Earthworm-microbial interactions with emphasis on the passage effects of Eisenia spp. on microbial community were investigated. The study was focused on earthworm potential to regulate functional microbiota in cattle-impacted soils. Microbial communities were studied through a combination of polar lipid analyses, molecular, and culturing methods.

Vivant à des températures supérieures à 80°C, les archées hyperthermophiles ont démontré une capacité étonnante à se remettre de dommages dans leur ADN, suggérant la présence de gardiens du génome particulièrement efficaces. Ces gardiens, des protéines relativement similaires entre archées et eucaryotes, agissent et interagissent dans un ballet savamment orchestré par la cellule. Chez les archées, plusieurs protéines impliquées dans des voies essentielles à la réparation de I'ADN manquent à I'appel. Précédemment au laboratoire un réseau impliquant les protéines de la maintenance génomique de Pyrococcus abyssi a dévoilé de nouvelles interactions protéine-protéine. Décrire l'interaction pour mieux comprendre sa fonction, voici la démarche suivie et présentée dans ce manuscrit pour les duos: PCNA/Mrell-Rad50 et MCM/XPD. Pour la première fois chez Pyrococcus furiostts une interaction physique et fonctionnelle a été démontrée entre PCNA, le maestro de la réplication, et Mrell-Rad50, le complexe de la recombinaison. Pour la seconde étude, la caractérisation de l'hélicase réplicative MCM de P. abyssi a été menée via une approche biophysique basée sur des techniques de fluorescence. Les difficultés rencontrées durant la production de son partenaire potentiel XPD, n'ont toutefois pu permettre la caractérisation de leur interaction. Plus généralement ces interactions s'inscrivent dans un contexte où le couplage de la réplication avec des processus de réparation trouve son importance particulièrement chez les archées de l'extrême, archées qui se révèlent être de passionnants modèles pour l'étude des mécanismes de la maintenance génomique. / Living at temperatures above 80°C, hyperthermophilic Archaea demonstrated amazing capacity to recover from DNA damages, suggesting they arguably have efficient genome guardians. These guardians, proteins which are relatively similar between Archaea and eukaryotes, act and interact like a ballet orchestrated by the cell. Several proteins involved in essential repair pathway in eukaryotes are missing in Archaea. To gain insights into archaeal genome maintenance processes, a previous work proposed a protein-protein interaction network based on Pyrococcus abyssi proteins. Through this network, new interactions involving proteins from DNA replication and proteins from DNA repair were highlighted. To describe interactions for a better understanding of their functions, was the aim of the work presented here for two protein interactions: PCNA/Mrell-Rad50 and MCM/XPD. For the first time in Pyrococcusfuriosus, we demonstrated both physical and functional interplay between PCNA, the replication maestro, and Mrell-Rad50, a complex involved in recombination process. For the second studied interaction, we used a biophysics approach based on fluorescent technics to characterise helicase activity of P.abyssi MCM. As several problems were encountered for XPD production, we did not characterise the helicase interaction. These two interactions are part of a more general context, where combined DNA replication and DNA repair processes could be important, especially for extremophile Archaea, Archaea which are amazing study models for understanding molecular processes ensuring genome integrity.

Orientador: Roberto Alves de Oliveira / Banca: Egenio Foresti / Banca: Maria Bernadete Amâncio Varesche / Banca: Wanderley José de Melo / Banca: Edson Aparecido Abdul Nour / Resumo: Neste trabalho avaliou-se o desempenho de sistema de tratamento combinado anaeróbio-aeróbio constituído por dois reatores anaeróbios de fluxo ascendente com manta de lodo (UASB), em série, em escala piloto (volumes de 510 e 209 L, respectivamente) seguidos de um reator em batelada seqüencial (RBS - volume de trabalho 210 L) aeróbio, tratando águas residuárias de suinocultura com concentrações médias de sólidos suspensos totais (SST) variando de 5 a 11 g L-1 e submetidos a tempos de detenção hidráulica (TDH) de 28 e 14 h no primeiro reator (R1), 11 e 6 h no segundo reator (R2) e de 58 e 26 h no RBS. As eficiências médias de remoção de DQO total e SST variaram de 54 a 90% e de 54 a 96%, respectivamente, no conjunto de reatores UASB em dois estágios (R1+R2), com carga orgânica volumétrica (COV) de 11 a 26 g DQO (L d)-1 no R1. A produção volumétrica máxima de metano de 1,613 m3 CH4 (m3 reator d)-1 ocorreu no R1, com COV de 19 g DQO (L d)-1 e TDH de 14 h. No RBS aeróbio, como pós-tratamento do efluente gerado nos reatores UASB, as eficiências médias de remoção foram 89%, 93%, 61%, 89% e 71% para a DQO total, SST, P-total, NTK e NT, respectivamente, com COV variando de 0,4 a 3,6 g DQO (L d)-1. Assim, no sistema de tratamento combinado anaeróbio-aeróbio (R1+R2+RBS), as eficiências médias de remoção da DQO total, SST, P-total, NTK e NT atingiram valores de 96 a 99%, 96 a 99%, 77 a 85%, 76 a 97% e 68 a 89%, respectivamente, e dos micronutrientes de 77 a 98%, 94 a 99%, 83 a 97% e de 62 a 99% para Fe, Zn, Cu e Mn, respectivamente, Para os coliformes termotolerantes, as eficiências de remoção médias foram de 93,80 a 99,99%, obtendo-se valores mínimos de 2,3 x 103 NMP/100 mL. A atividade metanogênica específica do lodo dos reatores UASB foi mais elevada quando se utilizou o propionato + butirato como fonte de substrato, e quando os reatores foram operados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work a combination between aerobic and anaerobic treatment systems constituted by two Upflow Anaerobic Sludge Reactor (UASB) in series, in a pilot scale (510 and 209 L volume each respectively) followed by a sequential batch reactor (SBR - 210L net volume) aerobic, treating swine residual water having from 5 to 11 g L-1 of Total Suspended Solids (TSS) and under a hydraulic detention timing (HDT) of 28 and 14 hours in the first reactor (R1), 11 and 6 hours in the second reactor (R2) and 58 and 26 hours in the Sequential Batch Reactor (RBS). The COD and TSS average efficiency varied from 54 to 90% and from 54 to 96% respectively in the UASB two stages (R1 and R2), in a volumetric organic load (VOL) varying from 11 to 26g COD (L d)-1 in the R1. The maximum methane volumetric production was 1.613 m3 CH4 (m3 reactor d)-1 in the R1, having a 19g COD (L d)-1 and an HDT of 14h. Using an aerobic SBR as an effluent pretreater that was generate in the UASB reactors, it was reached an average of removing efficiency of 89%, 93%, 61%, 89% and 71% to total COD, TSS, total P, TNK and TN, respectively, COD varying from 0.4 to 3.6 g COD (L d)-1. This way, in the anaerobic-aerobic combined system (R1 + R2 + RBS) the total COD, TSS, total P, TNK and TN, average removing reached values from 96 to 99%, 96 to 99%, 77 to 85%, 76 to 97% and 68 to 89%, respectively. To Fe, Zn, Cu and Mn the average efficiency was from 77 to 98%, 94 to 99%, 83 to 97% and 62 to 99%, respectively. To the thermotolerant coliforms the removal efficiency average was from 93.80 to 99.99% reaching the lower value of 2.3 x 103 MPN/100 mL. The sludge specific methanogenic activity in the UASB reactors was more elevated when was used the propionate + butyrate as substrate in conjunction with the operation of 28 HDT, 11h and TSS affluent around 5 g L-1, reaching 0.443 and 0.206 mmol CH4 (g SV h)-1 in the reactors R1 and R2, respectively. / Doutor

Neste trabalho foi realizada a caracterização microbiana anaeróbia de reatores anaeróbios diferenciais horizontais e em batelada, operados sob condições sulfetogênicas e mesofílicas (30ºC). Os reatores diferenciais foram preenchidos com diferentes materiais suportes (espuma de poliuretano, carvão vegetal, polietileno reciclado de baixa densidade e cerâmica porosa à base de alumina) visando a seleção do suporte adequado para otimização do processo sulfetogênico, para a relação DQO/sulfato de aproximadamente 0,67. Os reatores diferenciais foram alimentados diariamente com esgoto sintético, contendo aproximadamente 1000 mg/L de DQO e 1500 mg/L de sulfato, durante 28 dias de operação. A caracterização microbiana foi realizada através da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), microscopia óptica e eletrônica de varredura. Foram realizadas quantificações, em termos de porcentagens, de microrganismos pertencentes ao Domínio Bacteria (EUB338), Domínio Archaea (ARC915) e bactérias redutoras do íon sulfato (BRS) da subdivisão delta de Proteobacteria (SRB385). Nos reatores diferenciais, houve predomínio de bactérias em todos os suportes estudados. Os reatores diferenciais operados com espuma e carvão apresentaram maiores porcentagens de BRS, com valores iguais a 57,6% e 69,7%, respectivamente. A cerâmica foi o material que apresentou melhor equilíbrio de bactérias e arqueas metanogênicas, com 59,6% e 40,9%, respectivamente. Os reatores em batelada foram operados com espuma de poliuretano e carvão vegetal com relação DQO/sulfato de aproximadamente 3. As porcentagens de BRS quantificadas pelo FISH foram iguais a 65,3% e 69,1% para espuma e carvão, respectivamente. Em ambos os reatores o carvão vegetal foi o material mais favorável à sulfetogênese. / This research reports an anaerobic microbial characterization of both, a horizontal differential anaerobic and a batch reactors, operated at sulfidogenic and mesofilic conditions at 30ºC. The differential reactors were filled with four support materials (polyurethane foam, vegetable coal, recycled polyethylene of low density and alumin based porous ceramic) aiming the selection of a more appropriated support for optimization of sulfidogenic processes (ratio COD/sulfate of approximately 0.67). Differential reactors were fed daily with synthetic sewage, containing approximately 1000 mg/L of COD and 1500 mg/L of sulfate concentrations, during 28 days of operation. Microbial characterization was accomplished using fluorescent in situ hybridization (FISH), optic and scanning electronic microscopy. It was realized a quantification, in percentages, of microorganisms belong to Bacteria Domain (EUB338), Archaea Domain (ARC915) and sulfate-reducing bacteria (SRB) of delta subdivision Proteobacteria (SRB385). Differential reactors have shown predominance of bacteria in all the support materials studied. Differential reactors operated with foam and coal presented the greatest percentages of SRB, with values equal to 57.6% and 69.7%, respectively. The ceramic was the material that presented the best equilibrium of bacteria and methanogenic archaea, with 59.6% and 40.9%, respectively. Batch reactors were operated with polyurethane foam and vegetable coal with COD/sulfate ratio of approximately 3. Percentages of SRB quantified by FISH were equals to 65.3% and 69.1% for foam and coal, respectively. In both reactors the vegetable coal have shown to be the most favorable material to sulfidogenesis.

Dans les trois domaines du vivant, que constituent les bactéries, les eucaryotes et les archées, une molécule a la capacité souveraine de gouverner la vie, la mère à l’origine de tous les mécanismes biologiques, l’ADN. S’il est évident de dire que le maintien de l’intégrité des génomes est essentiel à la vie, il existe deux systèmes qui le permettent, la réplication et la réparation de l’ADN. La fidélité de ces derniers est finement influencée par la disponibilité (ratio et balance) des précurseurs nucléotidiques désoxyribonucléotides (dNTPs) et ribonucléotides (rNTPs) au cours du cycle cellulaire. Même si la concentration intracellulaire en nucléotides est largement documentée chez les eucaryotes et les bactéries, ça n’est malheureusement pas le cas chez les archées. En ce qui concerne l’étude de la maintenance génomique, un groupe d’archées a intéressé les chercheurs de par leurs capacités à survivre dans des milieux dits extrêmes. Pyrococcus abyssi est l’une d’entre elles qui depuis de nombreuses années sert de modèle biologique pour répondre aux questions de la stabilité de l’ADN à haute température. Cette étude est centrée sur cette thématique et particulièrement sur les caractéristiques fonctionnelles des ADN polymérases: PolD, PolB et le complexe p41/p46. Initialement, le contenu en nucléotides a été évalué dans des cellules en phase exponentielle de croissance par la technique de chromatographie couplée à une double détection en spectrométrie de masse (zicHILIC-MS-MS). Les résultats montrent que le contenu en rNTPs est de 20 fois supérieur à celui en dNTPs. Pour cette raison, la discrimination sélective des dNTPs par les ADN polymérases est mise à l’épreuve. Même si, des mécanismes permettent d’exclure les rNMPs durant la synthèse de l’ADN, de récentes études ont montrées que des rNMPs étaient incorporés par des ADN pols. Ainsi, le ratio en nucléotides obtenu a été utilisé pour l’analyse de son effet sur la synthèse d’ADN par les ADN Pols et les extraits cellulaires de P. abyssi. Les résultats démontrent clairement que les rNMPs sont incorporés par l’ADN polymérase PolD. Puis, les conséquences de la présence des rNMPs dans l’ADN sur la réplication ont été étudiées et ont mis en évidence que les extraits cellulaires, tout comme les ADN Pols de P. abyssi étaient capables de « passer » un rNMP présent dans l’ADN. Pour finir, une étude de l’incorporation préférentielle de chaque dNMP et rNMP a été menée démontrant que la complémentarité des bases était respectée même lors de l’incorporation de rNMPs. Enfin, la caractérisation de la petite sous-unité, DP1, de PolD a permis de montrer sa capacité à retirer des rNMPs grâce à son activité de relecture, suggérant un premier rempart à la présence de rNMPs dans l’ADN. Pour conclure, ces résultats montrent que la présence de rNMPs dans l’ADN est un phénomène conservé dans les trois domaines du vivant. / In the three domains of life that include Bacteria, Eukarya and Archaea, one molecule has the sovereign ability to govern life, and not the least one, the mother of all biological mechanisms, DNA. Maintaining the integrity of genomes is obviously essential for life, and faithful DNA replication and repair are the guarantees. The fidelity of these two processes may vary depending on the availability and levels (balance and ratio) of deoxyribonucleotides (dNTPs) and ribonucleotides (rNTPs) during the cell-cycle. Even if intracellular concentration of nucleotides is largely documented in Eukarya and Bacteria, it remains limited in Archaea. From many years one group of Archaea is of great interest for studying genomic maintenance, because of its ability to survive in extremes environments. Pyrococcus abyssi is one of them that is used as biological model for deciphering the stability of DNA at elevated temperature in LM2E. The present work focuses on genomic integrity and particularly on the functional characterization of the three DNA polymerases: PolD, PolB and the p41/p46 complex. Initially, the nucleotide pool has been evaluated in exponentially growing cells using the highly sensitive method that combined chromatography and mass spectrometry (zicHILIC-MS-MS). The results show that rNTPs content is 20-fold higher than dNTPs. For that reason, fidelities of DNA polymerases are challenged to select the correct dNTP over the most abundant rNTP during DNA synthesis. Despite the fact that some mechanisms allow the exclusion of rNTPs from entry to the Pol active site, recent findings indicate that ribonucleotides are incorporated by different DNA Pols with surprisingly high frequency. In this work, the obtained intracellular balance and ratio of rNTPs and dNTP have been used to analyze their effect on DNA synthesis by P. abyssi DNA Pols and cell-free extracts. Our results clearly demonstrate that rNTP incorporation is detectable with distinct efficiencies among DNA pols. Secondly, the consequences of the presence of rNMPs in a DNA template on DNA polymerisation has been examined and highlights that cell-free extracts are able to bypass a single rNMP as well as replicative DNA polymerases. To strengthen that study, single nucleotide incorporation opposite rNMP or dNMP has been carried out and the results demonstrate that replicative Pyrococcus abyssi DNA Pols can basepair the complementary rNTPs opposite dNMPs, and vice-versa, the complementary dNTPs opposite rNMPs.Furthermore, the preliminary results obtained about the nucleolysis activities of the PolD small subunit, DP1, show that the DNA polymerase D is able to remove rNMPs from a DNA strand, suggesting a first level of protection against ribonucleotide contamination of DNA. Definitely, these data indicate that the presence of transient embedded rNMPs in genomic DNA represents a universally conserved phenomenon across Archaea, Bacteria and Eukarya.

Dans les vasières intertidales dominées par les diatomées, la production primaire est particulièrement forte à marée basse. Ce microphytobenthos peut être limité par les nutriments azotés en lien avec les communautés de procaryotes impliquées dans le cycle de l’azote. Ainsi, ce travail de thèse cherche, via une approche écologique, à décrire le rôle des communautés de procaryotes benthiques notamment liées au cycle de l’azote et ce, suivant différentes échelles temporelles liées aux cycles du microphytobenthos. Des échantillons de sédiment ont été prélevés dans la baie de Marennes-Oléron (Côte Atlantique, France) entre 0 et 10 cm de profondeur suivant 5 couches (0-0,5 cm, 0,5-1 cm, 1-2 cm, 2-5 cm, 5-10 cm). Différents facteurs biotiques et abiotiques ont été mesurés et mis en relation avec la production bactérienne, les activités enzymatiques et les gènes fonctionnels liés au cycle de l’azote (impliqués dans la nitrification, la dénitrification et l’anammox). De plus, la diversité bactérienne et archéenne a été évaluée par pyroséquençage 454 afin de caractériser les communautés et leurs dynamiques en lien avec les facteurs forçants biotiques et abiotiques. Dans le but d’évaluer l’influence des paramètres abiotiques et de la production du microphytobenthos, des mesures in situ ont été couplées avec des mesures en conditions semi-contrôlées. / In diatoms-dominated intertidal mudflats, at low tide the primary production is particularly high and microphytobenthos that can be limited by nitrogen-related nutrients is linked with N-related prokaryotic communities. Thus, this PhD thesis aim at describing by ecological approach, the role of benthic prokaryotic communities especially N-related ones, at various temporal scales linked to microphytobenthos life cycles. Sediment samples from Marennes-Oleron mudflat (Atlantic coast, France) were collected according to 5 layers : 0-0.5 cm, 0.5-1 cm, 1-2 cm, 2-5 cm and 5 to 10 cm below sediment surface (bsf). Various biotic (i.e. chlorophyll a) and abiotic parameters (i.e. nutrients, exopolymeric substances, water content, salinity, pH, temperature…) were recorded and linked with benthic bacterial production, enzymatic activities and N-related functional genes (i.e. implied in nitrification, denitrification, and anammox). Furthermore, the bacterial and archaeal diversity was assessed by 454 pyrosequencing in order to characterize the communities and shift in link with biotic and abiotic drivers. Aiming at evaluating the influence of abiotic parameters and microphytobenthic activities on the prokaryotic communities, in situ measurements were coupled to a semi-controlled approach.

Les virus infectant les archées présentent des morphotypes inhabituels et des génomes extrêmement divers. Leur isolation a permis de développer nos connaissances sur la diversité de la virosphère et demeure une piste de recherche primordiale. Durant ma thèse, j’ai isolé et caractérisé de nouveaux virus d'archées et étudié les interactions virus-hôte dans un système modèle bien établi. Des cultures d'enrichissement et des analyses bioinformatiques nous ont permis de décrire de nouveaux virus de crénarchées hyperthermophiles infectant les espèces du genre Pyrobaculum et ainsi de mieux comprendre la diversité architecturale des virus filamenteux. De plus, un provirus a été identifié chez P. oguniense et l’étude de sa réplication a révélé par microscopie électronique des nanostructures pyramidales à la surface des cellules ressemblant à des structures connues de sortie des virions chez des virus de crénarchées. Deux études de protéomique nous ont fourni un aperçu de la dynamique du protéome de Sulfolobus islandicus : l’analyse du protéome de cellules de S. islandicus non infectées a révélé de nombreuses modifications post-traductionnelles, et l’analyse de la régulation des protéines dans des cellules de S. islandicus infectées par le virus SIRV2 a révélé 136 protéines de l'hôte présentant une régulation temporelle significative. L’analyse structurale de SIRV2 a permis d'étudier la résistance des virus crénarchées à des conditions extrêmes et a révélé pour la première fois que la forme A de l'ADN est biologiquement pertinente. Ces résultats ont contribué au développement des connaissances sur la diversité de la virosphère et sur l'évolution des virus d'archées. / Viruses infecting Archaea display unusual morphotypes and highly diverse genomes. Several virus-host systems have emerged enabling the detailed characterization of virus-host interplay in archaea. However, isolation of new archaeal viruses proved to be instrumental for expanding the knowledge on the diversity of the Earth’s virosphere. Therefore, I have focused on two major lines of research: isolation of new archaeal viruses and characterization of the virus-host interactions in a well-established model system. A new Pyrobaculum virus with a unique architecture among DNA viruses was described, expanding our knowledge on the diversity of architectural solutions explored by filamentous viruses. Furthermore, attempts to trigger the replication of a provirus in P. oguninese led to the development of six-fold pyramidal nanostructures on the cell surface, resembling known virion egress structures of archeal viruses. Finally, I focused on the interplay between Sulfolobus islandicus and the rod-shaped virus SIRV2. Two proteomic studies yielded insights into the dynamics and posttranslational modifications (PTMs) of the Sulfolobus proteome. Sulfolobus proteins were found to carry a high degree of PTMs on functionally diverse proteins. The global analysis of the regulation of viral and host proteins in SIRV2-infected S. islandicus cells yielded insights the temporal regulation of host and virus proteins. Structural studies on SIRV2 virion have resulted in the first ever description of A-form DNA being a biologically relevant form of DNA. Together, these results contribute to the knowledge on the diversity of the extant virosphere, and the biology and evolution of archaeal viruses.

Haloferax volcanii est une archée appartenant au phylum euryarchaeota et à la classe des Halobacteriales. Les mécanismes liés à la réplication et à la réparation chez les archées sont très similaires à ceux rencontrés chez les eucaryotes, faisant d’H. volcanii un des organismes modèle pour l’étude de la réplication et de la biologie des archées, notamment car de nombreux outils génétiques sont disponibles chez cet organisme. De plus, H. volcanii possède la particularité de pouvoir avoir toutes ses origines de réplication supprimées, soulevant beaucoup de questions sur les mécanismes impliqués. Plusieurs hypothèses ont été émises sur la façon dont cette souche initie sa réplication, basées soit sur la dérivation des mécanismes liés à la réparation de l’ADN, soit sur un mécanisme d’initiation de la réplication indépendant des origines. Afin d’étudier ces mécanismes liés à la réplication, j’ai construit une souche d’H. volcanii capable d’incorporer des analogues de la thymidine dans l’ADN lors de sa synthèse grâce à la délétion de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la thymidine. Des temps de cultures courts de la souche en présence d’un analogue permet son incorporation au niveau des zones actives de réplication pour marquer spécifiquement l’ADN néosynthétisé. L’immunodétection de l’analogue incorporé à l’ADN, en travaillant en cellule entière avec un microscope à fluorescence, permet la localisation de l’ADN néosynthétisé, reflétant ainsi les régions où la réplication est active. Ces analyses révèlent majoritairement 2 à 3 régions de réplication actives dans des cellules en prolifération, sans localisation particulière. Ces régions ont déjà été observées en étudiant la localisation d’une protéine clé de la réplication (RPA2) fusionnée à la protéine verte fluorescente GFP, confirmant sa localisation aux zones actives de réplication. Une étonnante variabilité observée d’une cellule à l’autre et suggère une initiation probabiliste de la réplication. Il est également étonnant de n’observer qu’aussi peu de zones actives de réplication, comparé au fort taux de polyploïdie de cette souche. Se pose alors la question de ce à quoi correspondent ces zones de réplication. Pour cela, j’ai développé chez H. volcanii la technique de peignage moléculaire permettant d’isoler des molécules individuelles d’ADN et révéler spécifiquement les analogues incorporés pour pouvoir déterminer le nombre de copies du chromosome qui sont actives lors de la réplication, ainsi que le nombre d’origines actives sur chacune des copies. J’ai également développé une technique de Time-lapse dans le but de suivre ces régions au cours du temps en observant les divisions cellulaires directement sous le microscope. / Haloferax volcanii is an archaea belonging to the phylum euryarchaeota and the class Halobacteriales. The mechanisms related to replication and repair in archaea are very similar to those found in eukaryotes, making H. volcanii a relevant model organisms for the study of replication and archaeal biology, especially since many genetic tools are available. Interestingly, all replication origins can be removed from the chromosome of H. volcanii, raising many questions about the mechanisms involved. Several hypotheses have been proposed on how this strain initiates its replication, either relying on recombination-dependent replication initiation or an origin-independent mechanism. In order to study these replication-related mechanisms, I have constructed a strain of H. volcanii able to incorporate thymidine analogues into DNA during its synthesis by deleting genes involved in the thymidine biosynthesis pathway. A short-time cultures of the strain in the presence of an analogue allows its incorporation in nascent DNA. By immunodetection of the analog coupled to fluorescence microscopy observation of whole cells, it is possible to investigate the localization of neosynthesized DNA,which reflect the regions where replication is active. These analyses revealed mainly 2 to 3 active replication regions per cell, without any particular location. These regions had already been observed by studying the localization of a key replication protein (RPA2) fused to the fluorescent green protein GFP, confirming its location in active replication areas. A surprising variability in the number of replication foci from one cell to another was observed, suggesting a probabilistic initiation of replication. It is also surprising to observe so few active replication areas compared to the high polyploidy of this strain. This raises the question of what these replication areas correspond to. For further understanding, I developed for H. volcanii molecular combing, to isolate individual DNA molecules and specifically reveal incorporated analogues to determine the number of copies of the chromosome that are being replicated, as well as the number of active origins on each of the copies. I have also developed time-lapse approach to track these regions over time by monitoring cell proliferation directly under the microscope.

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