunolocalização da toxina e/ou seus fragmentos em diferentes tecidos do inseto modelo Dysdercus peruvianus, um percevejo praga da cultura do algodão. Mesmo testando diferentes condições experimentais, observamos reação cruzada dos anticorpos anti-urease com os tecidos do inseto D. peruvianus, inviabilizando os estudos de imunolocalização. Considerando que a semente de algodão apresenta uma urease endógena ainda pouco caracterizada, e o alto grau de homologia existente entre ureases de diferentes fontes vegetais, a reação cruzada observada nos tecidos dos insetos pode ser devido à presença da urease do algodão e de seus fragmentos, provenientes do alimento consumido. Outras tentativas de identificação de alvos moleculares do inseto que interagem in vitro com a urease foram feitas, como ensaios de ligand blot e cromatografia de afinidade, mas estes não apresentaram resultados conclusivos. A produção de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de ureases de C. ensiformis está entre as alternativas possíveis para atingir nosso objetivo. Numa primeira tentativa, camundongos foram imunizados com uma mistura de isoformas da urease de C. ensiformis, que apresentam cerca de 85% de identidade, resultando na produção de anticorpos com especificidades diferenciadas para JBU e para a CNTX. Obtivemos 22 clones positivos: dois apresentaram maior especificidade pela CNTX (cerca de 4 vezes); dois clones foram mais específicos para urease (cerca de 2 vezes) e um foi capaz de reconhecer um peptídeo inseticida recombinante derivado da urease, com maior especificidade (resposta 1,5 maior do que CNTX ou JBU). Os resultados demonstraram que é possível produzir anticorpos monoclonais que diferenciam as diferentes ureases de C. ensiformis, para uso futuro em imunohistoquímica.

Ureases são enzimas que realizam hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono e são isoladas de plantas, fungos e bactérias. A urease de C. ensiformis (JBU) tem algumas atividades biológicas independentes da sua atividade enzimática, como por exemplo: agregação plaquetária e efeito inseticida. O efeito inseticida é devido à liberação de um peptídeo interno por enzimas digestivas específicas dos insetos. Este peptídeo foi isolado, caracterizado e um análogo recombinante foi obtido e denominado Jaburetox-2Ec. Somente insetos com enzimas digestivas acídicas, como catepsinas, são capazes de liberar o peptídeo tóxico a partir da hidrólise de JBU. Insetos com enzimas básicas do tipo tripsina não são suscetíveis pois não há formação do peptídeo tóxico. Ninfas de D. peruvianus são sensíveis aos efeitos da JBU enquanto adultos não são. Este trabalho teve como objetivo estudar as diferenças enzimáticas entre os dois estágios do inseto para elucidar o processamento diferencial da JBU. Realizando a hidrólise in vitro da JBU com o homogeneizado de intestino de ninfas e adultos foi visto que tanto adultos como ninfas hidrolisam a JBU, mas somente ninfas liberam o peptídeo tóxico identificado pelo anticorpo específico anti-Jaburetox-2Ec. Ainda, através de ensaios enzimáticos utilizando substratos fluorogênicos e inibidores específicos, foi observada uma diferença no pH ótimo de atividade e na susceptibilidade a inibidores das enzimas digestivas presentes nos dois estágios. Substratos fluorogênicos correspondentes às regiões flanqueadoras do peptídeo dentro da JBU intacta foram desenhados e testados com os dois homogeneizados, o que também revelou que os homogeneizados dos dois estágios têm ação diferencial sobre estes substratos, sendo que ninfas liberariam mais eficientemente a extremidade Nterminal do peptídeo quando comparado aos adultos. Verificamos ainda que, em estudos eletrofisiológicos utilizando a técnica de “Planar Lipid Bilayer”, tanto a JBU como o Jaburetox-2Ec são capazes de se inserir em membrana lipídica planar, formando canais iônicos. Os canais formados pela JBU apresentaram quatro níveis de condutância majoritárias e seletividade para íons cloreto. / Ureases are enzymes that hydrolyze urea in ammonium and carbon dioxide and they have been isolated from plants, fungi and bacteria. Jackbean urease, from Canavalia ensiformis (JBU) displays biological activities unrelated from its enzymatic activity, as platelet aggregation and insecticide effect. This insecticide effect is due to the release of an internal peptide by insect specific digestive enzymes. This peptide was isolated, characterized and the recombinant peptide obtained was called Jaburetox- 2Ec. Only insects that rely on cathepsin-like digestive enzymes are able to hydrolyze JBU and release the toxic peptide. Insects with alkaline enzymes like tripsins are not susceptible because they don’t release the toxic peptide. Nymphs of D. peruvianus are susceptible to JBU effects while adults are not. The goal of this work was to study the enzymatic differences between both insect stages to elucidate JBU’s differential processing. In vitro hydrolysis were performed with nymphs and adults midgut homogenates and we observed that both adults and nymphs hydrolyze JBU but only nymphs are able to release the toxic peptide identified by Jaburetox-2Ec antibodies. Furthermore, in enzymatic assays using different fluorogenic substrates and specific inhibitors a difference in optimum pH and susceptibility to inhibitors of the digestive enzymes in both stages was observed. Fluorogenic substrates corresponding to the flanking regions of the peptide inside the intact JBU were produced and tested with both homogenates. Homogenates from both stages have differential action upon these substrates, considering that nymphs hydrolyses more efficiently the N-terminal of the peptide compared to adults. In electrophysiological studies using the Planar Lipid Bilayer technique we verify that JBU and Jaburetox-2Ec are able to insert in planar lipid membrane forming ionic channels. JBU’s channels display four major conductance levels and selectivity for chloride íons.

As sementes de Canavalia ensiformis são fonte de várias proteínas de interesse bioquímico e biotecnológico, como urease (JBU) e a canatoxina (CNTX). Ureases são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise de uréia em amônia e carbamato encontradas em plantas, fungos e bactérias. A canatoxina, uma proteína tóxica isolada a partir da mesma semente em 1981 por Carlini & Guimarães é uma isoforma de urease. A CNTX e a urease possuem atividade inseticida, sendo que o efeito entomotóxico se deve à produção de fragmentos das proteínas, gerados pela ação das enzimas digestivas dos insetos. Apenas grupos de insetos com digestão baseada em enzimas acídicas são suscetíveis à toxina. O mecanismo de ação da CNTX e peptídeos gerados a partir da sua hidrólise não está claramente elucidado. Considerando o potencial das isoformas de ureases de C. ensiformis e peptídeos derivados para desenvolvimento de inseticidas, é importante investigar os mecanismos de ação e os órgãos ou tecidos–alvos de sua toxicidade nos insetos. Esse trabalho teve como objetivo testar diferentes protocolos visando a imunolocalização da toxina e/ou seus fragmentos em diferentes tecidos do inseto modelo Dysdercus peruvianus, um percevejo praga da cultura do algodão. Mesmo testando diferentes condições experimentais, observamos reação cruzada dos anticorpos anti-urease com os tecidos do inseto D. peruvianus, inviabilizando os estudos de imunolocalização. Considerando que a semente de algodão apresenta uma urease endógena ainda pouco caracterizada, e o alto grau de homologia existente entre ureases de diferentes fontes vegetais, a reação cruzada observada nos tecidos dos insetos pode ser devido à presença da urease do algodão e de seus fragmentos, provenientes do alimento consumido. Outras tentativas de identificação de alvos moleculares do inseto que interagem in vitro com a urease foram feitas, como ensaios de ligand blot e cromatografia de afinidade, mas estes não apresentaram resultados conclusivos. A produção de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de ureases de C. ensiformis está entre as alternativas possíveis para atingir nosso objetivo. Numa primeira tentativa, camundongos foram imunizados com uma mistura de isoformas da urease de C. ensiformis, que apresentam cerca de 85% de identidade, resultando na produção de anticorpos com especificidades diferenciadas para JBU e para a CNTX. Obtivemos 22 clones positivos: dois apresentaram maior especificidade pela CNTX (cerca de 4 vezes); dois clones foram mais específicos para urease (cerca de 2 vezes) e um foi capaz de reconhecer um peptídeo inseticida recombinante derivado da urease, com maior especificidade (resposta 1,5 maior do que CNTX ou JBU). Os resultados demonstraram que é possível produzir anticorpos monoclonais que diferenciam as diferentes ureases de C. ensiformis, para uso futuro em imunohistoquímica.

Ureases são enzimas que realizam hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono e são isoladas de plantas, fungos e bactérias. A urease de C. ensiformis (JBU) tem algumas atividades biológicas independentes da sua atividade enzimática, como por exemplo: agregação plaquetária e efeito inseticida. O efeito inseticida é devido à liberação de um peptídeo interno por enzimas digestivas específicas dos insetos. Este peptídeo foi isolado, caracterizado e um análogo recombinante foi obtido e denominado Jaburetox-2Ec. Somente insetos com enzimas digestivas acídicas, como catepsinas, são capazes de liberar o peptídeo tóxico a partir da hidrólise de JBU. Insetos com enzimas básicas do tipo tripsina não são suscetíveis pois não há formação do peptídeo tóxico. Ninfas de D. peruvianus são sensíveis aos efeitos da JBU enquanto adultos não são. Este trabalho teve como objetivo estudar as diferenças enzimáticas entre os dois estágios do inseto para elucidar o processamento diferencial da JBU. Realizando a hidrólise in vitro da JBU com o homogeneizado de intestino de ninfas e adultos foi visto que tanto adultos como ninfas hidrolisam a JBU, mas somente ninfas liberam o peptídeo tóxico identificado pelo anticorpo específico anti-Jaburetox-2Ec. Ainda, através de ensaios enzimáticos utilizando substratos fluorogênicos e inibidores específicos, foi observada uma diferença no pH ótimo de atividade e na susceptibilidade a inibidores das enzimas digestivas presentes nos dois estágios. Substratos fluorogênicos correspondentes às regiões flanqueadoras do peptídeo dentro da JBU intacta foram desenhados e testados com os dois homogeneizados, o que também revelou que os homogeneizados dos dois estágios têm ação diferencial sobre estes substratos, sendo que ninfas liberariam mais eficientemente a extremidade Nterminal do peptídeo quando comparado aos adultos. Verificamos ainda que, em estudos eletrofisiológicos utilizando a técnica de “Planar Lipid Bilayer”, tanto a JBU como o Jaburetox-2Ec são capazes de se inserir em membrana lipídica planar, formando canais iônicos. Os canais formados pela JBU apresentaram quatro níveis de condutância majoritárias e seletividade para íons cloreto. / Ureases are enzymes that hydrolyze urea in ammonium and carbon dioxide and they have been isolated from plants, fungi and bacteria. Jackbean urease, from Canavalia ensiformis (JBU) displays biological activities unrelated from its enzymatic activity, as platelet aggregation and insecticide effect. This insecticide effect is due to the release of an internal peptide by insect specific digestive enzymes. This peptide was isolated, characterized and the recombinant peptide obtained was called Jaburetox- 2Ec. Only insects that rely on cathepsin-like digestive enzymes are able to hydrolyze JBU and release the toxic peptide. Insects with alkaline enzymes like tripsins are not susceptible because they don’t release the toxic peptide. Nymphs of D. peruvianus are susceptible to JBU effects while adults are not. The goal of this work was to study the enzymatic differences between both insect stages to elucidate JBU’s differential processing. In vitro hydrolysis were performed with nymphs and adults midgut homogenates and we observed that both adults and nymphs hydrolyze JBU but only nymphs are able to release the toxic peptide identified by Jaburetox-2Ec antibodies. Furthermore, in enzymatic assays using different fluorogenic substrates and specific inhibitors a difference in optimum pH and susceptibility to inhibitors of the digestive enzymes in both stages was observed. Fluorogenic substrates corresponding to the flanking regions of the peptide inside the intact JBU were produced and tested with both homogenates. Homogenates from both stages have differential action upon these substrates, considering that nymphs hydrolyses more efficiently the N-terminal of the peptide compared to adults. In electrophysiological studies using the Planar Lipid Bilayer technique we verify that JBU and Jaburetox-2Ec are able to insert in planar lipid membrane forming ionic channels. JBU’s channels display four major conductance levels and selectivity for chloride íons.

As sementes de Canavalia ensiformis são fonte de várias proteínas de interesse bioquímico e biotecnológico, como urease (JBU) e a canatoxina (CNTX). Ureases são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise de uréia em amônia e carbamato encontradas em plantas, fungos e bactérias. A canatoxina, uma proteína tóxica isolada a partir da mesma semente em 1981 por Carlini & Guimarães é uma isoforma de urease. A CNTX e a urease possuem atividade inseticida, sendo que o efeito entomotóxico se deve à produção de fragmentos das proteínas, gerados pela ação das enzimas digestivas dos insetos. Apenas grupos de insetos com digestão baseada em enzimas acídicas são suscetíveis à toxina. O mecanismo de ação da CNTX e peptídeos gerados a partir da sua hidrólise não está claramente elucidado. Considerando o potencial das isoformas de ureases de C. ensiformis e peptídeos derivados para desenvolvimento de inseticidas, é importante investigar os mecanismos de ação e os órgãos ou tecidos–alvos de sua toxicidade nos insetos. Esse trabalho teve como objetivo testar diferentes protocolos visando a imunolocalização da toxina e/ou seus fragmentos em diferentes tecidos do inseto modelo Dysdercus peruvianus, um percevejo praga da cultura do algodão. Mesmo testando diferentes condições experimentais, observamos reação cruzada dos anticorpos anti-urease com os tecidos do inseto D. peruvianus, inviabilizando os estudos de imunolocalização. Considerando que a semente de algodão apresenta uma urease endógena ainda pouco caracterizada, e o alto grau de homologia existente entre ureases de diferentes fontes vegetais, a reação cruzada observada nos tecidos dos insetos pode ser devido à presença da urease do algodão e de seus fragmentos, provenientes do alimento consumido. Outras tentativas de identificação de alvos moleculares do inseto que interagem in vitro com a urease foram feitas, como ensaios de ligand blot e cromatografia de afinidade, mas estes não apresentaram resultados conclusivos. A produção de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de ureases de C. ensiformis está entre as alternativas possíveis para atingir nosso objetivo. Numa primeira tentativa, camundongos foram imunizados com uma mistura de isoformas da urease de C. ensiformis, que apresentam cerca de 85% de identidade, resultando na produção de anticorpos com especificidades diferenciadas para JBU e para a CNTX. Obtivemos 22 clones positivos: dois apresentaram maior especificidade pela CNTX (cerca de 4 vezes); dois clones foram mais específicos para urease (cerca de 2 vezes) e um foi capaz de reconhecer um peptídeo inseticida recombinante derivado da urease, com maior especificidade (resposta 1,5 maior do que CNTX ou JBU). Os resultados demonstraram que é possível produzir anticorpos monoclonais que diferenciam as diferentes ureases de C. ensiformis, para uso futuro em imunohistoquímica.

A cultura algodoeira tem significativa participação na economia mundial. O algodão (Gossypium hirsutum) é predado por uma grande variedade de insetos, entre eles o percevejo manchador Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O hábito alimentar deste inseto provoca danos nas sementes e fibras depreciando-as para a utilização comercial. Como alternativa para o aumento da resistência das plantas ao ataque de insetos predadores, estratégias biotecnológicas vêm sendo consideradas. A Canavalia ensiformis é fonte de proteínas com atividade inseticida como a urease, a canatoxina e a concanavalina-A. Tanto a canatoxina como a urease exercem efeitos tóxicos em ninfas deste percevejo, causando mortalidade e atraso no desenvolvimento dos insetos sobreviventes. De maneira análoga a outros modelos de insetos já estudados, a toxicidade em D. peruvianus dependeria da ativação proteolítica das proteínas por enzimas digestivas (catepsinas) do inseto e formação de um peptídeo tóxico. Neste trabalho, estudos de hidrólise in vitro na presença de inibidores seguidos por SDS-page e Western-blot confirmaram a ativação proteolítica da urease por enzimas do tipo catepsina-B. O homogeneizado de intestinos de ninfas hidrolisa também substratos típicos para catepsinas, como hemoglobina e Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, e a atividade proteolítica é bloqueada por pepstatina-A e E-64, inibidores específicos para aspártico e cisteíno proteinases, respectivamente. Duas cisteíno proteinases (DpQ-NR e DpQ-E) de intestinos de ninfas de D. peruvianus foram parcialmente purificadas e caracterizadas. Ambas apresentaram pH ótimo de atividade proteolítica entre 4,5 e 6,5, na presença de DTT e foram totalmente inibidas por E-64. No entanto o perfil de inibição evidencia a presença de outras enzimas nas frações. Ensaios de especificidade da fração DpQ-NR revelaram a preferência da enzima por substratos contendo resíduo hidrofóbico em P2, enquanto a enzima DpQ-E tem preferência por substratos contendo aminoácidos básicos em P1. Assim, o trabalho desenvolvido sugere a presença de proteinases múltiplas no sistema digestivo de D. peruvianus e o possível envolvimento destas peptidases na ativação proteolítica da urease. / Cotton (Gossypium hirsutum), an important agricultural commodity, is attacked by a number of pests, such as the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) which may cause severe losses in cotton plantations. Bug feeding on the cotton seeds and stains the cotton fibers resulting in damage to the seed, besides being a vector for phytopathogenic bacteria and fungi. Biotechnology strategies focusing on plant defensive molecules are being considered as an alternative to increase host plant resistance against this pest. The jack bean Canavalia ensiformis is the source of proteins displaying insecticidal activity such as urease, canatoxin and concanavalin-A. Canatoxin and urease were shown to cause lethality and severe detrimental effects in surviving insects, delaying the development stages of D. peruvianus. As in other insect models studied previously, this would depend on the proteolytic activation of the protein by insect cathepsin-like digestive enzymes to produced toxic peptides. The in vitro hydrolysis of urease in the presence of inhibitors, followed by SDS-page and Wester-blot confirm the proteolytic activation by insect cathepsin B-like enzymes. A nymphal gut extract hydrolysed typical cathepsin substrates, such as hemoglobin and Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, and hydrolysis was blocked by pepstatin-A and E-64, specific inhibitors of aspartic and cysteine proteinases. Two cysteine peptidases (DpQ-NR and DpQ-E) of D. peruvianus nymphs were partially purified and characterized. Both enzymes showed maximum activities at pH 4.5-5.0 and 5.5-6.5 in the presence of dithiotreitol and were totally inhibited by E-64. However, the inhibition profile points out to the presence of other types of proteinases in both fractions. DpQ-NR preferentially hydrolysed substrate with hydrophobic amino acids in P2, while DpQ-E had preference for substrate with basic residues in P1. Therefore, our work suggests the presence of multiple proteinases with distinct biochemical properties in the digestive system of D. peruvianus and the potencial involvement of these peptidases on the proteolytic activation of urease.

O controle biológico pode ser definido como a utilização de antagonistas naturais para a diminuição ou redução de determinado organismo indesejado. Atualmente, esta estratégia constitui uma ferramenta segura e efetiva tanto para o controle de pragas da agricultura e da pecuária, quanto para vetores de doenças que atingem a saúde pública. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae tem se destacado neste âmbito devido às suas características entomopatogênicas e acaricidas, sendo utilizado comercialmente no Brasil para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar e estudado, mundialmente, como potencial biopesticida. Não se sabe quais são os fatores que definem a predileção do fungo a determinados hospedeiros, mas se acredita que fatores tais como uma maior adaptação do patógeno, a composição e a morfologia da cutícula possam influenciar. Neste trabalho foi avaliada a capacidade entomopatogênica de 8 linhagens de M. anisopliae sobre dois artrópodes: o percevejo manchador do algodão Dysdercus peruvianus e a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis. Todas as linhagens testadas de M. anisopliae foram mais efetivas contra D. peruvianus, quando comparadas à A. gemmatalis. A linhagem CG47 mostrou-se eficaz contra ambos os artrópodes testados. As linhagens C12, CG47, CG97 e Nordeste foram ativas contra A. gemmatalis, sendo C12 a mais virulenta. A secreção de proteases e quitinases durante o cultivo do fungo, em presença de cutículas de artrópodes, foi avaliada e parece ter sido influenciada pelo tipo de fonte de carbono disponível no meio de cultivo. A secreção de quitinases, ao contrário das proteases, pareceu não sofrer repressão tão acentuada, com a utilização de fontes facilmente metabolizáveis como a glicose; e, embora existam grandes diferenças entre as linhagens na capacidade de secreção de ambas as enzimas, a virulência observada nos bioensaios pareceu não estar correlacionada com a capacidade quitinolítica ou proteolítica das diferentes linhagens. Levando-se em conta que o processo de infecção de M. anisopliae em hospedeiros é multifatorial e dependente também dos artrópodes-alvo, foi feita a contagem total de hemócitos, sendo possível verificar um aumento destas células de defesa logo após o desafio com o patógeno. Neste trabalho, fica evidente o potencial de determinadas linhagens de M. anisopliae para o controle de D. peruvianus e A. gemmatalis. Também é sugerida a utilização do percevejo manchador do algodão como um novo modelo de pesquisa para os estudos que envolvem as interações patógeno-hospedeiro, mediante a análise de novos fatores de virulência desse patógeno e da resposta do hospedeiro à infecção. / Biological control can be defined as the utilization of natural enemies to reduce or to diminish some unwanted organism. Nowadays, this strategy is a safe and effective tool to control plagues from agriculture and pecuary and also for vectors of some important diseases of public health. The filamentous fungi Metarhizium anisopliae have been standed out in this field because its entomopathogenic and acaricide characteristics, being commercially used in Brazil to control the sugar cane bugs and being studied worldwide as a potential biopesticide. The factors that define the fungi specificity for some hosts are not known, although, is believed that factors as a greater adaptation of the pathogen and the cuticle composition and morphology may influence. In this work the entomopathogenic activity of 8 strains of M. anisopliae was evaluated against two arthropods: the cotton stainer Dysdercus peruvianus and the velvet bean caterpillar Anticarsia gemmatalis. All M. anisopliae strains tested were more efficient against D. peruvianus when compared to A. gemmatalis. Strain CG47 was active for both arthropods tested. Strains C12, CG47, CG97 and Nordeste were active against A. gemmatalis and C12 was the most virulen strain. Protease and chitiunase secretion during fungi growth with arthropod cuticles was tested and seem to be influenced by the kind of carbon source available in the media. Chitinase secretion, on the contrary to proteases seem not to respond so effectively to repression by the utilization of simple carbon compounds as glucose and, despite there are big differences between strains in the capacity to secret both enzymes, the virulence observed during bioassays seemed not to be correlacionated to their proteolitic or chitinolitic activity. Aware that the M. anisopliae infection process on hosts is multifactorial and also depends on arthropod response, the total hemocytes count were made and was possible to detect an increase on cellular counts after challenge with the pathogen. In this work is evident the potential of some M. anisopliae strains to control D. peruvianus and A. gemmatalis and it also suggests the utilization of the cotton stainer as a model for researches about host-pathogen interactions, studies about pathogen virulence factors as well studies to elucidate the host response to infection.

O controle biológico pode ser definido como a utilização de antagonistas naturais para a diminuição ou redução de determinado organismo indesejado. Atualmente, esta estratégia constitui uma ferramenta segura e efetiva tanto para o controle de pragas da agricultura e da pecuária, quanto para vetores de doenças que atingem a saúde pública. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae tem se destacado neste âmbito devido às suas características entomopatogênicas e acaricidas, sendo utilizado comercialmente no Brasil para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar e estudado, mundialmente, como potencial biopesticida. Não se sabe quais são os fatores que definem a predileção do fungo a determinados hospedeiros, mas se acredita que fatores tais como uma maior adaptação do patógeno, a composição e a morfologia da cutícula possam influenciar. Neste trabalho foi avaliada a capacidade entomopatogênica de 8 linhagens de M. anisopliae sobre dois artrópodes: o percevejo manchador do algodão Dysdercus peruvianus e a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis. Todas as linhagens testadas de M. anisopliae foram mais efetivas contra D. peruvianus, quando comparadas à A. gemmatalis. A linhagem CG47 mostrou-se eficaz contra ambos os artrópodes testados. As linhagens C12, CG47, CG97 e Nordeste foram ativas contra A. gemmatalis, sendo C12 a mais virulenta. A secreção de proteases e quitinases durante o cultivo do fungo, em presença de cutículas de artrópodes, foi avaliada e parece ter sido influenciada pelo tipo de fonte de carbono disponível no meio de cultivo. A secreção de quitinases, ao contrário das proteases, pareceu não sofrer repressão tão acentuada, com a utilização de fontes facilmente metabolizáveis como a glicose; e, embora existam grandes diferenças entre as linhagens na capacidade de secreção de ambas as enzimas, a virulência observada nos bioensaios pareceu não estar correlacionada com a capacidade quitinolítica ou proteolítica das diferentes linhagens. Levando-se em conta que o processo de infecção de M. anisopliae em hospedeiros é multifatorial e dependente também dos artrópodes-alvo, foi feita a contagem total de hemócitos, sendo possível verificar um aumento destas células de defesa logo após o desafio com o patógeno. Neste trabalho, fica evidente o potencial de determinadas linhagens de M. anisopliae para o controle de D. peruvianus e A. gemmatalis. Também é sugerida a utilização do percevejo manchador do algodão como um novo modelo de pesquisa para os estudos que envolvem as interações patógeno-hospedeiro, mediante a análise de novos fatores de virulência desse patógeno e da resposta do hospedeiro à infecção. / Biological control can be defined as the utilization of natural enemies to reduce or to diminish some unwanted organism. Nowadays, this strategy is a safe and effective tool to control plagues from agriculture and pecuary and also for vectors of some important diseases of public health. The filamentous fungi Metarhizium anisopliae have been standed out in this field because its entomopathogenic and acaricide characteristics, being commercially used in Brazil to control the sugar cane bugs and being studied worldwide as a potential biopesticide. The factors that define the fungi specificity for some hosts are not known, although, is believed that factors as a greater adaptation of the pathogen and the cuticle composition and morphology may influence. In this work the entomopathogenic activity of 8 strains of M. anisopliae was evaluated against two arthropods: the cotton stainer Dysdercus peruvianus and the velvet bean caterpillar Anticarsia gemmatalis. All M. anisopliae strains tested were more efficient against D. peruvianus when compared to A. gemmatalis. Strain CG47 was active for both arthropods tested. Strains C12, CG47, CG97 and Nordeste were active against A. gemmatalis and C12 was the most virulen strain. Protease and chitiunase secretion during fungi growth with arthropod cuticles was tested and seem to be influenced by the kind of carbon source available in the media. Chitinase secretion, on the contrary to proteases seem not to respond so effectively to repression by the utilization of simple carbon compounds as glucose and, despite there are big differences between strains in the capacity to secret both enzymes, the virulence observed during bioassays seemed not to be correlacionated to their proteolitic or chitinolitic activity. Aware that the M. anisopliae infection process on hosts is multifactorial and also depends on arthropod response, the total hemocytes count were made and was possible to detect an increase on cellular counts after challenge with the pathogen. In this work is evident the potential of some M. anisopliae strains to control D. peruvianus and A. gemmatalis and it also suggests the utilization of the cotton stainer as a model for researches about host-pathogen interactions, studies about pathogen virulence factors as well studies to elucidate the host response to infection.

A cultura algodoeira tem significativa participação na economia mundial. O algodão (Gossypium hirsutum) é predado por uma grande variedade de insetos, entre eles o percevejo manchador Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O hábito alimentar deste inseto provoca danos nas sementes e fibras depreciando-as para a utilização comercial. Como alternativa para o aumento da resistência das plantas ao ataque de insetos predadores, estratégias biotecnológicas vêm sendo consideradas. A Canavalia ensiformis é fonte de proteínas com atividade inseticida como a urease, a canatoxina e a concanavalina-A. Tanto a canatoxina como a urease exercem efeitos tóxicos em ninfas deste percevejo, causando mortalidade e atraso no desenvolvimento dos insetos sobreviventes. De maneira análoga a outros modelos de insetos já estudados, a toxicidade em D. peruvianus dependeria da ativação proteolítica das proteínas por enzimas digestivas (catepsinas) do inseto e formação de um peptídeo tóxico. Neste trabalho, estudos de hidrólise in vitro na presença de inibidores seguidos por SDS-page e Western-blot confirmaram a ativação proteolítica da urease por enzimas do tipo catepsina-B. O homogeneizado de intestinos de ninfas hidrolisa também substratos típicos para catepsinas, como hemoglobina e Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, e a atividade proteolítica é bloqueada por pepstatina-A e E-64, inibidores específicos para aspártico e cisteíno proteinases, respectivamente. Duas cisteíno proteinases (DpQ-NR e DpQ-E) de intestinos de ninfas de D. peruvianus foram parcialmente purificadas e caracterizadas. Ambas apresentaram pH ótimo de atividade proteolítica entre 4,5 e 6,5, na presença de DTT e foram totalmente inibidas por E-64. No entanto o perfil de inibição evidencia a presença de outras enzimas nas frações. Ensaios de especificidade da fração DpQ-NR revelaram a preferência da enzima por substratos contendo resíduo hidrofóbico em P2, enquanto a enzima DpQ-E tem preferência por substratos contendo aminoácidos básicos em P1. Assim, o trabalho desenvolvido sugere a presença de proteinases múltiplas no sistema digestivo de D. peruvianus e o possível envolvimento destas peptidases na ativação proteolítica da urease. / Cotton (Gossypium hirsutum), an important agricultural commodity, is attacked by a number of pests, such as the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) which may cause severe losses in cotton plantations. Bug feeding on the cotton seeds and stains the cotton fibers resulting in damage to the seed, besides being a vector for phytopathogenic bacteria and fungi. Biotechnology strategies focusing on plant defensive molecules are being considered as an alternative to increase host plant resistance against this pest. The jack bean Canavalia ensiformis is the source of proteins displaying insecticidal activity such as urease, canatoxin and concanavalin-A. Canatoxin and urease were shown to cause lethality and severe detrimental effects in surviving insects, delaying the development stages of D. peruvianus. As in other insect models studied previously, this would depend on the proteolytic activation of the protein by insect cathepsin-like digestive enzymes to produced toxic peptides. The in vitro hydrolysis of urease in the presence of inhibitors, followed by SDS-page and Wester-blot confirm the proteolytic activation by insect cathepsin B-like enzymes. A nymphal gut extract hydrolysed typical cathepsin substrates, such as hemoglobin and Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, and hydrolysis was blocked by pepstatin-A and E-64, specific inhibitors of aspartic and cysteine proteinases. Two cysteine peptidases (DpQ-NR and DpQ-E) of D. peruvianus nymphs were partially purified and characterized. Both enzymes showed maximum activities at pH 4.5-5.0 and 5.5-6.5 in the presence of dithiotreitol and were totally inhibited by E-64. However, the inhibition profile points out to the presence of other types of proteinases in both fractions. DpQ-NR preferentially hydrolysed substrate with hydrophobic amino acids in P2, while DpQ-E had preference for substrate with basic residues in P1. Therefore, our work suggests the presence of multiple proteinases with distinct biochemical properties in the digestive system of D. peruvianus and the potencial involvement of these peptidases on the proteolytic activation of urease.