<p>Studies in the ankyrin-B+/- mouse reveal that ankyrin-B deficiency is associated with both the benefits of enhanced cardiac contractility and the costs of arrhythmia, early senescence, reduced lifespan, and impaired glucose tolerance. This constellation of traits is known as ankyrin-B syndrome, which may have important implications for humans possessing functional ankyrin-B mutations. We found that ankyrin-B variants are surprisingly common, ranging from 2 percent of European individuals to 8 percent in individuals from West Africa. Furthermore, by studying of the metabolic phenotype associated with ankyrin-B mouse, we have uncovered a major new dimension to ankyrin-B syndrome, a link between ankyrin-B and parasympathetic control of insulin secretion. Stimulation of pancreatic beta cells by acetylcholine augments glucose-stimulated insulin secretion by inducing inositol-trisphosphate receptor (InsP3R)-mediated Ca2+ release. We report that ankyrin-B is also enriched in pancreatic beta cells. Ankyrin-B-deficient islets display impaired potentiation of insulin secretion by the muscarinic agonist carbachol, blunted carbachol-mediated intracellular Ca2+- release, and reduced InsP3R stability. Ankyrin-B(+/-) mice also display postprandial hyperglycemia, consistent with impaired parasympathetic potentiation of glucose-stimulated insulin secretion. R1788W mutation of ankyrin-B impairs its function in pancreatic islets and associates with type 2 diabetes in Caucasians and Hispanics. Finally, we have generated knockin mice corresponding to the R1788W and L1622I mutations. Functional characterization of these animals will allow us to better understand the relationship between human ankyrin-B variants and ankyrin-B syndrome.</p> / Dissertation

<p>Forebrain cholinergic projection systems innervate the entire cortex and hippocampus. These cholinergic systems are involved in a wide range of cognitive and behavioral functions, including learning and memory, attention, and sleep-waking modulation. However, the <italic>in vivo</italic> physiological mechanisms of cholinergic functions, particularly their fast dynamics and the consequent modulation on the hippocampus and cortex, are not well understood. In this dissertation, I investigated these issues using a number of convergent approaches.</p><p> First, to study fast acetylcholine (ACh) dynamics and its interaction with field potential theta oscillations, I developed a novel technique to acquire second-by-second electrophysiological and neurochemical information simultaneously with amperometry. Using this technique on anesthetized rats, I discovered for the first time the tight <italic>in vivo</italic> coupling between phasic ACh release and theta oscillations on fine spatiotemporal scales. In addition, with electrophysiological recording, putative cholinergic neurons in medial setpal area (MS) were found with firing rate dynamics matching the phasic ACh release. </p><p> Second, to further elucidate the dynamic activities and physiological functions of cholinergic neurons, putative cholinergic MS neurons were identified in behaving rats. These neurons had much higher firing rates during rapid-eye-movement (REM) sleep, and brief responses to auditory stimuli. Interestingly, their firing promoted theta/gamma oscillations, or small-amplitude irregular activities (SIA) in a state-dependent manner. These results suggest that putative MS cholinergic neurons may be a generalized hippocampal activation/arousal network. </p><p> Third, I investigated the hypothesis that ACh enhances cortical and hippocampal immediate-early gene (IEG) expression induced by novel sensory experience. Cholinergic transmission was manipulated with pharmacology or lesion. The resultant cholinergic impairment suppressed the induction of <italic>arc</italic>, a representative IEG, suggesting that ACh promotes IEG induction. </p><p> In conclusion, my results have revealed that the firing of putative cholinergic neurons promotes hippocampal activation, and the consequent phasic ACh release is tightly coupled to theta oscillations. These fast cholinergic activities may provide exceptional opportunities to dynamically modulate neural activity and plasticity on much finer temporal scales than traditionally assumed. By the subsequent promotion of IEG induction, ACh may further substantiate its function in neural plasticity and memory consolidation.</p> / Dissertation

Predatory shallow-water tropical marine snails within the genus Conus are estimated to consist of up to 700 species. These carnivorous mollusks have devised efficient venom harpoon-like radular teeth that allow them to predominantly incapacitate polychaete annelids (vermivores), in some cases fish (piscivores), or other mollusks (molluscivores) as an envenomation survival strategy for feeding, defense, and competitor deterrence. The venom of each Conus species contains a distinctive assortment of over 50 diversified disulfide-rich conotoxins with varied pharmacological specificities that selectively inhibit the function of ion channels (Ca2+, Na+, K+) or nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) involved in the animal neurotransmission. Across the genus Conus, the conotoxins represent an extensive array of ion channel blockers each showing an exquisite selectivity to distinguish between channels / receptors and even particular their subtypes. Novel conotoxins detected in the molecular neurobiological approach, providing chemists and pharmacologists a vast library (>50,000 individual toxins) of conotoxins have been further screened for their abilities to modify the responses of tissues to pain stimuli as a first step in describing their potential as lead compounds for novel drugs. In this article, we present the natural history of the Conus biology as well as the nomenclature, classification, structure, neurotoxicological mechanisms, post-translational modification, and pharmaceutical applications of conotoxins. In addition, we also set up the bioinformatic database and search engine about hitherto-identified name and distribution of Conus species and neuropharmacological mechanism, accession number, sequence, and 3D structure of conotoxins and provide researchers advantageous tools for further investigation.

Thesis (M. Sc.)--York University, 2001. Graduate Programme in Biology. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 106-118). Also available on the Internet. MODE OF ACCESS via web browser by entering the following URL: http://wwwlib.umi.com/cr/yorku/fullcit?pMQ66399.

The striatum is the initial input nuclei of the basal ganglia, and it serves as an integral processing center for action selection and sensorimotor learning. Glutamatergic projections from the cortex and thalamus converge with dense dopaminergic axons from the midbrain to provide the primary inputs to the striatum. Striatal output is then relayed to downstream basal ganglia nuclei by GABAergic medium – sized spiny neurons, which comprise at least 95% of the population of neurons in the striatum. The remaining population of local circuit neurons is dedicated to regulating the activity of spiny projection neurons, and although spiny neurons form a weak lateral inhibitory network among themselves via local axon collaterals, feedforward modulation exerts more powerful control over spiny neuron excitability. Of the striatal interneurons, only one class is not GABAergic. These neurons are cholinergic and correspond to the tonically active neurons (TANs) recorded in vivo, which respond to specific environmental stimuli with a transient depression, or pause, of tonic firing. Striatal cholinergic interneurons account for less than 2 % of the striatal neuronal population, yet their axons form an extensive and complex network that permeates the entire striatum and significantly shapes striatal output by acting at numerous targets via varied receptor types. Indeed, the persistent level of ambient striatal acetylcholine as well as changes to that basal acetylcholine level underlie the major mechanisms of cholinergic signaling in the striatum, however regulation of this system by the local striatal microcircuitry is not well understood. This dissertation finds that activation of intrastriatal cholinergic fibers elicits polysynaptic GABAA inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) in cholinergic interneurons recorded in brain slices. Excitation of striatal GABAergic neurons via nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediates this polysynaptic inhibition in a manner independent of dopamine. Moreover, activation of a single cholinergic interneuron is capable of eliciting polysynaptic GABAA IPSCs onto itself and nearby cholinergic interneurons. These findings provide an important insight into the striatal microcircuitry controlling cholinergic neuron excitability. / text

<p>Auditory sensations can arise from objects in our environment or from our own actions, such as when we speak or make music. We must able to distinguish such sources of sounds, as well as form new associations between our actions and the sounds they produce. The brain is thought to accomplish this by conveying copies of the motor command, termed corollary discharge signals, to auditory processing brain regions, where they can suppress the auditory consequences of our own actions. Despite the importance of such transformations in health and disease, little is known about the mechanisms underlying corollary discharge in the mammalian auditory system. Using a range of techniques to identify, monitor, and manipulate neuronal circuits, I characterized a synaptic and circuit basis for corollary discharge in the mouse auditory cortex. The major contribution of my studies was to identify and characterize a long-range projection from motor cortex that is responsible for suppressing auditory cortical output during movements by activating local inhibitory interneurons. I used similar techniques to understand how this circuit is embedded within a broader neuromodulatory brain network important for learning and plasticity. These findings characterize the synaptic and circuit mechanisms underlying corollary discharge in mammalian auditory cortex, as well as uncover a broad network interaction potentially used to pattern neural associations between our actions and the sounds they produce.</p> / Dissertation

Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChR) αποτελούν πρότυπα μέλη της υπεροικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων διαύλων ιόντων. Εμπλέκονται τόσο σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού, όσο και σε πολλές νόσους προσελκύοντας μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον. Οι nAChR διακρίνονται κυρίως σε νευρικού και μυϊκού τύπου. Ο νευρικός α4β2 nAChR έχει εκφραστεί και μελετηθεί με τεχνικές όπως πρόσδεση αγωνιστών-ανταγωνιστών και ηλεκτροφυσιολογικές αναλύσεις. Όμως δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ, πάνω σε αυτόν τον υποδοχέα δεν έχουν ακόμα αναφερθεί και πιθανή αιτία γι’ αυτό μπορεί να είναι και η ευέλικτη διαμόρφωση της κυτταροπλασματικής θηλιάς μεταξύ των διαμεμβρανικών ελίκων Μ3 και Μ4, η οποία μπορεί να εμποδίζει την ευαίσθητη από τη φύση της διαδικασία της κρυστάλλωσης των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Στην παρούσα μελέτη ο ανθρώπινος α4β2 nAChR εκφράστηκε τόσο σε κύτταρα εντόμων Sf9 με τη βοήθεια βακιλοϊού, όσο και σε ζυμομύκητες P. pastoris, σε δυο μορφές: Τον άγριου τύπου υποδοχέα (ΑΤ) και μια μορφή χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά (Κ). Στόχος της παρούσης μελέτης, ήταν η έκφραση ενός τύπου α4β2 nAChR με την καλύτερη δυνατή ποιότητα δομής και τα υψηλότερα δυνατά επίπεδα έκφρασης, ο οποίος θα ήταν κατάλληλος να χρησιμοποιηθεί σε δομικές μελέτες υψηλής ανάλυση όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ. Αρχικά κατασκευάστηκαν ανασυνδυασμένοι βακιλοϊοί με τα cDNA των υπομονάδων των ΑΤ και Κ α4β2 υποδοχέων, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα εντόμων Sf9 αναγκάζοντάς τα να εκφράσουν τους υποδοχείς. Οι υπομονάδες των ΑΤ και Κ υποδοχέων ανιχνεύτηκαν εκφρασμένες σε κύτταρα εντόμων με στύπωμα western σε αναμενόμενα μοριακά βάρη, ενώ με πρόσδεση 125Ι-επιβατιδίνης αποδείχθηκε ότι οι α4 και οι β2 υπομονάδες είχαν ενωθεί μεταξύ τους μετά την έκφρασή τους και είχαν συγκροτήσει λειτουργικούς θύλακες πρόσδεσης ακετυλοχολίνης. Ο βέλτιστος χρόνος έκφρασης των υποδοχέων βρέθηκε να είναι τα 3 24ωρα, ενώ οι ιδανικές αναλογίες α4 προς β2 βακιλοϊών βρέθηκαν να είναι οι: 1:1 και 1:3. Η προσθήκη νικοτίνης στο θρεπτικό δεν βρέθηκε να έχει κάποια μετρήσιμη επίπτωση στην έκφραση ούτε του ΑΤ ούτε και του Κ υποδοχέα. Πειράματα πρόσδεσης 3Η-επιβατιδίνης έδειξαν τη συγγένειά της με τον ΑΤ υποδοχέα να είναι 2 φορές υψηλότερη σε σχέση με τον Κ, ενώ στα ίδια πειράματα βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Κ υποδοχέα ήταν 7 φορές υψηλότερα από αυτά του ΑΤ. Πειράματα πρόσδεσης μη επισημασμένων προσδετών έδωσαν συγγένειες επίσης δυο φορές υψηλότερες για τον ΑΤ υποδοχέα σε σχέση με τον Κ. Επιπλέον πειράματα διαλυτοποίησης έδειξαν ότι οι βέλτιστες συνθήκες για την διαλυτοποίηση των υποδοχέων ήταν οι 25 oC και η χρήση του απορρυπαντικού Triton X-100. Στην ίδια σειρά πειραμάτων ο Κ υποδοχέας βρέθηκε να διαλυτοποιείται 4 φορές πιο αποδοτικά σε σχέση με τον ΑΤ. Τα πειράματα απομόνωσης και καθαρισμού συνεχίστηκαν μόνο με τον Κ υποδοχέα, λόγω καλύτερης διαλυτοποίησης και πολύ υψηλότερων επιπέδων έκφρασης που παρουσίαζε σε σχέση με τον ΑΤ. Ο Κ α4β2 υποδοχέας απομονώθηκε και καθαρίστηκε αρχικά με χρωματογραφία συγγένειας ιόντων νικελίου και στη συνέχεια με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, η οποία έδειξε ότι ο Κ υποδοχέας είχε εκλουστεί σε όγκο έκλουσης συμβατό με το αναμενόμενο ΜΒ. Το γεγονός αυτό, μαζί με το γεγονός της πρόσδεσης επιβατιδίνης και άλλων προσδετών, πιστοποίησαν ότι οι ταυτόχρονα εκφραζόμενες α4 και β2 υπομονάδες συγκρότησαν υποδοχείς. Η ανάλυση του καθαρισμένου Κ α4β2 υποδοχέα με SDS PAGE και στύπωμα western έδειξε ότι ο υποδοχέας είχε απομονωθεί και καθαριστεί σε ικανοποιητικό βαθμό. Η έκφραση των ΑΤ και Κ υποδοχέων στο στέλεχος GS 115 του ζυμομύκητα P. pastoris δεν ήταν το ίδιο επιτυχημένη με την αντίστοιχη έκφραση σε κύτταρα εντόμων. Οι υπομονάδες των υποδοχέων δεν ανιχνεύτηκαν στην ανάλυση με στύπωμα western, ενώ η ανάλυση με δέσμευση 3Η-επιβατιδίνης έδειξε ότι εκφράστηκαν σε επίπεδα πολύ χαμηλότερα σε σχέση με αυτά των κυττάρων εντόμων. Τέλος τα ποσοστά διαλυτοποίησης που επιτυγχάνονταν με τον ζυμομύκητα P. pastoris ήταν επίσης πολύ χαμηλότερα από τα αντίστοιχα των κυττάρων εντόμων, οπότε η μελέτη δεν προχώρησε περεταίρω με αυτό το σύστημα έκφρασης. Συμπερασματικά μέσα από την παρούσα μελέτη, προέκυψε ένας ανθρώπινος νευρικός α4β2 nAChR χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά, εκφρασμένος σε κύτταρα εντόμων με τη βοήθεια βακιλοϊού, ο οποίος εκφράζεται και διαλυτοποιείται πολύ περισσότερο από τον φυσικό υποδοχέα και επιπλέον μπορεί να απομονωθεί και να καθαριστεί σχετικά εύκολα. Η απουσία της εύκαμπτης κυτταροπλασματικής θηλιάς αναμένεται να διευκολύνει τον σχηματισμό κρυστάλλων του υποδοχέα στα πειράματα κρυστάλλωσης, τα οποία έχουν ήδη ξεκινήσει, καθώς και την ανάλυση των δεδομένων εφόσον προκύψουν πρωτεϊνικοί κρύσταλλοι. Τέλος οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση ΑΤ και Κ α4β2 nAChR μεταξύ κυττάρων εντόμων και ζυμομύκητα P. pastoris, ελέγχθηκαν εκφράζοντας στα συστήματα αυτά μια μικρότερη, συγγενική πρωτεΐνη, η οποία αποτελείτο μόνο από το ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου μυϊκού τύπου nAChR. Το εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων α1-ECD (i-α1-ECD) βρέθηκε να έχει μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενών σε σχέση με το εκφρασμένο σε ζυμομύκητα P. pastoris (y-α1-ECD), καθώς επίσης μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR mAb, αποτελέσματα τα οποία μαζί με αντίστοιχα του κυκλικού διχρωϊσμού έδειξαν βελτιωμένη δομή, επιβεβαιώνοντας ότι τα κύτταρα εντόμων εκφράζουν καλύτερα nAChR σε σχέση με το ζυμομύκητα P. pastoris. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι το i-α1-ECD είναι καταλληλότερο τόσο για δομικές μελέτες όσο και για βελτιωμένες θεραπείες της βαριάς μυασθένειας. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are models for the superfamily of pentameric ligand gated ion channels. They are involved both in many physiological functions and in many diseases, attracting major scientific interest. nAChRs are distinguished in muscle and neuronal type. Neuronal α4β2 nAChRs have been expressed and studied using ligand binding and electrophysiology technics. Nevertheless high resolution structural studies like X-ray crystallography have not yet been referred, and one main reason for that may be the flexible conformation of the cytoplasmic loop between the transmembrane helixes M3 and M4, which is very likely to prevent the membrane protein crystallization process. In the present study the wild type (WT) human α4β2 nAChR and a truncated construct (T), that lacked the cytoplasmic loop, were expressed both in Sf9 insect cells using baculovirus and in the yeast Pichia pastoris. The aim of the present study was the expression and purification of a human α4β2 nAChR type receptor, suitable for use in high resolution structure analysis, and especially in X-ray crystallography. Recombinant baculoviruses were constructed, containing the α4β2 nAChR subunits cDNAs. They were used to infect Sf9 insect cells, made them to coexpress the WT or T α4 and β2 subunits. WT and T receptor subunits were detected expressed in the expected molecular weights, while 125Ι-epibatidine binding proved that α4 and β2 subunits had formed ligand binding sites. The best expression time was found to be 72 hours post infection and the best α4/β2 recombinant baculovirus ratios were found to be between 1:1 and 1:3. Nicotine addition to the medium did not make any difference in the expression levels. 3Η-epibatidine binding studies showed 2 times stronger affinity for the WT than the T receptor and 7 times higher expression levels for the T than the WT receptor. Non labeled ligand binding studies showed also 2 times stronger affinity for the WT than the T nAChR. Other experiments indicated that 25 oC and the Triton X-100 detergent were the best combination for the receptor’s solubilization. Other solubilization experiments showed T nAChR solubilized 4 times better than the WT. Purification experiments continued only for T construct due to its higher expression levels and better solubilization efficiency. T α4β2 receptor was originally purified using ion metal affinity chromatography and subsequently gel filtration chromatography, which showed that T receptor has elution volume compatible with the expected MW. This result together with the receptors’ ligand binding capabilities certified that the coexpressed α4 and β2 subunits formed oligomeric receptors. SDS PAGE and western blot analysis indicated that T nAChR was satisfactory purified. The expression of the WT and T receptors in the strain GS 115 of the yeast P. pastoris was not as successful as the expression in insect cells. Receptor subunits were not detected using western blot analysis, whereas 3Η-epibatidine binding studies indicated expression levels much lower than that of insect cells. Finally, solubilization of the yeast expressed WT and T α4β2 nAChRs was very poor compared with that of insect cells. Due to all the above results, the yeast expression of the WT and T nAChRswas discontinued. In conclusion, by the present study, a new human α4β2 nAChR without cytoplasmic loop was emerged, expressed in sf9 insect cells using baculovirus, with much higher expression levels and solubilization yields than that of the natural receptor and capable for easy purification. The absence of the unordered cytoplasmic loop is expected to facilitate the crystal formation and the analysis of any protein crystals might derive from the crystallization efforts which have been already started. Finally, the differences of the expressed WT and T α4β2 nAChRs between insect cells and the yeast P. pastoris were further confirmed by expressing a small, related protein, the ECD of the α1 subunit of human muscle nAChR in both systems and comparing the two expressed α1 ECDs. The insect expressed α1 ECD (i-α1-ECD) was found to have higher immunoadsorption capacity for anti-nAChR autoantibodies from myasthenia patients sera than the yeast expressed (y-α1-ECD) and also higher binding ability for anti-nAChR mAbs. These results together with circular dichroism results showed a more native-like structure for the i-α1-ECD, confirming that insect cells express better nAChRs comparing to the yeast P. pastoris. Furthermore it was proved that i-α1-ECD was a better candidate for structural studies and more suitable for selective myasthenia gravis therapies.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι κατιονικοί δίαυλοι, οι οποίοι ενεργοποιούνται κατόπιν πρόσδεσης κατάλληλου νευροδιαβιβαστή και ευθύνονται για την κυτταρική επικοινωνία δια μέσου της ακετυλοχολίνης. Ο κυριάρχος τύπος νικοτινικών υποδοχέων στον εγκέφαλο των θηλαστικών με υψηλή συγγένεια για νικοτίνη, αποτελείται από α4 και β2 υπομονάδες. Ο συγκεκριμένος τύπος υποδοχέων, είναι υπεύθυνος για την εξάρτηση στην νικοτίνη και θεωρείται ότι εμπλέκεται στις ασθένειες Alzheimer και Parkinson. Για το λόγο αυτό οι συγκεκριμένοι δίαυλοι, αποτελούν έναν σημαντικό στόχο σχεδιασμού και ανάπτυξης φαρμάκων. Στην προσπάθειά μας να αποκτήσουμε υδρόφιλες περιοχές του ανθρώπινου υποδοχέα α4β2 για δομικές μελέτες ικανές να προσδένουν αγωνιστές, εκφράσαμε τα εξωκυττάρια τμήματα των συγκεκριμένων υπομονάδων στο ευκαρυωτικό σύστημα έκφρασης ζύμης Pichia pastoris. Στα αγρίου τύπου εξωκυττάρια τμήματα αλλά και στις μεταλλαγμένες μορφές τους, στις οποίες έχει αντικατασταθεί η κυστινική θηλιά με την περισσότερο υδρόφιλη αντίστοιχη περιοχή της πρωτεΐνης η οποία δεσμεύει ακετυλοχολίνη, δεν παρατηρήθηκε καμία ειδική αλληλεπίδραση με γνωστούς προσδέτες. Κρίθηκε λοιπόν αναγκαίο να εκφράσουμε τα εξωκυττάρια τμήματα διασυνδεόμενα με ένα ολιγοπεπτίδιο 24 αμινοξικών καταλοίπων (AGS)8, ως ένα μόριο. Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι το συγκαταμερές β2-24-α4-mECD αλλά όχι το α4-24-β2-mECD είναι αρκετά υδατοδιαλυτό μόριο με πολύ καλές ιδιότητες πρόσδεσης αγωνιστών. Η ιωδινιωμένη επιβατιδίνη (125Ι-επιβατιδίνη) και η τριτιωμένη νικοτίνη ([3Η]-νικοτίνη) δεσμεύονται στο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD με σταθερές διάσπασης (Kd) 0,38 και 19 nM αντίστοιχα, τιμές οι οποίες προσεγγίζουν τις αντίστοιχες γνωστές από τη βιβλιογραφία, που προσδίδονται σε ολόκληρο τον ανθρώπινο υποδοχέα α4β2. Επιπλέον, το πόσο ειδική είναι η δέσμευση της 125Ι-επιβατιδίνης φαίνεται και από το γεγονός ότι παρεμποδίζεται συναγωνιστικά από τους αγωνιστές νικοτίνη, κυτισίνη, ακετυλοχολίνη και καρβαμυλοχολίνη με τιμές σταθεράς αναστολής (Κi) ίσες με 20,64, 3,24, 242 και 2254 nM αντίστοιχα. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η δημιουργία πενταμερών εξωκυττάριων τμημάτων των ανθρώπινων υπομονάδων α4 και β2. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε συνέκφραση καθενός από τα δύο συγκαταμερή (α4-24-β2-mECD και β2-24-α4-mECD), τα οποία φέρουν χαρακτηριστική αλληλουχία έξι ιστιδινών (6xHis), με κάθε εξωκυττάριο τμήμα των μεταλλαγμένων υπομονάδων α4 ή β2 τα οποία φέρουν την χαρακτηριστική αλληλουχία του οκταπεπτιδίου FLAG. Στις περιπτώσεις της συνέκφρασης του συγκαταμερούς α4-24-β2-mECD με καθένα από τα εξωκυτταρικά και μεταλλαγμένα τμήματα των υπομονάδων α4 ή β2 (α4-mECD ή β2-mECD) δεν παρατηρήθηκε δέσμευση με 125Ι-επιβατιδίνη και συνεπώς δεν προχωρήσαμε σε περαιτέρω χαρακτηρισμό. Μόνο στην περίπτωση της συνέκφρασης του συγκαταμερούς β2-24-α4-mECD με το β2-mECD παρατηρήθηκε πρόσδεση με 125Ι-επιβατιδίνη. Επίσης, οι μελέτες δυναμικής σκέδασης φωτός εμφάνισαν μία εκτεταμένη ετερογένεια μεγέθους των τελικών προϊόντων όπως απομονώνονται μέσω της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης, αποκλείοντας, τουλάχιστον σε αυτό το σημείο οποιαδήποτε προσπάθεια δομικής μελέτης για τα συγκεκριμένα μόρια. Κατασκευάστηκαν επίσης δύο συγκαταμερή τριμερών (β2-24-β2-24-α4-mECD και β2-24-α4-24-β2-mECD). Δυστυχώς, η ανάλυση μέσω SDS-PAGE και η αποτύπωση κατά Western αποκάλυψε την ύπαρξη ενός μείγματος, το οποίο αποτελείται από ολόκληρα τα μόρια (τριμερή) αλλά και από πολυπεπτίδια στα οποία απουσιάζουν ένα ή και δύο από τα μονομερή εξωκυττάρια τμήματα (διμερή και μονομερή αντίστοιχα). Το συγκεκριμένο αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι το σύστημα ετερόλογης έκφρασης το οποίο χρησιμοποιούμε (P. pastoris) αν και είναι κατάλληλο για την έκφραση των λειτουργικών διμερών συγκαταμερών (β2-24-α4-mECD), είναι μάλλον ακατάλληλο για την έκφραση πιο περίπλοκων κατασκευών, πιθανότατα εξαιτίας γεγονότων ομόλογου ανασυνδιασμού των πλασμιδίων πριν ή κατά την ενσωμάτωσής τους στο γονιδίωμα της ζύμης. Ακόμα, ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι το απογλυκοζυλιωμένο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD εμφανίζει τις ίδιες ιδιότητες πρόσδεσης αγωνιστών. Επιπροσθέτως, το απογλυκοζυλιωμένο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD απομονονέται ως μονομερές, γεγονός το οποίο, σε συνδιασμό με την προηγούμενη παρατήρηση, καθιστά την συγκεκριμένη πρωτεΐνη κατάλληλη να χρησιμοποιηθεί σε δομικές μελέτες και πιθανόν για την φαρμακολογική εκτίμηση καινούργιων και ειδικών αγωνιστών για υποδοχείς α4β2. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are ligand-gated cation channels responsible for cell communication via the neurotransmitter acetylcholine. The predominant nAChR subtype in the mammalian brain with a high affinity for nicotine is composed of α4 and β2 subunits. This nAChR subtype is responsible for addiction to nicotine and is thought to be implicated in Alzheimer and Parkinson diseases and therefore presents an important target for drug design. In an effort to obtain water-soluble, ligand-binding domains of the human α4β2 nAChR appropriate for structural studies, we expressed the extracellular domains (ECDs) of these subunits in the eukaryotic expression system Pichia pastoris. The wild-type ECDs and their mutants containing the more hydrophilic Cys-loop from the snail acetylcholine-binding protein (individually expressed or coexpressed) did not demonstrate any specific interaction with ligands. We then linked the mutated ECDs with the 24 amino acid peptide (AGS)8 and observed that the β2-24-α4-mECD concatamer, but not the α4-24-β2-mECD one, exhibited very satisfactory water solubility and ligand binding properties. The 125I-epibatidine and [3H]nicotine bound to β2-24-α4-mECD with dissociation constants (Kd) of 0.38 and 19 nM, respectively, close to the published values for the intact α4β2 nAChR. In addition, 125I-epibatidine binding was blocked by nicotine, cytisine, acetylcholine, and carbamylcholine with inhibition constants (Ki) of 20.64, 3.24, 242, and 2,254 nM, respectively. In addition, we attempted to create pentameric domains of the extracellular human subunits α4 and β2. Initially, we accomplished the coexpression of the particular concatamers, α4-24-β2-mECD and β2-24-α4-mECD, bearing the six histidine tag (6xHis), with each of the mutated extracellular domains of the subunits α4 and β2 (α4-mECD and β2-mECD), bearing the characteristic octapeptide FLAG tag. The coexpression of the concatamer α4-24-β2-mECD with each of α4 or β2-mECD did not lead to binding to 125I - epivatidine and therefore we did not proceed to any further characterization. Only in the case of the coexpression of the concatamer β2-24-α4-mECD with the β2-mECD we observed binding to 125I - epivatidine. Aditionally, the dynamic light scattering studies demonstrated a widespread size heterogeneity of the final product as isolated by gel filtration chromatography, blocking, at least at this point, any further attempt for structural studies of the specific molecules. We then constructed two trimeric concatamers (β2-24-β2-24-α4-mECD and β2-24-α4-24-β2-mECD) . Unfortunately, the analysis by SDS-PAGE and Western blot revealed the presence of a mixture which consists of entire molecules ( trimers ), but also from polypeptides which are missing one or two of the monomer extracellular domains (dimers and monomers, respectively). This result indicates that the heterologous expression system which is used (P. pastoris), is suitable for the expression of functional bilateral concatamers (β2-24-α4-mECD), but is rather unsuitable for the expression of more complex structures, probably due to events of homologous recombination of the plasmids before or during integration into the yeast genome . Interestingly, deglycosylation of the concatamer did not affect its ligand binding properties. Furthermore, the deglycosylated β2-24-α4 ECD existed mainly in monomeric form, thus forming an appropriate material for structural studies and possibly for pharmacological evaluation of novel α4β2 nAChR-specific agonists.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των πενταμερών ιοντικών καναλιών (LGICs), που περιλαμβάνει τους υποδοχείς σεροτονίνης (5-HT3), γλυκίνης (GlyR) και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA, GABAB). Κάθε υπομονάδα του nAChR αποτελείται από μία αμινο-τελική εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας, από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Οι nAChRs διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρικούς. Οι μυϊκοί nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μείς. Σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ στα ενήλικα άτομα θηλαστικών, με δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α1-ΕΚΠ και της γ(ε) και δ-ΕΚΠ. Στην α1-ΕΚΠ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται αντι-nAChR αντισώματα στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας. Οι νευρικοί nAChRs βρίσκονται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, όπου διαβιβάζουν τις νευρικές ώσεις. Σχηματίζουν είτε ετεροπενταμερή, μεταξύ 2-3 α-υπομονάδων (υπότυποι α2-6) και 2-3 β-υπομονάδων (υπότυποι β2-4), ή ομοπενταμερή. Η α7 είναι η μόνη γνωστή υπομονάδα του νευρικού nAChR που σχηματίζει ομοπενταμερή μόρια στον άνθρωπο, με πέντε θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Μέχρι στιγμής, έχουν πραγματοποιηθεί τέσσερα σημαντικά επιτεύγματα, όσον αφορά την κατανόηση της δομής των nAChRs: Α. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, της ομόλογης προς τα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nAChR (25% αμινοξική ταύτιση με την α7), ομοπενταμερούς πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh γαστεροπόδων (AChBP), καθώς και των δομών της με διάφορους χολινεργικούς προσδέτες. Προσεγγίστηκε έτσι για πρώτη φορά η διαμόρφωση των nAChR-θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Β. Η λύση της δομής, με ηλεκτρονική μικροσκοπία, του Torpedo nAChR, η οποία αποκάλυψε την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του nAChR. Εντούτοις, λόγω της περιορισμένης ευκρίνειας (4 Å), δεν αποκάλυψε τη συγκρότηση των θέσεων πρόσδεσης της ACh σε ατομικό επίπεδο. Γ. Η λύση της δομής σε υψηλή ευκρίνεια (1,94 Å) του συμπλόκου της α1-ΕΚΠ επίμυος με τον nAChR- ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx). Η λυση αυτής της δομής αποκάλυψε σε ατομικό επίπεδο την MIR περιοχή, τις θηλιές Α, B και C της κυρίως πλευράς των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών και τη χαρακτηριστική Cys θηλιά. Δεδομένου όμως, ότι η δομή της α1-ΕΚΠ αναπαριστά ένα μονομερές, η δομή μίας πλήρως διαμορφωμένης θέσης πρόσδεσης εξακολουθεί να απουσιάζει. Δ. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, μίας προκαρυωτικής LGIC πρωτεΐνης (ELIC), η οποία θεωρείται μάλιστα πως αποτελεί τον πρόγονο όλων των ευκαρυωτικών LGICs, συμπεριλαμαβανομένου του nAChR, με την οποία αποκαλύφθηκε ο βασικός σκελετός της δομής των LGICs. Είναι φανερό, ότι παρόλα αυτά τα επιτεύγματα, απουσιάζει ακόμη η λύση της δομής ενός πενταμερούς nAChR. Η νευρική α7 υπομονάδα του nAChR είναι μία καλή υποψήφια για την επίτευξη αυτού του στόχου, αφού σχηματίζει πενταμερή in vivo. Επιπλέον, αυτή εμπλέκεται σε ένα μεγάλο αριθμό νευρικών παθήσεων (Alzheimer, Parkinson, επιληψία, σχιζοφρένεια, κλπ), και η λύση της δομής της θα οδηγήσει και στο σχεδιασμό θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι αυτών των ασθενειών. Μάλιστα, εφ’όσον στην α7- ΕΚΠ εδράζουν οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, είναι πιο ρεαλιστική η προσπάθεια κρυστάλλωσης αυτής της περιοχής αντί ολόκληρου του α7 nAChR, αφού οι εκτενείς υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές του τελευταίου περιορίζουν τη διαλυτότητά του. Στο παρελθόν είχαμε εκφράσει στο Εργαστήριό μας την ανθρώπινη α7-EKΠ αγρίου τύπου και ένα διπλό μετάλλαγμα αυτής, σε κύτταρα P. pastoris, με στόχο μελέτη της δομής τους. Τα μόρια αγρίου τύπου, βρέθηκαν όμως να είναι αρκετά υδρόφοβα, αφού εκφράσθηκαν ως συσσωματώματα πολύ υψηλού μοριακού βάρους (ΜΒ) και ως ολιγομερή μεγαλύτερα από πενταμερή. Τα μόρια του διπλού μεταλλάγματος, στα οποία ολόκληρη η Cys θηλιά του α7 nAChR αντικαταστάθηκε από την πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της AChBP σε συνδυασμό με την μετάλλαξη Cys116Ser, εμφάνισαν μεν αυξημένη διαλυτότητα και ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, διατήρησαν όμως δε ένα σημαντικό βαθμό δημιουργίας συσσωματωμάτων υψηλού ΜΒ, οδηγώντας σε αποτυχείς προσπάθειες κρυστάλλωσής τους. Στην παρούσα μελέτη, στηριχθήκαμε στο τρισδιάστατο μοντέλο της ανθρώπινης α7- ΕΚΠ, το οποίο κατασκευάσαμε χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία τις, μόνες γνωστές έως τότε, δομές της AChBP και της α-EKΠ του Torpedo nAChR, προκειμένου να σχεδιάσουμε νέες μεταλλάξεις για την ενίσχυση της διαλυτότητας και της πενταμερούς συγκρότησης των α7- ΕΚΠ μορίων. Έτσι, μεταλλάξαμε τα εκτεινόμενα, στο εξωτερικό περιβάλλον του μοντέλου, υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα προς λιγότερο υδρόφοβα, με στόχο την αύξηση της διαλυτότητας των εκφραζόμενων α7-ΕΚΠ μορίων, καθώς και μερικά κατάλοιπα της διεπιφάνειας μεταξύ γειτονικών α7-ΕΚΠ πρωτομερών προς μεγαλύτερα ή φορτισμένα, με στόχο την εισαγωγή επιπλέον υδρογονικών ή ηλεκτροστατικών δεσμών με αντικρυστά κατάλοιπα της γειτονικής α7-ΕΚΠ υπομονάδας. Η μελέτη των χρωματογραφημάτων μοριακής διήθησης και δυναμικής σκέδασης του φωτός όλων των προκύπτοντων α7-ΕΚΠ μεταλλαγμάτων υπέδειξε ότι αυτά που έφεραν μεταλλάξεις σε κατάλοιπα της διεπιφάνειας εκφράσθηκαν όπως τα μόρια αγρίου-τύπου, ενώ αυτά που έφεραν την αντικατάσταση των εκτειθέμενων υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων από λιγότερο υδρόφοβα, εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου. Μάλιστα, ένα τουλάχιστον τέτοιο μετάλλαγμα (mut-10), εμφάνισε σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα και ως προς το προϋπάρχον διπλό μετάλλαγμα, αφού εκφράσθηκε αποκλειστικά υπό τη μορφή ολιγομερών με κοντινό στο θεωρητικά αναμενόμενο ΜΒ για πενταμερή μόρια. Επιπλέον, εμφάνισε μία σημαντικά αυξημένη συγγένεια πρόσδεσης για τον σημασμένο ανταγωνιστή 125I-α-bgtx (Kd = 24 nM), σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου (Kd = 70 nM) και διπλού μεταλλάγματος (Kd = 52 nM), η οποία πρόσδεση βρέθηκε να αναστέλλεται από μη σημασμένα μόρια α-bgtx, d-τουμποκουραρίνης ή νικοτίνης (Ki = 21,5 nM, Ki = 127 μM, Ki = 17,5 mM, αντίστοιχα). Οι τιμές αυτές των σταθερών για το mut-10 είναι χαμηλότερες από αυτές των μορίων αγρίου τύπου και άλλων μεταλλαγμάτων, ενώ είναι αρκετά κοντινές προς αυτές του φυσικού μορίου α7 nAChR, υποδηλώνοντας ταυτόχρονα την αύξηση στην ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, αλλά και την κοντινή διαμόρφωση του mut-10 στο χώρο με αυτό των φυσικών μορίων. Επιπρόσθετα, μελέτες κυκλικού διχρωϊσμού, αποκάλυψαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα mut-10 μόρια, καθώς και τοπικές αλλαγές στη διαμόρφωσή τους κατά την πρόσδεση διάφορων χολινεργικών προσδετών. Επίσης, αποκάλυψαν τη σύσταση της δευτεροταγούς δομής των ανθρώπινων α7-ΕΚΠ μορίων, η οποία βρέθηκε να είναι ~45% β-πτυχωτή επιφάνεια και 5% α-έλικα, σε συμφωνία με αυτή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR, της AChBP και της α1-EKΠ του nAChR επίμυος. Τέλος, με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκαλύφθηκε ένας υψηλός βαθμός ομοιογένειας των εκφραζόμενων mut-10 μορίων, και η συγκρότησή τους πιθανότατα σε πενταμερή με εμφανή το χαρακτηριστικό κεντρικό πόρο, ο οποίος αποτελεί την απαρχή του ιοντικού καναλιού σε ολόκληρο τον α7 nAChR. Συμπερασματικά, το μετάλλαγμα mut-10 της παρούσης μελέτης είναι κατάλληλο για δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, απαραίτητες για την έναρξη ενός ορθολογικού σχεδιασμού φαρμάκων έναντι των ασθενειών που συνδέονται με τον α7 nAChR. Επιπλέον, δεδομένου ότι τα απογλυκοζυλιωμένα mut-10 μόρια διατήρησαν την υδροφιλικότητα, την ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών και τη δευτεροταγή τους δομή, αυτά είναι επίσης κατάλληλα για κρυσταλλώσεις, αφού μάλιστα σε αυτή την περίπτωση αυξάνεται πιθανότατα και ο βαθμός ομοιογένειάς τους. Ένας παράλληλος σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η ανίχνευση με μελέτες κυκλικού διχρωϊσμού, της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των α1-, β1-, γ- και ε- ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR, τα οποία είχαν επίσης εκφρασθεί σε κύτταρα P. pastoris. Οι μελέτες αυτές αποκάλυψαν ότι το κυρίαρχο δευτεροταγές δομικό χαρακτηριστικό όλων αυτών των μορίων ήταν η β-πτυχωτή επιφάνεια (~40%), ενώ παρατηρήθηκε και μία μικρή συμμετοχή α-έλικας (~5%), σε συμφωνία με την δευτεροταγή δομή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR και της AChBP και με τη μεταγενέστερη των αποτελεσμάτων αυτών, λύση της δομής της α1-ΕΚΠ του nAChR επίμυος. Επίσης, επιβεβαίωσαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα μόρια αυτά, κάτι που είχε στο παρελθόν υπαινιγχθεί από βιοχημικές και ανοσοχημικές μελέτες. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν την κοντινή προς τα φυσικά μόρια διαμόρφωση των ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR που εκφράζονται στο Εργαστήριό μας, και ενισχύουν τη χρήση τους για περαιτέρω δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, αλλά και ως ειδικούς ανοσοπροσροφητές των αντι-nAChR αντισωμάτων ορών μυασθενικών σε μία, υπό ανάπτυξη από το Εργαστήριό μας, αντιγονο-ειδική θεραπευτική προσέγγιση της βαριάς μυασθένειας. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) belong to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGICs), also including serotonin (5-HT3), glycine and γ- aminobutyric acid receptors (GABAA and GABAC). Each nAChR subunit consists of an Nterminal extracellular domain (ECD), harbouring the signature Cys-loop, four transmembrane α-helices and a small cytoplasmic loop. nAChRs are classified into muscle and neuronal types. Muscle-type nAChRs are found in fish electric organs and at the vertebrate neuromuscular junctions, where they mediate neuromuscular transmission. They form heteropentamers with a stoichiometry (α1)2β1γδ or (α1)2β1εδ in adult mammalian nAChR and bear two ligand-binding sites formed between α1- and γ(ε)- or δ-ECDs. The α1-ECD hosts the main immunogenic region (MIR), against which a large number of anti-nAChR antibodies are directed in the autoimmune disease, myasthenia gravis. Neuronal nAChRs are widely distributed in the central and peripheral nervous system and play key roles in neuron-neuron interactions. They exist either as heteropentamers of 2-3 α subunits (subtypes α2–6) plus 2-3 β subunits (β2–4) or as homopentamers. α7 is the only human neuronal subunit known to form a homopentamer with five ligand-binding sites between its ECDs. Regarding the atomic structure of nAChR, four major breakthroughs have been achieved so far: A. The X-ray crystal structure of the homologous to nAChR α-ECDs (25% sequence identity with α7), molluscan homopentameric acetylcholine-binding protein (AChBP) and its complexes with various cholinergic ligands, which approached the structure of the nAChR ligand-binding site in atomic detail for the first time. Β. Τhe 4Å electron microscopy (EM) structure of the Torpedo nAChR, which revealed the architecture of the muscle-type nAChR-ECDs and the fivefold symmetry of the receptor. Nevertheless, given the relatively low-resolution, no atomic details for the ligand-binding site could be observed. C. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex of mouse muscle α1-ECD with the nAChR antagonist α-bungarotoxin (α-bgtx), which revealed atomic details for the MIR epitope, the loops A, B and C, forming the principal side of the nAChR ligandbinding pocket and the Cys-loop. However, since the structure of mouse α1-ECD is a monomer, the nAChR ligand-binding site is still missing. D. The high-resolution X-ray crystal structure of a prokaryotic LGIC (ELIC protein) considered to be the ancestor of eukaryotic LGICS, including the nAChR, which revealed the core structure of the LGICs. Apparently, it still remains essential to obtain the structure of a pentameric nAChR-ECD in high-resolution, so as to look deep into the details of the complete nAChR ligand-binding pockets. Neuronal α7 nAChR is a good candidate for achieving this goal, as it forms homopentamers. Furthermore, since α7 nAChR is implicated in neurological diseases and disorders (Alzheimer’s, Parkinson’s, epilepsy, schizophrenia, etc), elucidation of its structure will also lead to the rational drug-design towards these diseases. Furthermore, since the α7-ECD is of the main pharmacological interest as this bears the ligand-binding sites, it seems more realistic to perform crystallization trials on this domain, rather than on the intact α7 nAChR, due to the large hydrophobic transmembrane domains of the latter. Our laboratory has previously expressed the wild-type and a double mutant of human α7-ECD in yeast P. pastoris, with the aim to proceed to their detailed structural analysis. However, the wild-type was expressed in the form of microaggregates and oligomers larger than the expected pentamers, whereas the double mutant, carrying the mutation Cys116Ser and the replacement of its Cys-loop by the more hydrophilic AChBP Cys-loop, appeared to be more soluble than the wild-type and capable of binding α-bgtx with an increased affinity, relatively close to that of the native α7 nAChR. However, this mutant was still aggregationprone to some extent, thus leading to unsuccessful crystallization trials. Therefore, in the present study, we based on the model of human α7-ECD constructed using as templates the X-ray crystal structure of L-AChBP and the electron microscopy structure of the Torpedo nAChR α1-ECD, and introduced several mutations in α7-ECD so as to enhance both its solubility and assembly to pentamers. The hydrophobic amino acid residues found exposed to the environment of α7-ECD model were mutated to less hydrophobic ones, with the aim to reduce the considerably high hydrophobicity of α7-ECD molecules, while various residues facing the interface between two adjacent α7-ECD protomers were mutated to larger or charged residues, with the aim to introduce additional hydrogen or electrostatic bonds with facing residues of the adjacent protomer. Gel filtration and dynamic light scattering analysis for the novel α7-ECD mutants under study, suggested that the mutants carrying mutations in the interface-located amino acid residues were expressed similarly to the wild-type, whereas the mutants carrying the substitution of external hydrophobic residues by less hydrophobic ones, all appeared significantly more water-soluble than the wild-type molecules. Moreover, at least one mutant (mut-10) presented enhanced solubility compared to both the wild type and the previously studied soluble double mutant, as it was expressed exclusively to oligomers close to a pentameric form. Furthermore, it displayed a significantly improved binding affinity for the nAChR antagonist 125I-α-bgtx (Kd = 24 nM), compared to the wild type (Kd = 70 nM) and to the double mutant (Kd = 52 nM), the binding being inhibited by unlabelled α-bungarotoxin, d-tubocurarine or nicotine (Ki = 21.5 nM, Ki = 127 μM, Ki = 17.5 mM, respectively). These values for mut-10 are comparable to those for the native α7 nAChR, denoting its native-like conformation. Circular dichroism (CD) studies on mut-10 suggested a well-defined tertiary structure and special local conformational changes upon binding of several cholinergic ligands. They also revealed a secondary structure composition (~5% α- helix, ~45% β-sheet) similar to that of the homologous Torpedo nAChR-ΕCDs, AChBP and mouse muscle α1-nAChR-ECD. Finally, electron microscopy studies revealed a high degree of homogeneity and well-assembled particles of the expressed mut-10, probably pentameric, with the characteristic formation of the central hole, which in the case of the intact α7 nAChR continues to the central pore. In conclusion, the mutagenesis strategy followed in the current study, towards a crystallisable α7-ECD form, led to the construction and expression of at least one novel mutant (mut-10), which is a promising starting material for atomic-resolution studies, essential for rational drug design towards diseases related to the α7-nAChR. Furthermore, since its deglycosylated form maintained its solubility, ligand-binding properties and secondary structure, it is even more appropriate for crystallization, as it appears to be more homogeneous than the glycosylated molecules. Another aim of the present study was to probe the structure of the α1-, β1-, γ- and ε- ECDs of the human muscle nAChR, previously expressed in yeast P. pastoris, by performing CD studies. These studies demonstrated that the dominant structural feature of all these ECDs is β-sheet structure (~40%) with a small contribution of α-helical content (~5%). This was the first time direct experimental evidence appeared for the secondary structure composition of human nAChR-ECDs, which seems to be in very good agreement with that of the similar Torpedo muscle-type nAChR-ECDs and in considerable, though lower, agreement with that of the less homologous AChBPs. The subsequent structure solution of the α1-ECD of the mouse muscle nAChR in high resolution, further confirmed the native-like conformation of the human muscle nAChR-ECDs expressed in our laboratory, since their secondary structure composition was also in considerable agreement with that of mouse α1-ECD (47% β-sheet; 7% α-helix). The CD studies also suggested well-defined tertiary structures and considerable folding for all human muscle nAChR-ECDs under study, as this was previously implied by biochemical and immunochemical studies. In conclusion, these results strongly suggest that the ECDs of the human muscle nAChR under study fold to a near-native conformation, confirming their suitability for more detailed structural studies and for their use as specific immunoadsorbents in an under development antigen-specific therapeutic strategy to remove pathogenic anti-nAChR antibodies from myasthenic patients’ sera.

Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChRs) είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες ενεργοποιούμενες με τη δέσμευση της ακετυλοχολίνης (ACh). Με κριτήρια, όπως η χημική συγγένεια που εμφανίζουν για σηματοδότικά μόρια και οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες, ταξινομούνται στην ομάδα των νικοτινικών AChRs και στην ομάδα των μουσκαρινικών AChRs. Οι νικοτινικού τύπου υποδοχείς δημιουργούνται από τη συναρμογή πέντε ομόλογων υπομονάδων και υποδιαιρούνται σε μυϊκού τύπου, ευρισκόμενους κυρίως στους σκελετικούς μύες των σπονδυλωτών και σε νευρικού τύπου, απαντώμενους κατά κύριο λόγο στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα. Οι AChRs σχετίζονται με σειρά παθολογικών καταστάσεων, μεταξύ των οποίων και η βαρειά μυασθένεια (Myasthenia Gravis-MG). Η μυασθένεια χαρακτηρίζεται από χρόνια μυϊκή αδυναμία, προκαλούμενη από τη δράση αντισωμάτων υψηλής συγγένειας έναντι του μυϊκού τύπου AChR. Με απώτερο σκοπό τη διερεύνηση της παθογονικότητας των αυτοαντισωμάτων έναντι μεμονωμένων υπομονάδων του AChR, προχωρήσαμε στην παραγωγή ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδικών τμημάτων των υπομονάδων στο ζυμομύκητα Pichia pastoris. Τα πολυπεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν στην παρασκευή χρωματογραφικών-ανοσοπροσροφητικών στηλών, που εφαρμόστηκαν ακολούθως για την απομόνωση αυτοαντισωμάτων από επιλεγμένους ορούς μυασθενικών ατόμων. Η παθογόνος δράση των απομονωμένων αυτοαντισωμάτων ελέχθηκε μέσω της προκαλούμενης απώλειας υποδοχέων (αντιγονική τροποποίηση-antigenic modulation) σε κυτταρική σειρά (ΤΕ671) που εκφράζει τον AChR και μέσω της χορήγησή τους σε πειραματόζωα και τον έλεγχο της εμφάνισης χαρακτηριστικών συμπτωμάτων της νόσου. Εκτενής συγκριτική μελέτη μεταξύ τεσσάρων επιλεγμένων ορών και αντισωμάτων έναντι της α1 και της β υπομονάδας του υποδοχέα, που απομονώθηκαν από τους συγκεκριμένους ορούς, έδειξαν πως τα αυτοαντισώματα ευθύνονται για δράση των ορών στους υποδοχείς των κυττάρων. Τόσο οι ολικοί οροί όσο και τα απομονωμένα-καθαρά αυτοαντισώματα έναντι των υπομονάδων α1 και β, προκάλεσαν δοσοεξαρτώμενη απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα και μάλιστα τα αντι-α1 αντισώματα εμφανίστηκαν περίπου τέσσερις φορές δραστικότερα από τα αντι-β. Η ικανότητα των μερικώς απαλλαγμένων από αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα ορών να προκαλούν απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα, φάνηκε να ποικίλλει και να συσχετίζεται άμεσα με το είδος των αντισωμάτων που έχουν παραμείνει στον ορό, υποστηρίζοντας μια διαφορετικότητα στην παθογονικότητα των επιμέρους αντισωμικών κλασμάτων. Με σκοπό την επιβεβαίωση και ενίσχυση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τα in vitro πειράματα, ακολούθησαν προσπάθειες για την πρόκληση πειραματικής μυασθένειας σε πειραματόζωα, με τη χορήγηση ορών μυασθενικών και καθαρών αυτοαντισωμάτων έναντι διαφόρων υπομονάδων του υποδοχέα. Η χορήγηση σε ζώα τόσο του ολικού ορού, όσο και καθαρών αντισωμάτων έναντι της α1-υπομονάδας του υποδοχέα, προκάλεσαν σημαντική απώλεια βάρους και εμφάνιση έντονων συμπτωμάτων μυϊκής αδυναμίας, μέχρι και το θάνατο. Πειραματόζωα που ενέθηκαν με το κλάσμα του ορού από το οποίο έχουν απομακρυνθεί τα συγκεκριμένα αντισώματα εμφάνισαν πολύ ηπιότερα ή και καθόλου συμπτώματα, ενώ απουσία συμπτωμάτων καταγράφηκε και κατά τη χορήγηση ορού που περιείχε αποκλειστικά αντισώματα έναντι της β υπομονάδας, αλλά και απομονωμένων αντι-β αντισωμάτων. Η παρούσα μελέτη υπέδειξε τα αυτοαντισώματα έναντι του AChR ως τον μοναδικό παθογόνο παράγοντα στον ορό μυασθενικών ατόμων, συμβάλλοντας στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου. Επιβεβαίωσε την υπεροχή των αντι-α1 αντισωμάτων έναντι των αντι-β, ως πρός την παθογονικότητά τους, τόσο in vitro όσο και in vivo, με την επιφύλαξη βέβαια που επιβάλλει ο μικρός αριθμός δειγμάτων που μελετήθηκαν. Η δυνατότητα λήψης αντισωμάτων που στοχεύουν σε συγκεκριμένη υπομονάδα μπορεί να συμβάλλει στη λεπτομερή μελέτη της δραστικότητας του κλάσματος και να οδηγήσει στη συσχέτισή του με την εμφάνιση συγκεκριμένων συμπτωμάτων της νόσου. / Acetylcholine receptors (AChRs) are integral membrane proteins that respond to the binding of acetylcholine (ACh), which is synthesized, stored and finally released by cholinergic neurons. Like other transmembrane receptors, AChRs have been classified according to either their pharmacological properties or their relative affinities for various molecules, and can therefore be further divided into: i) nicotinic AChRs, which are particularly responsive to nicotine and ii) muscarinic AChRs, which are particularly responsive to muscarine. AChRs are involved in myasthenia gravis (MG) and many other physiological disorders, mainly affecting the central and peripheral nervous system. In MG, autoantibodies are directed against the nicotinic AChR at the neuromuscular junction. The disease is characterized by various symptoms, including muscle weakness and fatigability, due to defective neuromuscular transmission. To obtain an insight into the role of the various anti-AChR antibody specificities in MG, we isolated and studied the in vitro and in vivo activity of autoantibodies targeting individual AChR subunits. Using recombinant proteins corresponding to extracellular domains (ECDs) of individual AChR subunits as immunoadsorbents; we isolated autoantibodies which specifically bind to these subunits. We then used the well established TE671 human muscle cell line to examine the in vitro functions of subunit-specific autoantibody populations through their ability to induce nAChR antigenic modulation. Isolated subunit-specific autoantibodies were also used to determine their capacity to passively transfer experimental MG into lab animals. Our results clearly demonstrated that autoantibodies against the α1 or β subunit can cause AChR loss via antigenic modulation in a dose-dependent manner, the anti-α1 autoantibodies being much more effective than the anti-β autoantibodies. Furthermore, we showed that the autoantibody-depleted sera were much less effective, or were completely inactive, at causing AChR loss. In in vivo experiments, the administration of MG sera derivatives to lab animals showed that sera enriched in anti-α1 autoantibodies, as well as the corresponding pure anti-α1 autoantibodies from two individuals, are efficient in inducing MG like symptoms to the animals. A single serum contained almost 100% anti-β antibodies and the corresponding purified antibodies did not cause any clinical MG symptoms. The depleted fraction of MG sera tested, induced mild symptoms or no symptoms were observed, and this is in agreement with the in vitro results, strongly suggesting that the anti-AChR autoantibodies in MG sera and mainly the anti-α1 specificities are the sole pathogenic factor in anti-AChR antibody-seropositive MG.