Um Aussagen über die unterschiedliche Verteilung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren im menschlichen Gehirn bei Gesunden und bei Parkinsonpatienten zu erhalten, wird unter anderem der Radioligand 2-[18F]FA-85380 und die Positronen-Emissions-Tomographie genutzt. In dieser Arbeit wurden aufwendige und weniger aufwendige Auswerteverfahren dieser Untersuchung miteinander verglichen. Die an der Universität Leipzig aktuell am häufigsten verwendete Auswertung mittels dem Verteilungsvolumens nach Logan (DVLogan), wurde mit vereinfachten Ansätzen wie dem SUV (Standardized Uptake Value), TTP (Tissue-to-Plasma) und verschiedenen Ratio-Verfahren (Referenzregionen) verglichen. Die statistische Auswertung der Daten zeigte, dass dieses bereits etablierte Verfahren DVLogan, im Vergleich mit vereinfachten Verfahren am besten geeignet ist, die unterschiedliche Verteilung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren vom Typ α4β2 in vorher festgelegten Hirnregionen bei Parkinsonpatienten und Probanden einer Kontrollgruppe aufzuzeigen.

Allosteric modulators have been proposed as promising new compounds to modify protein function. Allosteric binding sites have been discovered for several G-protein-coupled receptors, including M1-5 muscarinic receptors. Since these receptors play a pivotal role in the regulation of a plethora of organ functions, it is particularly important to investigate the mechanisms of allosteric modulation. To study molecular mechanisms of allosteric modulation in the M2 muscarinic receptor, a new FRET-based sensor was designed. CFP fused to the C-terminus of the receptor and a small fluorescent compound FlAsH, which labels a specific binding sequence in the third intracellular loop, were used as donor and acceptor fluorophores, respectively. The first part of the study was to design a functional FRET receptor sensor. After several optimization steps the constructs FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP and HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP were generated which showed good cell-surface expression, robust changes in FRET and the ability to deliver reproducible data. The second part of this thesis sought to elucidate the mechanisms of the allosteric ligand binding and their effects on the receptor conformation. The described modifications, which were introduced in the wild type M2 mAChR to create the FRET sensor can alter receptor functionality and influence receptor expression. Radioligand binding studies revealed that the used transfection method provided sufficient receptor expression but, unfortunately, about 60 % of the FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP receptor remains in the cytosol. However, this was sufficient to perform FRET experiments. Patch clamp GIRK-measurements with acetylcholine evinced that the new M2-sensor was able to activate Gi-proteins. Also, radioligand-binding assays with the second construct HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP showed ligand affinity comparable to the wildtype receptor. Furthermore inhibition of forskolin-stimulated cAMP production was indistinguishable from the behaviour of the wildtype receptor. According to that, the full functionality of both receptor constructs could be confirmed. FRET measurements with the full muscarinic receptor agonists carbachol and acetylcholine confirmed that the FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP receptor construct showed rapid changes in FRET upon addition of both ligands, which were concentration-dependent. Concentration response curves and the resulting EC50 values of both agonists were similar to those already published in literature. In addition, the orthosteric antagonists atropine and methoctramine inhibited the FRET changes induced by the agonists. This inhibition was significantly faster than the washout kinetics, pointing to an active displacement of the agonists by the antagonists. Allosteric ligands gallamine, tacrine and dimethyl-W84 did not alter receptor conformation when added without an orthosteric ligand. However, when applied in addition to muscarinic agonists, all three substances inhibited the FRET-signal. The extent of this inhibition was dependent on the used concentration of the allosteric ligands. These results reveal that conformational changes brought about by allosteric ligands can be measured with the FRET technique. Furthermore real-time FRET-based kinetic measurements could be performed in living cells and showed that the allosteric ligands gallamine and dimethyl-W84 alter receptor conformation significantly faster than the antagonists atropine and methoctramine. This data indicate that allosteric ligands actively induce the conformational changes in the receptor. / Allosterische Modulatoren, welche es ermöglichen die Funktionen einiger Proteine zu verändern, scheinen eine vielversprechende neue Substanzgruppe zu sein. Bereits bei mehreren GPCR konnten allosterische Bindungsstellen identifiziert werden, so auch in der Gruppe der muscarinischen Acetylcholin-Rezeptoren. Da gerade diese Rezeptorgruppe eine große Rolle im Organismus spielt und dort viele verschiedene Organfunktionen beeinflusst, stellt das Aufdecken der Mechanismen allosterischer Liganden gerade hier ein wichtiges Ziel dar. Um die Mechanismen allosterischer Bindung am M2-muscarinergen Rezeptor auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde ein FRET-Rezeptor Sensor hergestellt. Die GFP-Mutante CFP wurde dazu mit dem C-terminalen Ende des Rezeptors verbunden, und die Bindungssequenz für das FlAsH-Molekül, ein sogenannter Hairpin-binder, wurde in die Aminosäuresequenz der dritten intrazellulären Schleife eingebracht. Diese beiden Fluorophore fungieren als Donor und Akzeptorpaar im FRET-Sensor-Konstrukt. Da es bis jetzt keine Daten zu einem solchen muscarinischen FRET-Rezeptor-Sensor gibt, musste zunächst ein funktionelles Konstrukt erstellt werden. Nach Optimierung von Expression und FRET-Signalstärke gelang es mit den Konstrukten FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP und HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP zwei Sensoren herzustellen, welche den nötigen Anforderungen entsprechen. Im zweiten Teil der Doktorarbeit sollten dann die Mechanismen der allosterischen Rezeptormodifikatoren genauer beleuchtet werden. Durch die extensive Modifikation am M2 mAChR Konstrukt musste zunächst, die Funktionalität des Rezeptors sichergestellt werden. Durch Radioliganden-Bindungs-Experimente stellte sich heraus, dass nach Transfektion der Rezeptor sehr gut in der Zelle exprimiert wird, doch zu 60% im Zellinneren verbleibt. Dies reichte jedoch aus, um FRET-Experimente durchzuführen. Messungen mit der Patch-Clamp Methode zeigten, dass der M2-Rezeptor Sensor in der Lage ist, Gi-Proteine zu aktivieren. Außerdem zeigten Radioliganden Bindungs Assays, dass die Liganden Affinität des zweiten Konstruktes HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP vergleichbar mit der des Wildtyp-Rezeptors ist. Desweiteren ist das Konstrukt weiterhin in der Lage das FRET-Signal von Forskolin-stimulierten cAMP zu inhibieren. Somit scheint die Funktionalität beider Rezeptorkonstrukte, trotz Modifikationen, erhalten geblieben zu sein. FRET-Experimente unter Zugabe der Agonisten Acetylcholin und Carbachol zeigten auf, dass das FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP Rezeptor-Konstrukt konzentrationsabhängige und schnelle Änderungen des FRET-Signals aufweist. Auch die dabei ermittelten Werte der Konzentrations-Wirkungs-Kurven stimmten mit bereits veröffentlichten Werten überein. Die Antagonisten Atropin und Methoctramin führten zu einer Blockade des durch den Agonisten induzierten Signals, welches gleichzeitig schneller als das Auswaschen des Agonisten war. Alleinige Zugabe der gewählten allosterischen Liganden, Gallamin, Tacrin und Dimethyl-W84 änderte das FRET-Signal nicht. Erst durch vorherige Stimulation mit einem orthosterischen Agonisten waren sie in der Lage, das FRET-Signal des Agonisten zu blockieren. Die Stärke dieser Inhibition hing von der Konzentration des jeweiligen allosterischen Liganden ab. Diese Ergebnisse offenbaren, dass die Konformationsänderungen des Rezeptors nach Zugabe eines allosteren Liganden mit der FRET-Methode gemessen werden kann. Darüber hinaus konnte durch kinetische Messungen aufgedeckt werden, dass die allosteren Liganden Gallamin und W84 die Konformation des Rezeptors schneller ändern, als die Antagonisten Atropin und Methoctramin. Dieses Ergebnis bekräftigt die Annahme, dass allosterische Liganden aktiv eine bestimmte Konformationsänderung des Rezeptors herbeiführen.

Ziel der Studie war ein Zusammenhang zwischen cholinerger Innervation in den Basalganglien mit Levodopa-induzierter Dyskinesie darzustellen. 26 Patienten mit idiopatischem Parkinson-Syndrom ohne Demenz und Depression wurden in zwei Gruppen mit und ohne Dyskinesie eingeteilt. Es wurde nach klinischer Untersuchung eine SPECT-Bildgebung mit 5-[123I]iodo-3-[2(S)-2-azetidinylmethoxy]pyridine (5IA) durchgeführt und anschließend die Ergebnisse in Zusammenschau mit den klinischen Daten und mit den Ergebnissen der SPECT mit [123I]N-ω-fluoropropyl-2β-carbomethoxy-3β-(4-iodophenyl)nortropane (FP-CIT) bewertet. Dyskinetische Patienten hatten eine höhere Dichte an nikotinergen Acetylcholinrezeptoren im Nucleus caudatus, hauptsächlich der Halbseite mit stärkerer dopaminerger Degeneration. Dies stützt die Hypothese, dass sich die Dyskinesie nach Levodopa-Therapie aufgrund einer verstärkten cholinergen Modulation im stärker degenerierten Striatum entwickelt. / Objective: To explore cholinergic innervation in the basal ganglia in relation to levodopa-induced dyskinesia in patients with Parkinson’s disease. Methods: A total of 26 patients with PD without dementia and depression were divided into two matched groups (dyskinetic and nondyskinetic). We acquired SPECT scan with 5-[123I]iodo-3-[2(S)-2-azetidinylmethoxy]pyridine. We then analyzed binding potentials at basal ganglia structures and correlations with clinical variables and [123I]N-ω-fluoropropyl-2β-carbomethoxy-3β-(4-iodophenyl)nortropane SPECT. Results: Dyskinetic subjects showed higher density of nicotinic acetylcholine receptors in the caudate nucleus, predominant in the hemisphere with lower dopamine transporter density. Conclusion: Our findings support the hypothesis that the expression of dyskinesia following repeated levodopa exposure may result from enhanced cholinergic neuronal excitability in a dopaminergic-depleted striatum.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

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Um Aussagen über die unterschiedliche Verteilung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren im menschlichen Gehirn bei Gesunden und bei Parkinsonpatienten zu erhalten, wird unter anderem der Radioligand 2-[18F]FA-85380 und die Positronen-Emissions-Tomographie genutzt. In dieser Arbeit wurden aufwendige und weniger aufwendige Auswerteverfahren dieser Untersuchung miteinander verglichen. Die an der Universität Leipzig aktuell am häufigsten verwendete Auswertung mittels dem Verteilungsvolumens nach Logan (DVLogan), wurde mit vereinfachten Ansätzen wie dem SUV (Standardized Uptake Value), TTP (Tissue-to-Plasma) und verschiedenen Ratio-Verfahren (Referenzregionen) verglichen. Die statistische Auswertung der Daten zeigte, dass dieses bereits etablierte Verfahren DVLogan, im Vergleich mit vereinfachten Verfahren am besten geeignet ist, die unterschiedliche Verteilung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren vom Typ α4β2 in vorher festgelegten Hirnregionen bei Parkinsonpatienten und Probanden einer Kontrollgruppe aufzuzeigen.

Die Fetale Akinesia Deformation Sequence (FADS) umfasst ein breites klinisches Spektrum. Dieses reicht von Tot- und Fehlgeburten, fetalen Ödemen bis hin zu Kontrakturen, Pterygien und Atemschwäche. Die Ätiologie der FADS ist sehr heterogen. Der Fokus dieser Forschungsarbeit lag in der Mutationsanalyse in Genen des Acetylcholin-Rezeptor-Pathways. Bekannt war das homozygote missense und nonsense Mutationen in den Genen der fetalen Untereinheit CHRNG des Rezeptors mit dem klinischen Bild des multiple Pterygien-Syndrom (MPS) und Letalen multiplen Pterygien-Syndrom (LMPS) einhergehen. Missense Mutationen in weiteren Genen des AChR-Komplexes präsentieren sich klinisch als Congenitales Myasthenes Syndrom (CMS). Vermutet, aber nicht bewiesen war das homozygote nonsense Mutationen in diesen weiteren Genen letal verlaufen und ursächlich für das letale Pterygiensyndrom sein können. Wir konnten diese Hypothese bestätigen.:1. Einführung in das Thema 1.1. Prävalenz und Relevanz fetaler Bewegungsstörungen und angeborener Kontrakturen 1.2. Das klinische Bild 1.3. Ursachen verminderter fetaler Bewegung 1.4. Der nicotinerge Acetylcholinrezeptor 1.5. Mutationssuche in den Genen der α1-, β1- und δ-Untereinheit (CHRNA1, CHRNB1 und CHRND) sowie in dem Rezeptor assoziierten RAPSN-Gen 2. Publikation 3. Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Darstellung des eigenen wissenschaftlichen Beitrags Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit