A acidúria 3-hidróxiisobutírica é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência da atividade da 3-hidroxiisobutiril-Coenzima A desidrogenase. Acúmulo tecidual e alta excreção urinária do ácido 3- hidroxiisobutírico são as características bioquímicas desta desordem. As manifestações clínicas são heterogêneas, geralmente incluindo achados dismórficos, atraso no desenvolvimento motor, retardo mental severo e encefalopatia aguda. A acidemia láctica também ocorre nos pacientes afetados, indicando que uma disfunção mitochondrial pode estar envolvida na fisiopatogenia desta doença. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisobutírico (0,1; 0,5 e 1,0 mM) sobre a atividade de enzimas essenciais para o metabolismo energético, tais como os complexos I-V da cadeia respiratória, creatina quinase total, citosólica e mitocondrial e Na+, K+-ATPase em homogeneizados de córtex cerebral de ratos de 30 dias de idade. Também medimos o consumo de oxigênio em preparações mitocondriais de cérebro total na presença de ácido 3-hidroxiisobutírico. O ácido 3-hidroxiisobutírico inibiu significativamente o complexo I-III (20%), sem afetar as outras atividades da cadeia respiratória Além disso, o ácido 3-hidroxiisobutírico não alterou o estado III, estado IV e o índice de controle respiratório na presença de glutamato/malato ou sucinato, sugerindo que seu efeito sobre a respiração celular foi de pequena intensidade. Por outro lado as atividades da creatina quinase total e mitocondrial, mas não citosólica, foram inibidas (30%) pelo ácido 3- hidroxiisobutírico. Também verificamos que a inibição provocada por esse ácido sobre a atividade mitocondrial da creatina quinase foi completamente prevenida por pré-incubação dos homogeneizados com glutationa reduzida, α-tocoferol ou a combinação de superóxido desmutase com catalase, indicando que esta inibição foi mediada por oxidações de grupos tióis essenciais para a enzima e provavelmente pelos radicais superóxido, peróxido de hidrogênio e/ou peroxilas. Também demonstramos que a atividade da Na+, K+-ATPase da membrana plasmática sináptica foi marcadamente reduzida (37%) pelo ácido 3-hidroxiisobutírico e que esse efeito foi prevenido pela co-incubação com α-tocoferol, sugerindo que radicais peroxilas estavam provavelmente envolvidos nesta ação. Considerando a importância das atividades enzimáticas afetadas pelo ácido 3-hidroxiisobutírico para o metabolismo cerebral e para a neurotransmissão, sugerimos que os aumentos teciduais das concentrações desse ácido possam contribuir para a neurodegeneração dos pacientes afetados pela acidúria 3-hidroxiisobutírica, e possivelmente expliquem achados prévios de elevada produção e excreção de lactato. / 3-Hydroxyisobutyric aciduria is an inherited metabolic disease caused by 3- hydroxyisobutyryl-CoA dehydrogenase deficiency. Tissue accumulation and high urinary excretion of 3-hydroxyisobutyric acid is the biochemical hallmark of this disorder. Clinical phenotype is heterogeneous and generally includes dysmorphic features, delayed motor development, profound mental impairment, and acute encephalopathy. Lactic acidemia is also found in the affected patients, indicating that mitochondrial dysfunction may be involved in the pathophysiology of this disorder. Therefore, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of 3-hydroxyisobutyric acid (0.1, 0.5 and 1mM) on essential enzymes of energy metabolism, namely the activities of the respiratory chain complexes I-V, total, cytosolic and mitochondrial creatine kinase and Na+, K+-ATPase in cerebral cortex homogenates of 30-day-old rats. We also measured the rate of oxygen consumption in brain mitochondrial preparations in the presence of 3- hydroxyisobutyric acid. 3-Hydroxyisobutyric acid significantly reduced complex I-III (20%), without affecting the other activities of the electron transport chain. Furthermore, 3-hydroxyisobutyric acid did not change state III, state IV and the respiratory control ratio in the presence of glutamate/malate or succinate, suggesting that its effect on cellular respiration was weak. On the other hand, the activities of total and mitochondrial creatine kinase, but not cytosolic creatine kinase, were inhibited (30%) by 3-hydroxyisobutyric acid. We also observed that 3- hydroxyisobutyric acid-induced inhibition of mitochondrial creatine kinase activity was fully prevented by pre-incubation of the homogenates with reduced glutathione, α-tocopherol or the combination of superoxide dismutase plus catalase, suggesting that this inhibition was mediated by oxidation of essential thiol groups of the enzyme probably by superoxide, hydrogen peroxide and/or peroxyl radicals. It was also demonstrated that Na+, K+-ATPase activity from synaptic plasma membranes was markedly suppressed (37 %) by 3-hydroxyisobutyric acid and that this effect was prevented by α-tocopherol co-incubation implying that peroxyl radicals were probably involved in this action. Considering the importance of the affected enzyme activities for brain metabolism homeostasis and neurotransmision, it is suggested that increased tissue levels of 3- hydroxyisobutyric acid may contribute to the neurodegeneration of patients affected by 3-hydroxyisobutyric aciduria and possibly explain previous reports describing elevated production and excretion of lactate.

As acidúrias 3-hidroxi-3-metilgutárica (HMGA) e 3-metilglutacônica (MGTA) são doenças que afetam o catabolismo da leucina e a cetogênese. Os pacientes afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção urinária dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA), 3- metilglutacônico (MGT) e 3-hidroxiisovalérico (OHIVA), ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária de MGT, MGA e OHIVA. Os indivíduos afetados por MGTA apresentam predominantemente sintomas neurológicos. Já os pacientes acometidos pela HMGA também apresentam hepatomegalia, principalmente em situações de descompensação metabólica, quando ocorrem elevações drásticas nas concentrações dos metabólitos acumulados. Considerando que os mecanismos patogênicos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nos pacientes portadores da HMGA e da MGTA são pouco conhecidos, inicialmente investigamos os efeitos in vitro dos ácidos HMG, MGA, MGT e OHIVA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que os metabólitos testados induziram peroxidação lipídica (aumento de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e da quimioluminescência) e dano oxidativo protéico (formação de carbonilas e oxidação de grupamentos sulfidrila). Além disso, a indução de peroxidação lipídica causada pelo HMG e pelo MGT foi prevenida pela adição de antioxidantes. Também foi demonstrado que o HMG, MGA, MGT e OHIVA diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas (diminuição das concentrações de glutationa reduzida (GSH), do potencial antioxidante total e da reatividade antioxidante total) e que a diminuição das concentrações de GSH causada pelo HMG e pelo MGA foi prevenida por antioxidantes. Por outro lado, nenhum dos ácidos orgânicos foi capaz de oxidar grupamentos sulfidrila de uma solução comercial de glutationa e de membranas mitocondriais isoladas de córtex cerebral. Na segunda parte do trabalho, comparamos a vulnerabilidade do estriado cerebral e do fígado ao dano oxidativo causado pelo HMG, MGA, MGT e OHIVA. Verificamos que todos os ácidos orgânicos aumentaram a medida de TBA-RS no estriado, sendo que apenas o HMG, além de apresentar o efeito mais pronunciado, induziu peroxidação lipídica no fígado. Esses metabólitos também diminuíram as concentrações de GSH em estriado. Novamente apenas o HMG reduziu as defesas antioxidantes não-enzimáticas no fígado. Finalmente, nossos resultados demonstraram que o HMG, MGA e o MGT induziram a oxidação de grupamentos sulfidrila em estriado, ao passo que nenhum dos metabólitos alterou esse parâmetro em fígado. Os efeitos detectados no presente estudo demonstram que os ácidos orgânicos acumulados na HMGA e na MGTA induzem estresse oxidativo em córtex cerebral, estriado e fígado de ratos jovens. Também evidencia que os tecidos cerebrais apresentam maior vulnerabilidade que o fígado ao dano oxidativo provocado por esses metabólitos, o que está de acordo com a sintomatologia apresentada pelos pacientes que é predominantemente neurológica. Portanto, presumimos que o estresse oxidativo pode contribuir, ao menos em parte, para a fisiopatologia dos danos teciduais encontrados nos pacientes acometidos pela HMGA e MGTA. / 3-Hydroxy-3-methylglutaric (HMGA) and 3-methylglutaconic (MGTA) acidurias are disorders that affect leucine catabolism and ketogenesis. HMGAaffected patients present tissue accumulation and high urinary excretion of 3- hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA), 3-methylglutaconic (MGT) and 3-hydroxyisovaleric (OHIVA) acids, whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of MGT, MGA and OHIVA. MGTA- and HMGAaffected patients predominantly present neurologic symptoms. HMGA patients also present hepatomegaly, especially during metabolic crisis, which is characterized by a dramatic increase of the concentrations of the accumulating organic acids. Considering that the mechanisms of brain damage in HMGA and MGTA are poorly known, we first investigated the in vitro effects of HMG, MGA, MGT and OHIVA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young rats. We verified that the organic acids induced lipid peroxidation (thiobarbituric-acid reactive species, TBA-RS, and chemiluminescence increase) and protein oxidative damage (carbonyl formation and sulfhydryl oxidation) in cortical supernatants. The lipid peroxidation induced by HMG and MGT was prevented by the addition of free radical scavengers, suggesting that free radicals are involved in these effects. It was also demonstrated that HMG, MGA, MGT and OHIVA reduced non-enzymatic antioxidant defenses (reduced glutathione, GSH, concentrations, total radical-trapping antioxidant potential and total antioxidant reactivity) and that GSH decrease caused by HMG and MGA was prevented by free radical scavengers. On the other hand, the metabolites did not oxidize sulfhydryl groups from a commercial solution of GSH and from purified membrane protein-bound thiol groups, indicating that the decrease of GSH levels caused by the organic acids was not due to a direct oxidative effect. Next, we evaluated the vulnerability of a central (striatum) and a peripheral (liver) tissue to the oxidative damage caused by HMG, MGA, MGT and OHIVA. It can be observed that HMG, MGA, MGT and OHIVA induced lipid peroxidation (TBA-RS increase) in striatum. Among the various acids, only HMG increased TBA-RS in the liver. Furthermore, HMG induced the highest degree of lipid peroxidation in the striatum. It was also verified that the organic acids diminished GSH concentrations. Again, HMG presented the strongest effect compared to the other metabolites, reducing GSH levels in the striatum and in the liver. Finally, we observed that HMG, MGT and MGA reduced the sulfhydryl content (protein oxidation) in the striatum, whereas the metabolites did not alter this parameter in the liver. The present data indicate the HMG, MGA, MGT and OHIVA induce oxidative stress in cerebral cortex, striatum and liver from young rats. It can be also observed that the brain is more vulnerable than liver to lipid and protein oxidative damage induced by these organic acids, which is in agreement with the fact that the patients present predominantly neurologic symptoms. Therefore, it may be presumed that oxidative stress elicited in vitro by HMG, MGA, MGT and OHIVA contributes, at least in part, to the pathophysiology of the brain and hepatic damage found in HMGA and MGTA.

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA. / D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA.

A acidúria 3-hidróxiisobutírica é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência da atividade da 3-hidroxiisobutiril-Coenzima A desidrogenase. Acúmulo tecidual e alta excreção urinária do ácido 3- hidroxiisobutírico são as características bioquímicas desta desordem. As manifestações clínicas são heterogêneas, geralmente incluindo achados dismórficos, atraso no desenvolvimento motor, retardo mental severo e encefalopatia aguda. A acidemia láctica também ocorre nos pacientes afetados, indicando que uma disfunção mitochondrial pode estar envolvida na fisiopatogenia desta doença. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisobutírico (0,1; 0,5 e 1,0 mM) sobre a atividade de enzimas essenciais para o metabolismo energético, tais como os complexos I-V da cadeia respiratória, creatina quinase total, citosólica e mitocondrial e Na+, K+-ATPase em homogeneizados de córtex cerebral de ratos de 30 dias de idade. Também medimos o consumo de oxigênio em preparações mitocondriais de cérebro total na presença de ácido 3-hidroxiisobutírico. O ácido 3-hidroxiisobutírico inibiu significativamente o complexo I-III (20%), sem afetar as outras atividades da cadeia respiratória Além disso, o ácido 3-hidroxiisobutírico não alterou o estado III, estado IV e o índice de controle respiratório na presença de glutamato/malato ou sucinato, sugerindo que seu efeito sobre a respiração celular foi de pequena intensidade. Por outro lado as atividades da creatina quinase total e mitocondrial, mas não citosólica, foram inibidas (30%) pelo ácido 3- hidroxiisobutírico. Também verificamos que a inibição provocada por esse ácido sobre a atividade mitocondrial da creatina quinase foi completamente prevenida por pré-incubação dos homogeneizados com glutationa reduzida, α-tocoferol ou a combinação de superóxido desmutase com catalase, indicando que esta inibição foi mediada por oxidações de grupos tióis essenciais para a enzima e provavelmente pelos radicais superóxido, peróxido de hidrogênio e/ou peroxilas. Também demonstramos que a atividade da Na+, K+-ATPase da membrana plasmática sináptica foi marcadamente reduzida (37%) pelo ácido 3-hidroxiisobutírico e que esse efeito foi prevenido pela co-incubação com α-tocoferol, sugerindo que radicais peroxilas estavam provavelmente envolvidos nesta ação. Considerando a importância das atividades enzimáticas afetadas pelo ácido 3-hidroxiisobutírico para o metabolismo cerebral e para a neurotransmissão, sugerimos que os aumentos teciduais das concentrações desse ácido possam contribuir para a neurodegeneração dos pacientes afetados pela acidúria 3-hidroxiisobutírica, e possivelmente expliquem achados prévios de elevada produção e excreção de lactato. / 3-Hydroxyisobutyric aciduria is an inherited metabolic disease caused by 3- hydroxyisobutyryl-CoA dehydrogenase deficiency. Tissue accumulation and high urinary excretion of 3-hydroxyisobutyric acid is the biochemical hallmark of this disorder. Clinical phenotype is heterogeneous and generally includes dysmorphic features, delayed motor development, profound mental impairment, and acute encephalopathy. Lactic acidemia is also found in the affected patients, indicating that mitochondrial dysfunction may be involved in the pathophysiology of this disorder. Therefore, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of 3-hydroxyisobutyric acid (0.1, 0.5 and 1mM) on essential enzymes of energy metabolism, namely the activities of the respiratory chain complexes I-V, total, cytosolic and mitochondrial creatine kinase and Na+, K+-ATPase in cerebral cortex homogenates of 30-day-old rats. We also measured the rate of oxygen consumption in brain mitochondrial preparations in the presence of 3- hydroxyisobutyric acid. 3-Hydroxyisobutyric acid significantly reduced complex I-III (20%), without affecting the other activities of the electron transport chain. Furthermore, 3-hydroxyisobutyric acid did not change state III, state IV and the respiratory control ratio in the presence of glutamate/malate or succinate, suggesting that its effect on cellular respiration was weak. On the other hand, the activities of total and mitochondrial creatine kinase, but not cytosolic creatine kinase, were inhibited (30%) by 3-hydroxyisobutyric acid. We also observed that 3- hydroxyisobutyric acid-induced inhibition of mitochondrial creatine kinase activity was fully prevented by pre-incubation of the homogenates with reduced glutathione, α-tocopherol or the combination of superoxide dismutase plus catalase, suggesting that this inhibition was mediated by oxidation of essential thiol groups of the enzyme probably by superoxide, hydrogen peroxide and/or peroxyl radicals. It was also demonstrated that Na+, K+-ATPase activity from synaptic plasma membranes was markedly suppressed (37 %) by 3-hydroxyisobutyric acid and that this effect was prevented by α-tocopherol co-incubation implying that peroxyl radicals were probably involved in this action. Considering the importance of the affected enzyme activities for brain metabolism homeostasis and neurotransmision, it is suggested that increased tissue levels of 3- hydroxyisobutyric acid may contribute to the neurodegeneration of patients affected by 3-hydroxyisobutyric aciduria and possibly explain previous reports describing elevated production and excretion of lactate.

As acidúrias 3-hidroxi-3-metilgutárica (HMGA) e 3-metilglutacônica (MGTA) são doenças que afetam o catabolismo da leucina e a cetogênese. Os pacientes afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção urinária dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA), 3- metilglutacônico (MGT) e 3-hidroxiisovalérico (OHIVA), ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária de MGT, MGA e OHIVA. Os indivíduos afetados por MGTA apresentam predominantemente sintomas neurológicos. Já os pacientes acometidos pela HMGA também apresentam hepatomegalia, principalmente em situações de descompensação metabólica, quando ocorrem elevações drásticas nas concentrações dos metabólitos acumulados. Considerando que os mecanismos patogênicos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nos pacientes portadores da HMGA e da MGTA são pouco conhecidos, inicialmente investigamos os efeitos in vitro dos ácidos HMG, MGA, MGT e OHIVA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que os metabólitos testados induziram peroxidação lipídica (aumento de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e da quimioluminescência) e dano oxidativo protéico (formação de carbonilas e oxidação de grupamentos sulfidrila). Além disso, a indução de peroxidação lipídica causada pelo HMG e pelo MGT foi prevenida pela adição de antioxidantes. Também foi demonstrado que o HMG, MGA, MGT e OHIVA diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas (diminuição das concentrações de glutationa reduzida (GSH), do potencial antioxidante total e da reatividade antioxidante total) e que a diminuição das concentrações de GSH causada pelo HMG e pelo MGA foi prevenida por antioxidantes. Por outro lado, nenhum dos ácidos orgânicos foi capaz de oxidar grupamentos sulfidrila de uma solução comercial de glutationa e de membranas mitocondriais isoladas de córtex cerebral. Na segunda parte do trabalho, comparamos a vulnerabilidade do estriado cerebral e do fígado ao dano oxidativo causado pelo HMG, MGA, MGT e OHIVA. Verificamos que todos os ácidos orgânicos aumentaram a medida de TBA-RS no estriado, sendo que apenas o HMG, além de apresentar o efeito mais pronunciado, induziu peroxidação lipídica no fígado. Esses metabólitos também diminuíram as concentrações de GSH em estriado. Novamente apenas o HMG reduziu as defesas antioxidantes não-enzimáticas no fígado. Finalmente, nossos resultados demonstraram que o HMG, MGA e o MGT induziram a oxidação de grupamentos sulfidrila em estriado, ao passo que nenhum dos metabólitos alterou esse parâmetro em fígado. Os efeitos detectados no presente estudo demonstram que os ácidos orgânicos acumulados na HMGA e na MGTA induzem estresse oxidativo em córtex cerebral, estriado e fígado de ratos jovens. Também evidencia que os tecidos cerebrais apresentam maior vulnerabilidade que o fígado ao dano oxidativo provocado por esses metabólitos, o que está de acordo com a sintomatologia apresentada pelos pacientes que é predominantemente neurológica. Portanto, presumimos que o estresse oxidativo pode contribuir, ao menos em parte, para a fisiopatologia dos danos teciduais encontrados nos pacientes acometidos pela HMGA e MGTA. / 3-Hydroxy-3-methylglutaric (HMGA) and 3-methylglutaconic (MGTA) acidurias are disorders that affect leucine catabolism and ketogenesis. HMGAaffected patients present tissue accumulation and high urinary excretion of 3- hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA), 3-methylglutaconic (MGT) and 3-hydroxyisovaleric (OHIVA) acids, whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of MGT, MGA and OHIVA. MGTA- and HMGAaffected patients predominantly present neurologic symptoms. HMGA patients also present hepatomegaly, especially during metabolic crisis, which is characterized by a dramatic increase of the concentrations of the accumulating organic acids. Considering that the mechanisms of brain damage in HMGA and MGTA are poorly known, we first investigated the in vitro effects of HMG, MGA, MGT and OHIVA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young rats. We verified that the organic acids induced lipid peroxidation (thiobarbituric-acid reactive species, TBA-RS, and chemiluminescence increase) and protein oxidative damage (carbonyl formation and sulfhydryl oxidation) in cortical supernatants. The lipid peroxidation induced by HMG and MGT was prevented by the addition of free radical scavengers, suggesting that free radicals are involved in these effects. It was also demonstrated that HMG, MGA, MGT and OHIVA reduced non-enzymatic antioxidant defenses (reduced glutathione, GSH, concentrations, total radical-trapping antioxidant potential and total antioxidant reactivity) and that GSH decrease caused by HMG and MGA was prevented by free radical scavengers. On the other hand, the metabolites did not oxidize sulfhydryl groups from a commercial solution of GSH and from purified membrane protein-bound thiol groups, indicating that the decrease of GSH levels caused by the organic acids was not due to a direct oxidative effect. Next, we evaluated the vulnerability of a central (striatum) and a peripheral (liver) tissue to the oxidative damage caused by HMG, MGA, MGT and OHIVA. It can be observed that HMG, MGA, MGT and OHIVA induced lipid peroxidation (TBA-RS increase) in striatum. Among the various acids, only HMG increased TBA-RS in the liver. Furthermore, HMG induced the highest degree of lipid peroxidation in the striatum. It was also verified that the organic acids diminished GSH concentrations. Again, HMG presented the strongest effect compared to the other metabolites, reducing GSH levels in the striatum and in the liver. Finally, we observed that HMG, MGT and MGA reduced the sulfhydryl content (protein oxidation) in the striatum, whereas the metabolites did not alter this parameter in the liver. The present data indicate the HMG, MGA, MGT and OHIVA induce oxidative stress in cerebral cortex, striatum and liver from young rats. It can be also observed that the brain is more vulnerable than liver to lipid and protein oxidative damage induced by these organic acids, which is in agreement with the fact that the patients present predominantly neurologic symptoms. Therefore, it may be presumed that oxidative stress elicited in vitro by HMG, MGA, MGT and OHIVA contributes, at least in part, to the pathophysiology of the brain and hepatic damage found in HMGA and MGTA.