O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2006. / Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A doenÃa de Parkinson (DP) à uma desordem neurodegenerativa, caracterizada pela destruiÃÃo dos neurÃnios nigroestriatais dopaminÃrgicos. O tratamento atual para esta doenÃa està restrito ao alÃvio sintomÃtico, porque atà o presente momento nÃo existem agentes capazes de inibir a degeneraÃÃo neuronal. Existem evidÃncias experimentais de que antagonistas de receptores A2A da adenosina poderiam ser Ãteis no tratamento de DP. Com a finalidade de investigar essa possibilidade, o presente trabalho demonstrou os efeitos da cafeÃna e do CSC (8-(3-chlorostyryl caffeine) no comportamento rotacional e nas alteraÃÃes neuroquÃmicas em ratos lesionados com 6-OHDA, como modelo da doenÃa de Parkinson. Os animais (ratos Wistar machos, 250-280g) foram tratados com cafeÃna (10 e 20 mg/kg, i.p.) diariamente durante 14 dias, iniciando 1h apÃs a lesÃo ou 7 dias, iniciando seis dias apÃs a lesÃo com 6-OHDA ou com CSC (1 e 5 mg/kg, i.p.) diariamente durante 7 dias, iniciando 6 dias apÃs a lesÃo com 6-OHDA, sozinho ou associado com L-DOPA (CSC 1 mg/kg, i.p. + L-DOPA 50mg/kg + Benzerazida 12,5 mg/kg, i.p.). Os resultados mostraram que houve um aumento significativo do nÃmero de rotaÃÃes induzidas por apomorfina nos animais lesionados com 6-OHDA (50 vezes) quando comparados aos animais falso operados. O tratamento com cafeÃna, principalmente durante 14 dias e o tratamento com CSC produziram uma recuperaÃÃo motora parcial com reduÃÃo do nÃmero de rotaÃÃes. A 6-OHDA provocou morte neuronal evidenciada pela reduÃÃo dos nÃveis de monoaminas (75-85%) quando comparadas ao lado contralateral. Nos grupos tratados com cafeÃna ou CSC sozinho ou associado com L-DOPA a reduÃÃo dos nÃveis de DA, 5HT e seus metabÃlitos foi menor. As concentraÃÃes dos aminoÃcidos glutamato e GABA foram significativamente aumentadas (3,8 e 3 vezes, respectivamente) no estriado de ratos lesionados. O CSC reverteu essas alteraÃÃes significativamente e foi observada uma potencializaÃÃo desses efeitos na associaÃÃo com L-DOPA. Os experimentos in vitro demonstraram que a cafeÃna e o CSC apresentaram um forte efeito neuroprotetor nas cÃlulas mesencefÃlicas de rato expostas a 6-OHDA. O tratamento com CSC ou cafeÃna aumentou significativamente o nÃmero de cÃlulas viÃveis apÃs a exposiÃÃo das cÃlulas a 6-OHDA, como foi demonstrado pelo teste do MTT. A exposiÃÃo das cÃlulas mesencefÃlicas a 6-OHDA aumentou os conteÃdos de nitrito e a peroxidaÃÃo lipÃdica, que retornaram a concentraÃÃes normais apÃs tratamento com CSC ou cafeÃna. AlÃm disso, a 6-OHDA reduziu o nÃmero de cÃlulas normais e aumentou o nÃmero de cÃlulas apoptÃticas e o tratamento com CSC ou cafeÃna reverteu esses efeitos da 6-OHDA, promovendo aumento do nÃmero de cÃlulas viÃveis e reduÃÃo do nÃmero de cÃlulas apoptÃticas. Houve uma reduÃÃo do nÃmero de microglias ativadas apÃs a exposiÃÃo das cÃlulas a cafeÃna e a 6-OHDA, o mesmo nÃo ocorreu apÃs a exposiÃÃo das cÃlulas ao CSC e a 6-OHDA. O tratamento com cafeÃna reduziu o aumento do nÃmero de astrÃcitos reativos induzidos pela 6-OHDA, enquanto o CSC nÃo apresentou esse efeito. Esses resultados mostraram que ambos, a cafeÃna e o CSC apresentaram aÃÃes neuroprotetoras em cÃlulas mesencefÃlicas de rato expostas a 6-OHDA. O presente trabalho mostrou que a cafeÃna e o CSC reverteram Ãs alteraÃÃes comportamentais e neuroquÃmicas da 6-OHDA, apresentando efeitos possivelmente benÃficos no tratamento da DP. / Parkinson disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta. Antagonists of the A2A subtype of adenosine receptor have emerged as a target for nondopaminergic antiparkinsonian agents. The present work showed the effects of caffeine and 8-(-3-chlorostyryl)-caffeine (CSC), A2A receptors antagonists, on behavior and biochemical alterations in 6-OHDA-lesioned rats, as a model of PD. Animals (male Wistar rats, 260-280 g) were injected daily with caffeine (10 and 20 mg/kg,i.p., 1h after 6-OHDA lesion for 14 days or six days after 6-OHDA lesion for 7 days), or CSC (1 and 5 mg/kg, i.p., 1h after 6-OHDA lesion for 7 days) alone or associated with L-DOPA (CSC 1 mg/kg, i.p. + L-DOPA 50mg/kg + Benzerazida 12,5 mg/kg, i.p., six days after 6-OHDA lesion for 7 days). Fourteen days after 6-OHDA, the animalsâ behavior was assessed by monitoring body rotations induced by apomorphine (3 mg/kg, i.p.). The results showed that the drastic increase in body rotation, induced by the 6-OHDA lesion, after the apomorphine challenge, was significantly (50 times) and dose-dependently reversed by CSC or caffeine. The decreased striatal levels of DA and metabolites, in the 6-OHDA-lesioned rats (75-85%), were blocked after caffeine or CSC alone or in association with L-DOPA treatment as well as the concentrations of NE, 5-HT and 5-HIAA. These effects were potentiated in 6-OHDA-lesioned animals treated with the association of CSC and L-DOPA. Concentrations of the amino acids glutamate and GABA were significantly increased (3.8 and 3 times, respectively) in the 6-OHDA-lesioned rat striatum. Similarly, CSC also reversed these alterations significantly. We also demonstrated protective effects against 6-OHDA-induced cytotoxicity in rat mesencephalic cells. Caffeine or CSC significantly increased the number of viable cells after their exposure to 6-OHDA, as measured by the MTT assay. While nitrite levels and lipid peroxidation in the cells were drastically increased by 6-OHDA, its concentration was brought toward normality after caffeine or CSC. 6-OHDA decreased the number of normal cells while increasing the number of apoptotic cells. Caffeine or CSC, significantly recovered the number of viable cells, and decreased the number of apoptotic cells, as compared to the group treated with 6-OHDA alone. Interestingly, while a significant lower number of activated microglia was seen after cells exposure to caffeine plus 6-OHDA, this was not the case after cells exposure to CSC plus 6-OHDA. While caffeine lowered the percentage of reactive astrocytes increased by 6-OHDA, CSC showed not effect. These results showed a strong neuroptrotection afforded by caffeine or CSC on rat mesencephalic cells exposed to 6-OHDA. In conclusion, we showed that CSC or caffeine reversed behavior and biochemical alterations, observed in the 6-OHDA-lesioned rats, pointing out to the potential benefit of A2A receptors antagonists as non-dopaminergic therapeutic targets for the treatment of PD.

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

Aims of this project - The aim of this study was to design and synthesise novel 2-aminopyrimidine derivatives as potential adenosine A1 and A2A receptor antagonists. Background and rationale - Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disorder (after Alzheimer’s disease) and is characterised by the selective death of the dopaminergic neurons of the nigro-striatal pathway. Distinctive motor symptoms include bradykinesia, muscle rigidity and tremor, while non-motor symptoms, of which cognitive dysfunction is an example, also frequently occur. Current therapy provides symptomatic relief mainly by augmentation of dopaminergic signalling (levodopa, dopamine agonists, MAO and COMT enzyme inhibitors), but disease progression is not adequately addressed. New therapies that can prevent further neurodegeneration in addition to providing symptomatic relief are therefore urgently required. Adenosine has an important function as neuromodulator in the central nervous system. The adenosine A2A receptor in particular plays an essential role in the regulation of movement. This, coupled to the fact that it is uniquely distributed in the basal ganglia, contributes to its attractiveness as non-dopaminergic target in the treatment of movement disorders, such as Parkinson’s disease. The efficacy of adenosine receptor antagonists has been illustrated in animal models of Parkinson’s disease and several adenosine receptor antagonists have also reached clinical trials. The neuroprotective properties of adenosine A2A receptor antagonists are further attributed to their ability to modulate neuro-inflammation and decrease the release of the excitatory neurotransmitter glutamate, which is implicated in neurotoxicity. While adenosine A1 receptor antagonism has a synergistic effect on the motor effects of adenosine A2A receptor antagonism, it has the additional benefit of improving cognitive dysfunction, a cardinal non-motor symptom of Parkinson’s disease. Dual antagonism of adenosine A1 and A2A receptors therefore offers the potential of providing symptomatic relief as well as the neuroprotection so desperately needed in the clinical environment. Amino substituted heterocyclic scaffolds, such as those containing the 2-aminopyrimidine motif, have been shown to exhibit good efficacy as dual adenosine receptor antagonists. Since the structure activity relationships of 2-aminopyrimidines have not been comprehensively explored, it is in this regard that this study aimed to make a contribution. Results - Fourteen 2-aminopyrimidines were synthesised successfully over three steps, (although in low yields) and characterised by nuclear magnetic resonance and infrared spectroscopy, mass spectrometry, by determination of melting points and high performance liquid chromatography. Structure modifications explored included variation of the aromatic substituent on position 4, as well as variations in the substituents of the phenyl ring, present on position 6 of the pyrimidine ring. Radioligand binding assays were performed to determine the affinities of the synthesised compounds for the adenosine A1 and A2A receptor subtypes. Several high dual affinity derivatives were identified during this study; the compound with the highest affinity was 4-(5- methylthiophen-2-yl)-6-[3-(piperidine-1-carbonyl)phenyl]pyrimidin-2-amine (39f) with Ki values of 0.5 nM and 2.3 nM for the adenosine A2A and adenosine A1 receptors, respectively. A few general structure activity relationships were derived, which included: The effect of the aromatic substituent (position 4) on A2A affinity could be summarised (in order of declining affinity) as follows: 5-methylthiophene > phenyl > furan > pyridine > p-fluorophenyl > benzofuran. On the other hand, the effect of this substituent on A1 receptor affinity could be summarised (in order of declining affinity) as follows: phenyl > 5-methylthiophene > pfluorophenyl > benzofuran > pyridine. The affinities as exhibited by the methylthiophene derivatives 39f, 39h – 39j, further showed that while piperidine substitution (39f) resulted in optimal A2A and A1 affinity, pyrrolidine substitution (39j) was less favourable. Substitution at the 4ʹ position of the phenyl ring, as well as thiazole substitution, generally resulted in poor adenosine A1 and A2A receptor affinity. However, 4-[2-amino-6-(5-methylfuran-2-yl)pyrimidin- 4-yl]-N-(1,3-benzothiazol-2-yl)benzamide (39l) surprisingly demonstrated good affinity and selectivity for the adenosine A1 receptor. The results obtained during radioligand binding assays were rationalised by QSAR and molecular modelling (Discovery Studio 3.1, Accelrys) studies. The inverse relationship seen between log Ki (as indicator of affinity) and polar surface area, illustrated the importance of this physico-chemical property in the design of 2-aminopyrimidine A2A antagonists. The results from the docking study further showed that the orientation adopted by derivatives in the binding cavity (and particular hydrogen bonding to Asn 253 and Glu 169) is of importance. Results from the MTT cell viability assay indicated that none of the high affinity derivatives had a significant effect on cell viability at 1 μM, a concentration much higher than their Ki values. However, incorporation of the furan, benzofuran and p-fluorophenyl groups as aromatic substituent and a pyrrolidine as amine substituent, presented liabilities. Lastly, the haloperidol induced catalepsy assay (in rats) was used to give a preliminary indication of adenosine receptor antagonism or agonism. Compound 39f failed to reverse catalepsy under standard conditions, but showed some reversal after an increased time period. Indications therefore exist that 39f is an adenosine receptor antagonist that suffers from bioavailability issues. Compound (39c), 4-phenyl-6-[3-(piperidine-1- carbonyl)phenyl]pyrimidin-2-amine which also demonstrated promising affinity in the radioligand binding assays however showed a statistically significant reduction in catalepsy, indicating adenosine A2A receptor antagonism, and in vivo efficacy. Highly potent, dual affinity aminopyrimidine derivatives with acceptable toxicity profiles were identified in this study, with compound 39c demonstrating in vivo activity. The aim of designing and synthesising a promising dual adenosine A1/A2A receptor antagonist is therefore realised, with compound 39c as the most favourable example. / MSc (Pharmaceutical Chemistry), North-West University, Potchefstroom Campus, 2014

O canabidiol (CBD), o principal canabinóide não psicotrópico extraído da marijuana (Cannabis sativa), é reconhecido por sua potente propriedade imunosupressora e anti-inflamatória. A injúria pulmonar aguda (ALI) é uma doença inflamatória para qual ainda não foi desenvolvida terapias específicas e a única alternativa de tratamento é meramente de suporte em UTI. Desta forma, foi proposta uma investigação sobre os efeitos anti-inflamatórios do CBD em um modelo murino de ALI, induzida pela instilação intra-nasal de LPS (lipopolissacarídeo), dentro de uma perspectiva imune-neuro-endocrinológica. Para a análise do potencial anti-inflamatório do CBD, avaliou-se a contagem total e diferencial de células do lavado broncoalveolar (LBA) (análise da migração de leucócitos para os pulmões), a atividade de mieloperoxidase (MPO) no tecido pulmonar (análise indireta da atividade de neutrófilos), a produção de citocinas e quimicionas no sobrenadante do LBA (análise do perfil inflamatório pulmonar), a concentração de proteínas (albumina) no sobrenadante do LBA (análise indireta da permeabilidade vascular pulmonar) e a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e VLA-4) em leucócitos do LBA. Analisou-se, ainda, o mecanismo farmacológico dos efeitos anti-inflamatórios do CBD no modelo de ALI, utilizando-se de um antagonista altamente seletivo para o receptor de adenosina A2A (ZM241385). Por fim, avaliou-se os efeitos neuroendócrinos do CBD na vigência da inflamação pulmonar; analisou-se a atividade geral dos animais no campo aberto (análise do comportamento doentio) e os níveis séricos de corticosterona (análise da ativação do eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA)). Mostrou-se que tanto o tratamento prolifático (antes da indução da inflamação) como o tratamento terapêutico (depois da indução da inflamação), com uma dose única de CBD (20 ou 80 mg/kg) apresenta um efeito anti-inflamatório prolongado em camundongos submetidos ao modelo de ALI (principalmente 1 e 2 dias após a indução da inflamação). Mostrou-se que o CBD diminuiu a migração de leucócitos para os pulmões (neutrófilos, macrófagos e linfócitos), diminuiu a produção de citocinas (TNF e IL-6) e quimicinas (MCP-1 e MIP-2) no LBA, diminuiu a atividade MPO no tecido pulmonar, diminuiu a concentração de albumina no LBA e diminuiu a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1) em neutrófilos do LBA. Mostrou-se, ainda, que o receptor de adenosina A2A está envolvido nos efeitos anti-inflamatórios do CBD na ALI, uma vez que o tratamento com o ZM241385 aboliu todos os efeitos anti-inflamatórios descritos previamente. Por fim, mostrou-se que o CBD apresentou poucos efeitos comportamentais no campo aberto e que não ativou o eixo HPA. Desta forma, mostrou-se pela primeira vez que o tratamento profilático e, também, o tratamento terapêutico com CBD (20 ou 80 mg/kg) tem um efeito anti-inflamatório prolongado em um modelo murino de ALI, muito provavelmente em decorrência de um aumento da sinalização via receptor de adenosina A2A. Por esta razão, acredita-se que o CBD possa ser considerado, no futuro, uma ferramenta terapêutica útil no tratamento de doenças inflamatórias pulmonares. / Cannabidiol (CBD), the major non-psychotropic plant (Cannabis sativa)-derived cannabinoid, is recognized for its immunossupressant and anti-inflammatory properties. Acute lung injury (ALI) is an inflammatory condition for which treatment is mainly supportive (ICU patients), because effective therapies have not been developed. Therefore, it was proposed an investigation in order to address the anti-inflammatory effects of CBD in a murine model of LPS-induced ALI, within an immune-neuro-endocrine perspective. To analyze the potential anti-inflammatory effect of CBD, it was evaluated total and differencial cell count of leukocytes present in the bronchoalveolar lavage (BAL) (migration of leukocytes into the lungs), myeloperoxidase activity in the lung tissue (indirect analysis of neutrophil activity), production of cytokines and chemokines in the BAL (analysis of the pulmonar inflammatory profile), protein (albumin) concentration in the BAL (indirect analysis of pulmonar vascular permeability), and expression of adhesion molecules (ICAM-1 and VLA-4) in leukocytes of the BAL. It was also analyzed the pharmacologic mechanism of the anti-inflammatory effects of CBD in the model of ALI, by using a highly selective antagonist of the adenosine A2A receptor (ZM241385). Finally, it was analyzed the neuro-endocrine effects of CBD in the context of lung inflammation; it was analyzed the general activity of the mice in the open field (analysis of sickness behavior) and the seric levels of corticosterone (activation of HPA (Hypothalamus-Hypophysis-Adrenal) axis). It was shown that both prophylactic (before the induction of inflammation) and therapeutic (after the induction of inflammation) protocols of treatment, with a sigle dose of CBD (20 or 80 mg/kg), has a long-term anti-inflammatory effect in mice submitted to the model of ALI (specially, after 1 and 2 days of the induction of inflammation). It was shown that CBD decreased leukocyte (neutrophil, macrophage, and lymphocytes) migration into the lungs, decreased cytokines (TNF and IL-6) and chemokines (MCP-1 and MIP-2) in the BAL, decreased MPO activity in the lung tissue, decreased albumin concentration in the BAL, and decreased adhesion molecule expression (ICAM-1) in neutrophils of the BAL. It was also shown that adenosine A2A receptor is involved in the anti-inflammatory effects of CBD on LPS-induced ALI, because ZM241385 abrogated all of the anti-inflammatory effects of cannabidiol previously described. Finally, it was shown that CBD has discreet behavioral effects in the open field and was not able to activate the HPA axis. Thus, it was shown for the first time that both prophylactic and also therapeutic treatment with CBD (20 or 80 mg/kg) has a long-term anti-inflammatory effect in a murine model of ALI, most likely associated with an increase in the signaling through the adenosine A2A receptor. Hence, it is possible that in the future CBD may prove useful as a therapeutical tool in the treatment of pulmonar inflammatory conditions.

O canabidiol (CBD), o principal canabinóide não psicotrópico extraído da marijuana (Cannabis sativa), é reconhecido por sua potente propriedade imunosupressora e anti-inflamatória. A injúria pulmonar aguda (ALI) é uma doença inflamatória para qual ainda não foi desenvolvida terapias específicas e a única alternativa de tratamento é meramente de suporte em UTI. Desta forma, foi proposta uma investigação sobre os efeitos anti-inflamatórios do CBD em um modelo murino de ALI, induzida pela instilação intra-nasal de LPS (lipopolissacarídeo), dentro de uma perspectiva imune-neuro-endocrinológica. Para a análise do potencial anti-inflamatório do CBD, avaliou-se a contagem total e diferencial de células do lavado broncoalveolar (LBA) (análise da migração de leucócitos para os pulmões), a atividade de mieloperoxidase (MPO) no tecido pulmonar (análise indireta da atividade de neutrófilos), a produção de citocinas e quimicionas no sobrenadante do LBA (análise do perfil inflamatório pulmonar), a concentração de proteínas (albumina) no sobrenadante do LBA (análise indireta da permeabilidade vascular pulmonar) e a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e VLA-4) em leucócitos do LBA. Analisou-se, ainda, o mecanismo farmacológico dos efeitos anti-inflamatórios do CBD no modelo de ALI, utilizando-se de um antagonista altamente seletivo para o receptor de adenosina A2A (ZM241385). Por fim, avaliou-se os efeitos neuroendócrinos do CBD na vigência da inflamação pulmonar; analisou-se a atividade geral dos animais no campo aberto (análise do comportamento doentio) e os níveis séricos de corticosterona (análise da ativação do eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA)). Mostrou-se que tanto o tratamento prolifático (antes da indução da inflamação) como o tratamento terapêutico (depois da indução da inflamação), com uma dose única de CBD (20 ou 80 mg/kg) apresenta um efeito anti-inflamatório prolongado em camundongos submetidos ao modelo de ALI (principalmente 1 e 2 dias após a indução da inflamação). Mostrou-se que o CBD diminuiu a migração de leucócitos para os pulmões (neutrófilos, macrófagos e linfócitos), diminuiu a produção de citocinas (TNF e IL-6) e quimicinas (MCP-1 e MIP-2) no LBA, diminuiu a atividade MPO no tecido pulmonar, diminuiu a concentração de albumina no LBA e diminuiu a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1) em neutrófilos do LBA. Mostrou-se, ainda, que o receptor de adenosina A2A está envolvido nos efeitos anti-inflamatórios do CBD na ALI, uma vez que o tratamento com o ZM241385 aboliu todos os efeitos anti-inflamatórios descritos previamente. Por fim, mostrou-se que o CBD apresentou poucos efeitos comportamentais no campo aberto e que não ativou o eixo HPA. Desta forma, mostrou-se pela primeira vez que o tratamento profilático e, também, o tratamento terapêutico com CBD (20 ou 80 mg/kg) tem um efeito anti-inflamatório prolongado em um modelo murino de ALI, muito provavelmente em decorrência de um aumento da sinalização via receptor de adenosina A2A. Por esta razão, acredita-se que o CBD possa ser considerado, no futuro, uma ferramenta terapêutica útil no tratamento de doenças inflamatórias pulmonares. / Cannabidiol (CBD), the major non-psychotropic plant (Cannabis sativa)-derived cannabinoid, is recognized for its immunossupressant and anti-inflammatory properties. Acute lung injury (ALI) is an inflammatory condition for which treatment is mainly supportive (ICU patients), because effective therapies have not been developed. Therefore, it was proposed an investigation in order to address the anti-inflammatory effects of CBD in a murine model of LPS-induced ALI, within an immune-neuro-endocrine perspective. To analyze the potential anti-inflammatory effect of CBD, it was evaluated total and differencial cell count of leukocytes present in the bronchoalveolar lavage (BAL) (migration of leukocytes into the lungs), myeloperoxidase activity in the lung tissue (indirect analysis of neutrophil activity), production of cytokines and chemokines in the BAL (analysis of the pulmonar inflammatory profile), protein (albumin) concentration in the BAL (indirect analysis of pulmonar vascular permeability), and expression of adhesion molecules (ICAM-1 and VLA-4) in leukocytes of the BAL. It was also analyzed the pharmacologic mechanism of the anti-inflammatory effects of CBD in the model of ALI, by using a highly selective antagonist of the adenosine A2A receptor (ZM241385). Finally, it was analyzed the neuro-endocrine effects of CBD in the context of lung inflammation; it was analyzed the general activity of the mice in the open field (analysis of sickness behavior) and the seric levels of corticosterone (activation of HPA (Hypothalamus-Hypophysis-Adrenal) axis). It was shown that both prophylactic (before the induction of inflammation) and therapeutic (after the induction of inflammation) protocols of treatment, with a sigle dose of CBD (20 or 80 mg/kg), has a long-term anti-inflammatory effect in mice submitted to the model of ALI (specially, after 1 and 2 days of the induction of inflammation). It was shown that CBD decreased leukocyte (neutrophil, macrophage, and lymphocytes) migration into the lungs, decreased cytokines (TNF and IL-6) and chemokines (MCP-1 and MIP-2) in the BAL, decreased MPO activity in the lung tissue, decreased albumin concentration in the BAL, and decreased adhesion molecule expression (ICAM-1) in neutrophils of the BAL. It was also shown that adenosine A2A receptor is involved in the anti-inflammatory effects of CBD on LPS-induced ALI, because ZM241385 abrogated all of the anti-inflammatory effects of cannabidiol previously described. Finally, it was shown that CBD has discreet behavioral effects in the open field and was not able to activate the HPA axis. Thus, it was shown for the first time that both prophylactic and also therapeutic treatment with CBD (20 or 80 mg/kg) has a long-term anti-inflammatory effect in a murine model of ALI, most likely associated with an increase in the signaling through the adenosine A2A receptor. Hence, it is possible that in the future CBD may prove useful as a therapeutical tool in the treatment of pulmonar inflammatory conditions.