Inaug.-Diss.: Rechts- und staatswissenschaftliche Fakultät: Zürich: 1976. _ Bibliogr. p. VIII-XIV. Index.

Thèse (M.A.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. [90]-94. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Bibliogr.: f. 195-211. Publié aussi en version électronique.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le transporteur MRP2 est connu comme étant la seule pompe qui occupe une position apicale au sein des cellules polarisées, elle est responsable du transport des anions organiques et des drogues, le mécanisme de transport de ces substrats était le sujet de recherche de plusieurs études, et dans ce travail nous étions capable de dévoiler l'importance des acides aminés chargés négativement (D333, D427, D433, D496, E532, D575) situés dans ou prés des hélices transmembranaires TM6, TM8, TM9, TM10 et TM11 de la protéine, ces derniers jouent des rôles cruciales dans l'activité de transport et dans le maintien de la structure fonctionnelle de MRP2.

Titre de l'écran-titre (visionné le 13 décembre 2023) / Dans le domaine de la résistance aux antifongiques, il est important de comprendre la dynamique entre l'épistasie et les trajectoires évolutives afin de pouvoir prédire comment les pathogènes fongiques évoluent pour résister à ces traitements. Dans ce projet, nous avons voulu comprendre le lien entre épistasie au niveau des protéines et les mutations du gène FCY1 qui conduisent à la résistance à l'antifongique 5-fluorocytosine (5-FC). Nous avons utilisé le Deep Mutational Scanning pour systématiquement générer tous les variants de codons possibles à certaines positions du gène FCY1 de cinq champignons. Cette librairie de mutants a été criblée contre le 5-FC afin d'identifier les mutations qui conduisent à sa résistance ou qui maintiennent sa sensibilité. En comparant le phénotype lié à chaque mutation dans chaque orthologue de FCY1, nous avons pu identifier des mutations épistatiques : des mutations qui ont des effets différents entre les orthologues. En général, un faible pourcentage des mutations créées étaient des mutations épistatiques. De plus, plus deux orthologues divergent sur le plan évolutif, plus il y a de mutations épistatiques. Nous avons également observé des liens inattendus entre la divergence des orthologues de FCY1 et l'effet sur le fitness des mutations épistatiques. Des travaux comme les nôtres peuvent contribuer à orienter les futurs modèles de prédiction de la résistance en étoffant les bases de données de mutations causant la résistance et en nous informant sur le taux de confiance de l'effet d'une mutation dans un pathogène. / In the field of antifungal resistance, understanding the dynamics between epistasis and evolutionary trajectories is of importance to predict how fungal pathogens evolve to resist antifungals. In this project, we wanted to understand how epistasis at the protein level influences which mutations in the FCY1 gene lead to resistance to the antifungal 5- fluorocytosine (5-FC). We used Deep Mutational Scanning to systematically generate all possible codon variants at specific positions in the FCY1 gene of five fungi. This library of mutants was screened against 5-FC to identify which mutations lead to its resistance or maintained sensitivity. By comparing the phenotype related to each mutation in each FCY1 ortholog, we identified epistatic mutations: mutations that have different effects between orthologs. In general, a low percentage of mutations created were epistatic mutations. In addition, the more two orthologs diverge evolutionary, the more epistatic mutations there are. We also observed unexpected links between divergence of the FCY1 orthologs and the patterns of fitness effects of epistatic mutations. Work like ours can help guide future prediction models by making databases more robust and by informing us about the confidence rate of the effect of a mutation in a pathogen.

Les virus influenza A et B sont les agents étiologiques des infections grippales saisonnières. Ils sont à l'origine d'infections sévères qui peuvent requérir des mesures d'interventions thérapeutiques. Le baloxavir est le dernier agent antiviral approuvé pour le traitement de l'influenza. Il cible l'activité endonucléase de la polymérase acide (PA), une des sous-unités du complexe de l'ARN polymérase virale. Alors que le baloxavir s'est montré plus efficace dans la réduction de l'excrétion virale que l'oseltamivir, qui est le traitement standard de la grippe, il a néanmoins démontré une faible barrière de résistance. Les phases d'étude cliniques du baloxavir ont montré que l'émergence de la résistance au baloxavir était principalement médiée par des substitutions au codon 38 (I38T/S/M) de la protéine PA chez les virus influenza A. La résistance reste encore peu documentée dans le cas des virus influenza B. Ce projet de recherche vise à générer et à caractériser la résistance au baloxavir *in vitro*, *ex vivo* et *in vivo* chez des virus influenza B contemporains représentant les deux lignées principales B/Yamagata/16/1988 et B/Victoria/2/1987. Dans le but d'induire la résistance au baloxavir, les virus B/Phuket/2073/2013 (Yamagata) et B/Quebec/MCV-11/2019 (Victoria) ont subi des passages successifs sur cellules MDCK-ST6-Gal1 en présence de concentrations croissantes de baloxavir. A des passages séctionnés, le gène codant pour PA a été séquencé pour identifier d'éventuelles mutations associées à la résistance. Le phénotype de résistance au baloxavir a été évalué par le test de réduction des plaques (CI50). Un système de génétique inverse a été mis au point pour la souche vaccinale contemporaine B/Washington/02/2019 (Victoria) pour confirmer l'effet des mutations de résistance identifiées. Dans un second temps, des virus recombinants B/Washington/02/2019 et B/Phuket/2073/2013 ont été utilisés pour évaluer les capacités réplicatives des virus sauvages et de leurs mutants PA-I38T respectifs, *in vitro*, sur des lignées cellulaires de poumons humains (A549 et Calu-3), puis *ex vivo* en utilisant un modèle d'épithélium nasal humain (MucilAir®). L'infectivité a été mesurée en titrant les lavages nasaux de cobayes infectés avec les différents virus. Chez la souche B/Quebec/MCV-11/2019, la mutation PA-I38T a été générée après 6 passages en présence d''une concentration finale de baloxavir de 200 nM. Les capacités réplicatives *in vitro*, *ex vivo* et *in vivo* ont montré que la mutation PA-I38T n'impacte pas le fitness viral de manière significative chez les virus influenza B à l'étude. Ces résultats démontrent une similitude des mécanismes de résistance au baloxavir chez les virus influenza A et B. L'absence d'effet délétère sur la réplication et le fitness viral relativement préservé des mutants arborant la substitution PA-I38T met en garde contre d'éventuelles éclosions de tels variants, ainsi qu'un risque de dissémination dans la population générale. Il est donc nécessaire de surveiller activement sa présence en clinique. / Influenza A and B viruses are the causative agents of seasonal flu infections, often leading to severe illnesses and necessitating therapeutic interventions. Baloxavir is the latest antiviral agent approved for influenza treatment. It targets the endonuclease activity of the polymerase acidic (PA) protein, one of the subunits of the viral RNA polymerase complex. While Baloxavir has demonstrated greater efficacy in reducing viral shedding than oseltamivir, the standard flu treatment, it has shown a low resistance barrier. Clinical trials have revealed that resistance to Baloxavir primarily arises through substitutions at codon 38 (I38T/S/M) of the PA protein in Influenza A viruses. Resistance in Influenza B viruses remains poorly documented. This research project aims to generate and characterize Baloxavir resistance *in vitro*, *ex vivo*, and *in vivo* in contemporary Influenza B viruses of both B/Yamagata/16/1988-like and B/Victoria/2/1987-like lineages. To induce Baloxavir resistance, B/Phuket/2073/2013 (Yamagata) and B/Quebec/MCV-11/2019 (Victoria) viruses underwent serial passages on MDCK-ST6-Gal1 cells in the presence of increasing Baloxavir concentrations. At selected passages, the PA gene was sequenced to identify potential resistance-associated mutations. The resistance phenotype was assessed by plaque reduction assays (IC50). A reverse-genetics system was developed for the B/Washington/02/2019 vaccine strain (Victoria) to confirm the effect of identified resistance mutations. Subsequently, recombinant viruses of recent B/Washington/02/2019 and B/Phuket/2073/2013 strains were used to evaluate the replicative abilities of wild-type and their respective PA-I38T mutant viruses in vitro using human lung cell lines (A549 and Calu-3) and *ex vivo* using a human nasal epithelium model (MucilAir®). Infectivity was measured by titrating nasal washes from experimentally-infected guinea pigs. In the B/Quebec/MCV-11/2019 strain, the PA-I38T mutation was generated after 6 passages in the presence of 200 nM Baloxavir. Replicative abilities in vitro, ex vivo, and in vivo showed that the PA-I38T mutation does not significantly impact the viral fitness of the studied Influenza B viruses. These results demonstrate similarity in Baloxavir resistance mechanisms between influenza A and B viruses. The lack of deleterious effects on viral replication and the relatively preserved fitness of the PA-I38T mutation raise concerns about potential outbreaks of such variants and their dissemination in the general population. Hence, active surveillance of its presence in clinical settings is essential.

Dans ce mémoire, les capacités réplicatives de virus saisonniers de sous-types N H1N1 et A/H3N2 résistants à l'oseltamivir ont été étudiées au moyen d'expériences in vitro simples et de modélisation mathématique. Pour la souche A/Brisbane/ 59/2007 (H1N1) nous avons démontré que la mutation H274Y de la neuraminidase (NA), responsable de la majorité des cas de résistance à l'oseltamivir, cause une augmentation de la latence d'environ 7 h comparé à seulement 1 à 3 h pour le virus sauvage. Cette latence augmentée est compensée par une infectivité augmentée d'environ 12 fois par rapport au virus sauvage. Ces résultats, obtenus à l'aide d'un modèle mathématique, fournissent une explication sur la dissémination de la mutation H274Y dans les souches saisonnières de virus A/ H1N1 depuis 2007-2008. Nous avons aussi étudié les capacités réplicatives in vitro pour des souches A/California/7/2004 (H3N2) résistantes à l'oseltamivir isolées d'un patient immunosupprimé. La perte de capacité réplicative causée par le simple mutant E119V est partiellement compensée chez le double mutant E119V-I222V La croissance du double mutant E119V-I222V en milieu liquide est similaire à celle du virus sauvage alors que le simple mutant accuse un retard de croissance d'environ 12 h. Les tailles des plages de lyses en milieu semi-solide sont systématiquement plus petites pour le simple mutant E119V et plus grosses pour le double mutant E119V-I222V L'effet cytopathique commence entre 24 et 36 h pour le virus sauvage et le double mutant mais seulement à 48 h pour le simple mutant. Finalement, l'activité enzymatique de la NA du double mutant (ratio Vmax : 0,51 par rapport à la souche sauvage) est augmentée de 47% comparé à celle du simple mutant (ratio Vmax : 0,04).

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.