Introduction: L'apoptose est un mécanisme étroitement contrôlé qui répond à des besoins particuliers de l'organisme et permet une élimination physiologique des cellules excessives ou endommagées. Elle est donc nécessaire au développement et au maintien du bon fonctionnement de tout organisme vivant puisqu'elle joue un rôle important dans l'embryogenèse, dans les changements morphologiques, dans l'homéostasie cellulaire, dans l'atrophie et la réparation des tissus et dans la régression des tumeurs. Cette forme de mort cellulaire fait intervenir une famille de sérines protéases connues sous le nom de caspases. Leur activation survient après stimulation des cellules par différents facteurs comme des signaux physico-chimiques (UV, rayons gamma), la privation en facteurs de croissance ou une grande variété des molécules chimiques comme les polluants environnementaux et les médicaments anti-cancéreux. Parmi ces derniers on cite l'Adriamycine qui est un médicament anti-tumoral efficace, cependant son utilisation entraîne malheureusement de sévères altérations du fonctionnement cardiaque. Ceci limite par conséquent les doses pouvant être données sans danger aux patients cancéreux. D'autre part l'utilisation clinique de ce médicament semble être également limitée par la résistance que développent certaines formes de tumeurs à la chimiothérapie. Pour surmonter ces deux limites les chercheurs ont essayé de développer certaines stratégies thérapeutiques comme l'hyperthermie, visant à sensibiliser la tumeur aux faibles concentrations des médicaments. Objectifs: La présente étude permettra d'étudier le mécanisme de mort cellulaire induite par l'Adriamycine et l'hyperthermie. Les deux principaux piliers de ce projet sont: (1) Déterminer si l'Adriamycine ou l'hyperthermie utilisées séparément peuvent déclencher l'apoptose chez des cellules tumorales du col utérin humain (HeLa) et chez la même lignée exprimant la protéine de résistance aux médicaments MDR (HeLa MRP). (2) Déterminer si l'hyperthermie pourrait sensibiliser les cellules à l'action de l'Adriamycine. Résultats : L'Adriamycine ou l'hyperthermie utilisés séparément ou combiné avait comme effet une activation de la caspase initiatrice (9) et de la caspase effectrice (3) ainsi qu'un clivage de l'inhibiteur du facteur de fragmentation d'ADN activé par les caspases (ICAD). D'un autre coté l'hyperthermie a causé l'accumulation intracellulaire de l'Adriamycine, la diminution du potentiel membranaire mitochondriale due à une translocation du Bax vers la mitochondrie suivi d'un relarguage du cytochrome c vers le cytosol. Conclusion: L'hyperthermie seule pourrait induire l'apoptose et pourrait servir comme une stratégie utile pour augmenter l'effet pro-apoptotique de l'Adriamycine chez des cellules HeLa parentales ou résistantes aux médicaments (HeLa MRP). ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hyperthermie, Résistance pléiotropique, MRPl, Apoptose, Adriamycine.

La P-glycoprotéine est une protéine transmembranaire qui agit comme une pompe à efflux et expulse activement hors de la cellule une grande variété de molécules hydrophobes, c'est à dire la majorité des médicaments. De par sa fonction de transport des médicaments et de ses localisations anatomiques stratégiques, la P-glycoprotéine est en partie responsable des échecs aux traitements chimiothérapeutiques, limite la biodisponibilité des médicaments tout en favorisant une résistance multiple à différents types de médicaments. Le premier volet de cette étude fût d'évaluer les capacités inhibitrices des activités de la P-glycoprotéine par six composés végétaux de la famille des coumarins. Seul le cnidiadin inhibe l'activité de transport de la P-glycoprotéine en augmentant l'accumulation intracellulaire des substrats de la P-glycoprotéine et en diminuant synergiquement la survie cellulaire en présence de vinblastine. De plus, le cnidiadin, semble pouvoir modifier la biodisponibilité des substrats de la P-glycoprotéine en inhibant compétitivement la liaison du substrat diazirine-cyclosporine A. Ces résultats suggèrent qu'une diète contenant du cnidiadin pourrait soit renverser le phénotype de résistance multiple aux médicaments, soit moduler la biodisponibilité des substrats de la P-glycoprotéine, en tant qu'agent chimiosensibilisant. Autres que les agents chimiosensibilisants, nous avons aussi exploré l'impact du niveau d'interaction entre la P-glycoprotéine et la protéine structurale des cavéoles, la cavéoline-l, sur les activités associées à la P-glycoprotéine. Pour ce faire, des mutants de la P-glycoprotéine humaine à son motif de liaison à la cavéoline-l furent utilisés. Nous avons montré antérieurement que l'interaction entre la cavéoline-l et les P-glycoprotéines mutantes à leur motif de liaison à la cavéoline-l est réduite d'environ 40%. Nous avons donc approfondi l'étude et lors d'essais d'activités de liaison et de transport de substrat des P-glycoprotéines mutantes, nous avons mesuré une augmentation de ces activités ainsi qu'une résistance cellulaire significativement supérieure. En conséquence, la cavéoline-l semble contrôler négativement les activités de liaison et de transport de la P-glycoprotéine. Une variation de l'interaction entre la P-glycoprotéine et la cavéoline-l pourrait être un mécanisme utilisé par la cellule pour contrôler ce transporteur cellulaire et lors d'exposition à différents agents cytotoxiques, ce même mécanisme pourrait être impliqué dans le développement de la résistance multiple aux médicaments. En résumé, les principales contributions de cette étude sur la P-glycoprotéine sont 1) inhibition des activités de la P-glycoprotéine par le cnidiadin, particulièrement son activité de liaison au substrat 2) régulation négative des activités de liaison et de transport de la P-glycoprotéine par la cavéoline-l et 3) augmentation de la résistance cellulaire suite à une diminution du niveau d'interaction entre la P-glycoprotéine et la cavéoline-l. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : P-glycoprotéine, Résistance multiple aux médicaments, Agents réversants naturels, Interaction P-glycoprotéine/cavéoline-1, Liaison et transport des substrats.

Le phénomène de multirésistance aux médicaments laisse les patients atteints de cancer avec un pronostic défavorable et leurs options de traitement sont limitées. Par conséquent, des intérêts croissants dans la recherche de nouveaux composés antitumoraux ou d'autres stratégies pour combattre la multirésistance se sont manifestés. La microscopie électrochimique à balayage (SECM) est dans ce domaine une candidate prometteuse pour l'étude de cellules vivantes. Cette méthode emploie des électrodes nanométriques qui peuvent être utilisées pour détecter des métabolites dans les études portant sur une cellule unique. Le présent travail montre l'influence du ferrocèneméthanol (FcCH2OH) sur deux lignées différentes de cellules humaines cancéreuses du col utérin. Le potentiel de la microscopie électrochimique à balayage biologique (Bio-SECM) est démontré par le fait que la réponse différentielle au FcCH2OH des cellules résistantes aux médicaments provient en partie de l'efflux non spécifique d'une protéine associée cette résistance, la MRP1. Le lien nouvellement établi entre FcCH2OH / [FcCH2OH]+, GSH / GSSG et la multirésistance dans les cellules cancéreuses humaines pourrait avoir un impact sur de futures applications qui nécessitent une évaluation adéquate de la réponse métabolique à des médicaments anticancéreux chez les cellules résistantes à la chimiothérapie. Pour améliorer les futures études de Bio-SECM sur les cellules, une nouvelle procédure d'adhésion cellulaire est établie. Grâce à des membranes élastomériques comprenant des pores à des endroits précis, il est possible de créer des motifs contenant un seul type de cellules, ainsi que de co-cultures. En outre, la technique de Bio-SECM est améliorée par l'introduction d'un mode particulier de balayage de la sonde. Ce mode, appelé distance constante, permet de découpler les informations sur la topographie et sur la réactivité. Le travail présenté est une première étape importante vers l'établissement d'un indicateur quantifiant les activités reliées à la résistance aux médicaments des cellules. Cela pourrait être utilisé tout au long de la vie des cellules et sur différentes lignées, ce qui permettrait de faire un dépistage de médicaments ciblés. Cela améliorerait l'analyse actuelle du cancer, ce qui conduirait finalement à avoir un meilleur traitement chimiothérapeutique. La présente thèse est structurée en trois chapitres, dont deux ont le format d'un manuscrit d'un article scientifique. Le premier chapitre se concentre sur l'utilisation de la microscopie électrochimique à balayage (SECM) pour étudier les cellules vivantes. Grâce à cette technique, les auteurs abordent le phénomène de multirésistance chez les cellules cancéreuses humaines et son impact sur la recherche médicale future. Une nouvelle procédure de structuration de l'adhésion cellulaire sur des motifs définis est présentée dans le chapitre deux de cette thèse. Elle vise à améliorer les conditions de travail pendant les études de Bio-SECM. Le dernier chapitre décrit les perspectives et les objectifs à long terme à atteindre au cours qu’offre ce travail. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Microscopie, Électrochimique à balayage, Multirésistance aux médicaments, Formation de motif cellulaire, Imagerie électrochimique, Cancer

La résistance pléïotropique aux médicaments est l'un des obstacles majeurs limitant l'utilisation de la chimiothérapie comme possibilité thérapeutique anticancéreuse. Bien que non totalement élucidé, ce phénomène de résistance observé a été associé à la surexpression d'une protéine de 170kDa, appartenant à la classe des protéines de transport ABC, ATP dépendante. Il a été démontré que les cellules surexprimant la MDR développent également un phénomène de résistance à l'induction de l'apoptose rendant ainsi les essais de sensibilisation des cellules résistantes aux médicaments et les recherches menées pour cette fin très avantageux et louables pour la thérapie anti-cancer. Dans la présente étude nous avons investigué la possibilité de l'induction de l'apoptose chez des cellules de l'ovaire de hamster chinois surexprimants la protéine MDR (CHO MDR CHRC5) et des cellules parentales ne développant pas la résistance pléïotropique aux médicaments (CHO AuxB1) par le choc thermique. Pour mieux comprendre ce phénomène de résistance, nous nous sommes intéressé en particulier, à la voie du récepteur de mort Fas et à la voie intrinsèque médiée par la mitochondrie. Nos résultats montrent que le choc thermique (40-43°C) active les caspases initiatrices 9 et 8 ainsi que les caspases effectrices 3, et 7. Contrairement aux cellules AuxB1, les cellules CHRC5 exhibent une résistance à l'induction de la voie du récepteur de mort Fas par le choc thermique. La voie intrinsèque, quant à elle, est induite pareillement chez les deux lignées cellulaires. De plus, la translocation de Bax et du Bid tronqué (tBid) à la mitochondrie était responsable de la perméabilisation de la membrane mitochondriale et par conséquent la libération du cytochrome c et l'activation des caspases 9 et 3 chez les deux lignées cellulaires. Le clivage des substrats de la caspase 3 (ICAD et PARP) était similaire chez les deux modèles cellulaires, suggérant que les cellules MDR CHRC5 sont non résistantes au choc thermique. Toutefois, cette étude est la première à investiguer les mécanismes moléculaires de l'apoptose induite par le choc thermique chez des cellules surexprimants la protéine MDR et à conjecturer le rôle de l'hyperthermie dans la lutte contre la résistance pléïotropique aux médicaments en médicine clinique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hyperthermie, Résistance pléiotropique, P-glycoproteine, Apoptose, Cellules.

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.

The multidrug transporter LmrP, member of the major facilitator superfamily (MFS), confers L. lactis and recombinant E. coli cells resistance to an array of cytotoxic compounds including antibiotics. LmrP mediates drug extrusion from the plasma membrane by an electrogenic proton/drug exchange reaction, whereby a positively charged substrate may move towards the external medium in exchange for two or more protons moving towards the cytoplasm. Recent studies have suggested that MFS transporters require phosphatidylethanolamine (PE) for function and proper topology. However, the specificity of the PE requirement, as well as the contribution of the electrochemical gradient (the driving force of the substrate transport) to this lipid requirement was not addressed. Here we report a new approach for addressing PE specific requirement for the function and the structure of membranes transporters. We used methyl-PE and dimethyl-PE analogs of PE to show that only replacement of the three hydrogens by methyl moieties leads to changes in the biochemical and biophysical properties of the reconstituted protein. This suggests that LmrP does not depend on the bulk properties of the phospholipids tested but solely on the hydrogen bonding ability of the headgroup. We then show that a single point mutation in LmrP, D68C, is sufficient to recapitulate precisely every biochemical and biophysical effect observed when PE is replaced by phosphatidylcholine (PC) ( including energy transfer between the protein tryptophan residues and the lipid headgroups). We conclude that the negatively charged Asp-68 is likely to participate in the interaction with PE and that such interaction is required for proton gradient sensing, substrate binding, and transport. Because Asp-68 belongs to a highly conserved motif in the Major Facilitator Superfamily (which includes LacY and EmrD), this interaction might be a general feature of these transporters that is involved in proton gradient sensing and lipid dependence.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished