As acidúrias 3-hidroxi-3-metilgutárica (HMGA) e 3-metilglutacônica (MGTA) são doenças que afetam o catabolismo da leucina e a cetogênese. Os pacientes afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção urinária dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA), 3- metilglutacônico (MGT) e 3-hidroxiisovalérico (OHIVA), ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária de MGT, MGA e OHIVA. Os indivíduos afetados por MGTA apresentam predominantemente sintomas neurológicos. Já os pacientes acometidos pela HMGA também apresentam hepatomegalia, principalmente em situações de descompensação metabólica, quando ocorrem elevações drásticas nas concentrações dos metabólitos acumulados. Considerando que os mecanismos patogênicos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nos pacientes portadores da HMGA e da MGTA são pouco conhecidos, inicialmente investigamos os efeitos in vitro dos ácidos HMG, MGA, MGT e OHIVA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que os metabólitos testados induziram peroxidação lipídica (aumento de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e da quimioluminescência) e dano oxidativo protéico (formação de carbonilas e oxidação de grupamentos sulfidrila). Além disso, a indução de peroxidação lipídica causada pelo HMG e pelo MGT foi prevenida pela adição de antioxidantes. Também foi demonstrado que o HMG, MGA, MGT e OHIVA diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas (diminuição das concentrações de glutationa reduzida (GSH), do potencial antioxidante total e da reatividade antioxidante total) e que a diminuição das concentrações de GSH causada pelo HMG e pelo MGA foi prevenida por antioxidantes. Por outro lado, nenhum dos ácidos orgânicos foi capaz de oxidar grupamentos sulfidrila de uma solução comercial de glutationa e de membranas mitocondriais isoladas de córtex cerebral. Na segunda parte do trabalho, comparamos a vulnerabilidade do estriado cerebral e do fígado ao dano oxidativo causado pelo HMG, MGA, MGT e OHIVA. Verificamos que todos os ácidos orgânicos aumentaram a medida de TBA-RS no estriado, sendo que apenas o HMG, além de apresentar o efeito mais pronunciado, induziu peroxidação lipídica no fígado. Esses metabólitos também diminuíram as concentrações de GSH em estriado. Novamente apenas o HMG reduziu as defesas antioxidantes não-enzimáticas no fígado. Finalmente, nossos resultados demonstraram que o HMG, MGA e o MGT induziram a oxidação de grupamentos sulfidrila em estriado, ao passo que nenhum dos metabólitos alterou esse parâmetro em fígado. Os efeitos detectados no presente estudo demonstram que os ácidos orgânicos acumulados na HMGA e na MGTA induzem estresse oxidativo em córtex cerebral, estriado e fígado de ratos jovens. Também evidencia que os tecidos cerebrais apresentam maior vulnerabilidade que o fígado ao dano oxidativo provocado por esses metabólitos, o que está de acordo com a sintomatologia apresentada pelos pacientes que é predominantemente neurológica. Portanto, presumimos que o estresse oxidativo pode contribuir, ao menos em parte, para a fisiopatologia dos danos teciduais encontrados nos pacientes acometidos pela HMGA e MGTA. / 3-Hydroxy-3-methylglutaric (HMGA) and 3-methylglutaconic (MGTA) acidurias are disorders that affect leucine catabolism and ketogenesis. HMGAaffected patients present tissue accumulation and high urinary excretion of 3- hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA), 3-methylglutaconic (MGT) and 3-hydroxyisovaleric (OHIVA) acids, whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of MGT, MGA and OHIVA. MGTA- and HMGAaffected patients predominantly present neurologic symptoms. HMGA patients also present hepatomegaly, especially during metabolic crisis, which is characterized by a dramatic increase of the concentrations of the accumulating organic acids. Considering that the mechanisms of brain damage in HMGA and MGTA are poorly known, we first investigated the in vitro effects of HMG, MGA, MGT and OHIVA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young rats. We verified that the organic acids induced lipid peroxidation (thiobarbituric-acid reactive species, TBA-RS, and chemiluminescence increase) and protein oxidative damage (carbonyl formation and sulfhydryl oxidation) in cortical supernatants. The lipid peroxidation induced by HMG and MGT was prevented by the addition of free radical scavengers, suggesting that free radicals are involved in these effects. It was also demonstrated that HMG, MGA, MGT and OHIVA reduced non-enzymatic antioxidant defenses (reduced glutathione, GSH, concentrations, total radical-trapping antioxidant potential and total antioxidant reactivity) and that GSH decrease caused by HMG and MGA was prevented by free radical scavengers. On the other hand, the metabolites did not oxidize sulfhydryl groups from a commercial solution of GSH and from purified membrane protein-bound thiol groups, indicating that the decrease of GSH levels caused by the organic acids was not due to a direct oxidative effect. Next, we evaluated the vulnerability of a central (striatum) and a peripheral (liver) tissue to the oxidative damage caused by HMG, MGA, MGT and OHIVA. It can be observed that HMG, MGA, MGT and OHIVA induced lipid peroxidation (TBA-RS increase) in striatum. Among the various acids, only HMG increased TBA-RS in the liver. Furthermore, HMG induced the highest degree of lipid peroxidation in the striatum. It was also verified that the organic acids diminished GSH concentrations. Again, HMG presented the strongest effect compared to the other metabolites, reducing GSH levels in the striatum and in the liver. Finally, we observed that HMG, MGT and MGA reduced the sulfhydryl content (protein oxidation) in the striatum, whereas the metabolites did not alter this parameter in the liver. The present data indicate the HMG, MGA, MGT and OHIVA induce oxidative stress in cerebral cortex, striatum and liver from young rats. It can be also observed that the brain is more vulnerable than liver to lipid and protein oxidative damage induced by these organic acids, which is in agreement with the fact that the patients present predominantly neurologic symptoms. Therefore, it may be presumed that oxidative stress elicited in vitro by HMG, MGA, MGT and OHIVA contributes, at least in part, to the pathophysiology of the brain and hepatic damage found in HMGA and MGTA.

As acidúrias 3-hidroxi-3-metilgutárica (HMGA) e 3-metilglutacônica (MGTA) são doenças que afetam o catabolismo da leucina e a cetogênese. Os pacientes afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção urinária dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA), 3- metilglutacônico (MGT) e 3-hidroxiisovalérico (OHIVA), ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária de MGT, MGA e OHIVA. Os indivíduos afetados por MGTA apresentam predominantemente sintomas neurológicos. Já os pacientes acometidos pela HMGA também apresentam hepatomegalia, principalmente em situações de descompensação metabólica, quando ocorrem elevações drásticas nas concentrações dos metabólitos acumulados. Considerando que os mecanismos patogênicos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nos pacientes portadores da HMGA e da MGTA são pouco conhecidos, inicialmente investigamos os efeitos in vitro dos ácidos HMG, MGA, MGT e OHIVA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que os metabólitos testados induziram peroxidação lipídica (aumento de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e da quimioluminescência) e dano oxidativo protéico (formação de carbonilas e oxidação de grupamentos sulfidrila). Além disso, a indução de peroxidação lipídica causada pelo HMG e pelo MGT foi prevenida pela adição de antioxidantes. Também foi demonstrado que o HMG, MGA, MGT e OHIVA diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas (diminuição das concentrações de glutationa reduzida (GSH), do potencial antioxidante total e da reatividade antioxidante total) e que a diminuição das concentrações de GSH causada pelo HMG e pelo MGA foi prevenida por antioxidantes. Por outro lado, nenhum dos ácidos orgânicos foi capaz de oxidar grupamentos sulfidrila de uma solução comercial de glutationa e de membranas mitocondriais isoladas de córtex cerebral. Na segunda parte do trabalho, comparamos a vulnerabilidade do estriado cerebral e do fígado ao dano oxidativo causado pelo HMG, MGA, MGT e OHIVA. Verificamos que todos os ácidos orgânicos aumentaram a medida de TBA-RS no estriado, sendo que apenas o HMG, além de apresentar o efeito mais pronunciado, induziu peroxidação lipídica no fígado. Esses metabólitos também diminuíram as concentrações de GSH em estriado. Novamente apenas o HMG reduziu as defesas antioxidantes não-enzimáticas no fígado. Finalmente, nossos resultados demonstraram que o HMG, MGA e o MGT induziram a oxidação de grupamentos sulfidrila em estriado, ao passo que nenhum dos metabólitos alterou esse parâmetro em fígado. Os efeitos detectados no presente estudo demonstram que os ácidos orgânicos acumulados na HMGA e na MGTA induzem estresse oxidativo em córtex cerebral, estriado e fígado de ratos jovens. Também evidencia que os tecidos cerebrais apresentam maior vulnerabilidade que o fígado ao dano oxidativo provocado por esses metabólitos, o que está de acordo com a sintomatologia apresentada pelos pacientes que é predominantemente neurológica. Portanto, presumimos que o estresse oxidativo pode contribuir, ao menos em parte, para a fisiopatologia dos danos teciduais encontrados nos pacientes acometidos pela HMGA e MGTA. / 3-Hydroxy-3-methylglutaric (HMGA) and 3-methylglutaconic (MGTA) acidurias are disorders that affect leucine catabolism and ketogenesis. HMGAaffected patients present tissue accumulation and high urinary excretion of 3- hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA), 3-methylglutaconic (MGT) and 3-hydroxyisovaleric (OHIVA) acids, whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of MGT, MGA and OHIVA. MGTA- and HMGAaffected patients predominantly present neurologic symptoms. HMGA patients also present hepatomegaly, especially during metabolic crisis, which is characterized by a dramatic increase of the concentrations of the accumulating organic acids. Considering that the mechanisms of brain damage in HMGA and MGTA are poorly known, we first investigated the in vitro effects of HMG, MGA, MGT and OHIVA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young rats. We verified that the organic acids induced lipid peroxidation (thiobarbituric-acid reactive species, TBA-RS, and chemiluminescence increase) and protein oxidative damage (carbonyl formation and sulfhydryl oxidation) in cortical supernatants. The lipid peroxidation induced by HMG and MGT was prevented by the addition of free radical scavengers, suggesting that free radicals are involved in these effects. It was also demonstrated that HMG, MGA, MGT and OHIVA reduced non-enzymatic antioxidant defenses (reduced glutathione, GSH, concentrations, total radical-trapping antioxidant potential and total antioxidant reactivity) and that GSH decrease caused by HMG and MGA was prevented by free radical scavengers. On the other hand, the metabolites did not oxidize sulfhydryl groups from a commercial solution of GSH and from purified membrane protein-bound thiol groups, indicating that the decrease of GSH levels caused by the organic acids was not due to a direct oxidative effect. Next, we evaluated the vulnerability of a central (striatum) and a peripheral (liver) tissue to the oxidative damage caused by HMG, MGA, MGT and OHIVA. It can be observed that HMG, MGA, MGT and OHIVA induced lipid peroxidation (TBA-RS increase) in striatum. Among the various acids, only HMG increased TBA-RS in the liver. Furthermore, HMG induced the highest degree of lipid peroxidation in the striatum. It was also verified that the organic acids diminished GSH concentrations. Again, HMG presented the strongest effect compared to the other metabolites, reducing GSH levels in the striatum and in the liver. Finally, we observed that HMG, MGT and MGA reduced the sulfhydryl content (protein oxidation) in the striatum, whereas the metabolites did not alter this parameter in the liver. The present data indicate the HMG, MGA, MGT and OHIVA induce oxidative stress in cerebral cortex, striatum and liver from young rats. It can be also observed that the brain is more vulnerable than liver to lipid and protein oxidative damage induced by these organic acids, which is in agreement with the fact that the patients present predominantly neurologic symptoms. Therefore, it may be presumed that oxidative stress elicited in vitro by HMG, MGA, MGT and OHIVA contributes, at least in part, to the pathophysiology of the brain and hepatic damage found in HMGA and MGTA.

As acidúrias 3-hidroxi-3-metilgutárica (HMGA) e 3-metilglutacônica (MGTA) são doenças que afetam o catabolismo da leucina e a cetogênese. Os pacientes afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção urinária dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA), 3- metilglutacônico (MGT) e 3-hidroxiisovalérico (OHIVA), ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária de MGT, MGA e OHIVA. Os indivíduos afetados por MGTA apresentam predominantemente sintomas neurológicos. Já os pacientes acometidos pela HMGA também apresentam hepatomegalia, principalmente em situações de descompensação metabólica, quando ocorrem elevações drásticas nas concentrações dos metabólitos acumulados. Considerando que os mecanismos patogênicos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nos pacientes portadores da HMGA e da MGTA são pouco conhecidos, inicialmente investigamos os efeitos in vitro dos ácidos HMG, MGA, MGT e OHIVA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que os metabólitos testados induziram peroxidação lipídica (aumento de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e da quimioluminescência) e dano oxidativo protéico (formação de carbonilas e oxidação de grupamentos sulfidrila). Além disso, a indução de peroxidação lipídica causada pelo HMG e pelo MGT foi prevenida pela adição de antioxidantes. Também foi demonstrado que o HMG, MGA, MGT e OHIVA diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas (diminuição das concentrações de glutationa reduzida (GSH), do potencial antioxidante total e da reatividade antioxidante total) e que a diminuição das concentrações de GSH causada pelo HMG e pelo MGA foi prevenida por antioxidantes. Por outro lado, nenhum dos ácidos orgânicos foi capaz de oxidar grupamentos sulfidrila de uma solução comercial de glutationa e de membranas mitocondriais isoladas de córtex cerebral. Na segunda parte do trabalho, comparamos a vulnerabilidade do estriado cerebral e do fígado ao dano oxidativo causado pelo HMG, MGA, MGT e OHIVA. Verificamos que todos os ácidos orgânicos aumentaram a medida de TBA-RS no estriado, sendo que apenas o HMG, além de apresentar o efeito mais pronunciado, induziu peroxidação lipídica no fígado. Esses metabólitos também diminuíram as concentrações de GSH em estriado. Novamente apenas o HMG reduziu as defesas antioxidantes não-enzimáticas no fígado. Finalmente, nossos resultados demonstraram que o HMG, MGA e o MGT induziram a oxidação de grupamentos sulfidrila em estriado, ao passo que nenhum dos metabólitos alterou esse parâmetro em fígado. Os efeitos detectados no presente estudo demonstram que os ácidos orgânicos acumulados na HMGA e na MGTA induzem estresse oxidativo em córtex cerebral, estriado e fígado de ratos jovens. Também evidencia que os tecidos cerebrais apresentam maior vulnerabilidade que o fígado ao dano oxidativo provocado por esses metabólitos, o que está de acordo com a sintomatologia apresentada pelos pacientes que é predominantemente neurológica. Portanto, presumimos que o estresse oxidativo pode contribuir, ao menos em parte, para a fisiopatologia dos danos teciduais encontrados nos pacientes acometidos pela HMGA e MGTA. / 3-Hydroxy-3-methylglutaric (HMGA) and 3-methylglutaconic (MGTA) acidurias are disorders that affect leucine catabolism and ketogenesis. HMGAaffected patients present tissue accumulation and high urinary excretion of 3- hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA), 3-methylglutaconic (MGT) and 3-hydroxyisovaleric (OHIVA) acids, whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of MGT, MGA and OHIVA. MGTA- and HMGAaffected patients predominantly present neurologic symptoms. HMGA patients also present hepatomegaly, especially during metabolic crisis, which is characterized by a dramatic increase of the concentrations of the accumulating organic acids. Considering that the mechanisms of brain damage in HMGA and MGTA are poorly known, we first investigated the in vitro effects of HMG, MGA, MGT and OHIVA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young rats. We verified that the organic acids induced lipid peroxidation (thiobarbituric-acid reactive species, TBA-RS, and chemiluminescence increase) and protein oxidative damage (carbonyl formation and sulfhydryl oxidation) in cortical supernatants. The lipid peroxidation induced by HMG and MGT was prevented by the addition of free radical scavengers, suggesting that free radicals are involved in these effects. It was also demonstrated that HMG, MGA, MGT and OHIVA reduced non-enzymatic antioxidant defenses (reduced glutathione, GSH, concentrations, total radical-trapping antioxidant potential and total antioxidant reactivity) and that GSH decrease caused by HMG and MGA was prevented by free radical scavengers. On the other hand, the metabolites did not oxidize sulfhydryl groups from a commercial solution of GSH and from purified membrane protein-bound thiol groups, indicating that the decrease of GSH levels caused by the organic acids was not due to a direct oxidative effect. Next, we evaluated the vulnerability of a central (striatum) and a peripheral (liver) tissue to the oxidative damage caused by HMG, MGA, MGT and OHIVA. It can be observed that HMG, MGA, MGT and OHIVA induced lipid peroxidation (TBA-RS increase) in striatum. Among the various acids, only HMG increased TBA-RS in the liver. Furthermore, HMG induced the highest degree of lipid peroxidation in the striatum. It was also verified that the organic acids diminished GSH concentrations. Again, HMG presented the strongest effect compared to the other metabolites, reducing GSH levels in the striatum and in the liver. Finally, we observed that HMG, MGT and MGA reduced the sulfhydryl content (protein oxidation) in the striatum, whereas the metabolites did not alter this parameter in the liver. The present data indicate the HMG, MGA, MGT and OHIVA induce oxidative stress in cerebral cortex, striatum and liver from young rats. It can be also observed that the brain is more vulnerable than liver to lipid and protein oxidative damage induced by these organic acids, which is in agreement with the fact that the patients present predominantly neurologic symptoms. Therefore, it may be presumed that oxidative stress elicited in vitro by HMG, MGA, MGT and OHIVA contributes, at least in part, to the pathophysiology of the brain and hepatic damage found in HMGA and MGTA.

(OMIM 246450), também conhecida por acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica (HMGA), é um distúrbio genético caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo predominante dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA) e 3-metilglutacônico (MGT), bem como em menor grau do ácido 3- hidroxiisovalérico em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves e anormalidades no córtex cerebral e gânglios da base cuja fisiopatogenia é pouco conhecida. No presente estudo investigamos os efeitos dos principais metabólitos acumulados na HMGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em estriado de ratos injetados com esses compostos e em astrócitos cultivados de córtex cerebral, bem como sobre a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de estriado e córtex cerebral de ratos com 30 dias de idade. Assim, estudamos inicialmente os efeitos da administração intrastriatal de HMG e MGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em ratos em desenvolvimento. Nossos resultados demonstram que o HMG e o MGA induziram dano oxidativo em lipídios e proteínas. Os dois ácidos também aumentaram a oxidação da 2'- 7'-diclorofluorescina (DCFH), ao passo que apenas o HMG induziu a produção de óxido nítrico. Em relação às defesas antioxidantes o HMG e o MGA provocaram uma diminuição das concentrações de glutationa reduzida e das atividades da superóxido dismutase e glutationa redutase, bem como um aumento da atividade da glutationa peroxidase. Já o HMG também causou um aumento de atividade da catalase e uma diminuição da atividade da glicose-6- fosfato desidrogenase. Finalmente observou-se que antioxidantes preveniram completamente ou atenuaram as alterações dos parâmetros de estresse oxidativo causadas pelo HMG, reforçando a participação de espécies reativas nesses efeitos. Observou-se também que MK-801, um antagonista nãocompetitivo do receptor glutamatérgico do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), preveniu alguns dos efeitos provocados pelo HMG, indicando o envolvimento do receptor NMDA no desequilíbrio redox causado por esse metabólito. Tendo em vista que os astrócitos são importantes para proteção neuronal e são susceptíveis a danos por neurotoxinas, o passo seguinte de nossa investigação foi determinar os efeitos do HMG e MGA sobre parâmetros importantes da homeostase redox e produção de citocinas em astrócitos corticais cultivados. Ambos os ácidos orgânicos reduziram a função mitocondrial astrocitária sem alterarem a viabilidade celular e também diminuíram as concentrações de glutationa reduzida. Em contrapartida, ambos metabólitos aumentaram a formação de espécies reativas (oxidação da DCFH) e também provocaram um aumento na liberação das IL-1β, IL-6 e TNFα através da via de sinalização de Erk. Finalmente investigamos os efeitos do HMG, MGA e MGT sobre a fosforilação da GFAP e subunidades NFL, NFM e NFH dos neurofilamentos (NF) em fatias de estriado e de córtex cerebral. Nossos resultados demonstraram que o HMG, o MGA e o MGT provocaram uma hipofosforilação da GFAP e todas as subunidades dos NF nas duas estruturas cerebrais. Verificamos ainda que a hipofosoforilação induzida por HMG nas proteínas do citoesqueleto foi mediada pela inibição das proteínas cinases, sem alterações de proteínas fosfatases. Assim, demonstramos que uma inibição da PKA estaria envolvida na hipofosforilação da Ser55 na região aminoterminal da NFL, 3 bem como uma inibição da JNK, resultaria na hipofosforilação das repetições do tipo KSP na região carboxiterminal das subunidades NFM e NFH. Observou-se também que a hipofosforilação do citoesqueleto era dependente dos receptores glutamatérgicos sinápticos e extrasinápticos (subunidade NR2B) do tipo NMDA e também do íon Ca2+. Além disso, o inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME, e o antioxidante TROLOX (análogo hidrosolúvel da vitamina E) preveniram completamente a hipofosforilação e a inibição das atividades da PKA e da JNK causada pelo HMG. Podemos então presumir que, os presentes dados fornecem evidências sólidas de que o estresse oxidativo induzido pelo HMG e MGA em estriados de ratos e em astrócitos corticais cultivados, além de uma resposta inflamatória evidenciada nessas células neurais e uma hipofosoforilação em proteínas do citoesqueleto possam representar mecanismos patológicos importantes que contribuem, ao menos em parte, com as alterações cerebrais observadas nos pacientes afetados pela deficiência da HL. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (HL) deficiency, also known as 3- hydroxy-3-methylglutaric aciduria (HMGA) is a genetic disorder biochemically characterized by predominant accumulation of 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA) and 3-methylglutaconic (MGT), as well as lesser amounts of 3-methylglutaconic and 3-hydroxyisovaleric acids in tissues and biological fluids of affected individuals. Clinically, the patients present neurological symptoms and basal ganglia injury, whose pathomechanisms are partially understood. In the present study, we investigated the effects of the main metabolites accumulating in HMGA on important parameters of oxidative stress in intrastriatally injected rats, in cortical cultured astrocytes, as well as on the phosphorylation of striatal and cortical cytoskeletal proteins of 30 day old rats. Thus, we first investigated the effects of the intrastiatal administration of HMG and MGA on important parameters of oxidative stress in developing rats. Our results demonstrate that HMG and MGA induced lipid and protein oxidative damage. HMG and MGA also increased 2',7'-dichlorofluorescein oxidation, whereas only HMG elicited nitric oxide production. Regarding the antioxidant defenses, both organic acids decreased reduced glutathione concentrations and the activities of superoxide dismutase and glutathione reductase and increased glutathione peroxidase activity. HMG also provoked an increase of catalase activity and a diminution of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. We finally observed that antioxidants fully prevented or attenuated HMG-induced alterations of the oxidative stress parameters, further indicating the participation of reactive species in these effects. We also observed that MK- 801, a non-competitive antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, prevented some of these effects, indicating the involvement of the NMDA receptor in the redox imbalance provoked HMG effects. Considering that astrocytes are important for neuronal protection and are susceptible to damage by neurotoxins the next step of this work was investigated the effects of HMG and MGA on important parameters of redox homeostasis and cytokine production in cortical cultured astrocytes. Both organic acids decreased astrocytic mitochondrial function withouth altering cell viability, and also decreased the concentrations of reduced glutathione. In contrast, they increased reactive species formation (DCFH oxidation) and also provoked a significant increase of IL-1, IL-6 and TNFα release through the Erk signaling pathway. Finally, we investigated the effects of HMG, MGA and MGT on the phosphorylation of GFAP and the neurofilaments (NF) subunits NFL, NFM and NFH in striatal and cortical slices. Our results demonstrated that HMG, MGA and MGT caused hypophosphorylation of GFAP and of all NF subunits in both cerebral structures. We also found that the HMG-induced hypophosphorylation on the cytoskeletal proteins was mediated by the inhibition of protein kinases without altering protein phosphatases. Thus, we demonstrated that PKA inhibition was involved in the hypophosphorylation of Ser55 in the amino terminal region of NFL, as well as JNK inhibition resulting in the hypophosphorylation of KSPrepeats in the carboxyl terminal region of NFM and NFH subunits. It was also observed that the cytoskeletal hypophosphorylation was dependent on synaptic and extra synaptic (NR2B subunit) NMDA glutamatergic receptors and also on Ca2+. Furthermore, the nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME, and the antioxidant TROLOX (polar analog of 5 vitamin E) fully prevented the hypophosphorylation and the inhibition of PKA and JNK activities caused by HMG. We can then presume that all these data provide solid evidence that oxidative stress induced by HMG and MGA in rat striatum and cortical cultured astrocytes, beyond of a inflamatory response verified in this neural cell type and an hypophosphorylation of cytoskeletal proteins could represent important pathomechanisms that contribute, at least in part, the cerebral alterations observed in the patients afected by the HL deficiency.

(OMIM 246450), também conhecida por acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica (HMGA), é um distúrbio genético caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo predominante dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA) e 3-metilglutacônico (MGT), bem como em menor grau do ácido 3- hidroxiisovalérico em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves e anormalidades no córtex cerebral e gânglios da base cuja fisiopatogenia é pouco conhecida. No presente estudo investigamos os efeitos dos principais metabólitos acumulados na HMGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em estriado de ratos injetados com esses compostos e em astrócitos cultivados de córtex cerebral, bem como sobre a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de estriado e córtex cerebral de ratos com 30 dias de idade. Assim, estudamos inicialmente os efeitos da administração intrastriatal de HMG e MGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em ratos em desenvolvimento. Nossos resultados demonstram que o HMG e o MGA induziram dano oxidativo em lipídios e proteínas. Os dois ácidos também aumentaram a oxidação da 2'- 7'-diclorofluorescina (DCFH), ao passo que apenas o HMG induziu a produção de óxido nítrico. Em relação às defesas antioxidantes o HMG e o MGA provocaram uma diminuição das concentrações de glutationa reduzida e das atividades da superóxido dismutase e glutationa redutase, bem como um aumento da atividade da glutationa peroxidase. Já o HMG também causou um aumento de atividade da catalase e uma diminuição da atividade da glicose-6- fosfato desidrogenase. Finalmente observou-se que antioxidantes preveniram completamente ou atenuaram as alterações dos parâmetros de estresse oxidativo causadas pelo HMG, reforçando a participação de espécies reativas nesses efeitos. Observou-se também que MK-801, um antagonista nãocompetitivo do receptor glutamatérgico do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), preveniu alguns dos efeitos provocados pelo HMG, indicando o envolvimento do receptor NMDA no desequilíbrio redox causado por esse metabólito. Tendo em vista que os astrócitos são importantes para proteção neuronal e são susceptíveis a danos por neurotoxinas, o passo seguinte de nossa investigação foi determinar os efeitos do HMG e MGA sobre parâmetros importantes da homeostase redox e produção de citocinas em astrócitos corticais cultivados. Ambos os ácidos orgânicos reduziram a função mitocondrial astrocitária sem alterarem a viabilidade celular e também diminuíram as concentrações de glutationa reduzida. Em contrapartida, ambos metabólitos aumentaram a formação de espécies reativas (oxidação da DCFH) e também provocaram um aumento na liberação das IL-1β, IL-6 e TNFα através da via de sinalização de Erk. Finalmente investigamos os efeitos do HMG, MGA e MGT sobre a fosforilação da GFAP e subunidades NFL, NFM e NFH dos neurofilamentos (NF) em fatias de estriado e de córtex cerebral. Nossos resultados demonstraram que o HMG, o MGA e o MGT provocaram uma hipofosforilação da GFAP e todas as subunidades dos NF nas duas estruturas cerebrais. Verificamos ainda que a hipofosoforilação induzida por HMG nas proteínas do citoesqueleto foi mediada pela inibição das proteínas cinases, sem alterações de proteínas fosfatases. Assim, demonstramos que uma inibição da PKA estaria envolvida na hipofosforilação da Ser55 na região aminoterminal da NFL, 3 bem como uma inibição da JNK, resultaria na hipofosforilação das repetições do tipo KSP na região carboxiterminal das subunidades NFM e NFH. Observou-se também que a hipofosforilação do citoesqueleto era dependente dos receptores glutamatérgicos sinápticos e extrasinápticos (subunidade NR2B) do tipo NMDA e também do íon Ca2+. Além disso, o inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME, e o antioxidante TROLOX (análogo hidrosolúvel da vitamina E) preveniram completamente a hipofosforilação e a inibição das atividades da PKA e da JNK causada pelo HMG. Podemos então presumir que, os presentes dados fornecem evidências sólidas de que o estresse oxidativo induzido pelo HMG e MGA em estriados de ratos e em astrócitos corticais cultivados, além de uma resposta inflamatória evidenciada nessas células neurais e uma hipofosoforilação em proteínas do citoesqueleto possam representar mecanismos patológicos importantes que contribuem, ao menos em parte, com as alterações cerebrais observadas nos pacientes afetados pela deficiência da HL. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (HL) deficiency, also known as 3- hydroxy-3-methylglutaric aciduria (HMGA) is a genetic disorder biochemically characterized by predominant accumulation of 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA) and 3-methylglutaconic (MGT), as well as lesser amounts of 3-methylglutaconic and 3-hydroxyisovaleric acids in tissues and biological fluids of affected individuals. Clinically, the patients present neurological symptoms and basal ganglia injury, whose pathomechanisms are partially understood. In the present study, we investigated the effects of the main metabolites accumulating in HMGA on important parameters of oxidative stress in intrastriatally injected rats, in cortical cultured astrocytes, as well as on the phosphorylation of striatal and cortical cytoskeletal proteins of 30 day old rats. Thus, we first investigated the effects of the intrastiatal administration of HMG and MGA on important parameters of oxidative stress in developing rats. Our results demonstrate that HMG and MGA induced lipid and protein oxidative damage. HMG and MGA also increased 2',7'-dichlorofluorescein oxidation, whereas only HMG elicited nitric oxide production. Regarding the antioxidant defenses, both organic acids decreased reduced glutathione concentrations and the activities of superoxide dismutase and glutathione reductase and increased glutathione peroxidase activity. HMG also provoked an increase of catalase activity and a diminution of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. We finally observed that antioxidants fully prevented or attenuated HMG-induced alterations of the oxidative stress parameters, further indicating the participation of reactive species in these effects. We also observed that MK- 801, a non-competitive antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, prevented some of these effects, indicating the involvement of the NMDA receptor in the redox imbalance provoked HMG effects. Considering that astrocytes are important for neuronal protection and are susceptible to damage by neurotoxins the next step of this work was investigated the effects of HMG and MGA on important parameters of redox homeostasis and cytokine production in cortical cultured astrocytes. Both organic acids decreased astrocytic mitochondrial function withouth altering cell viability, and also decreased the concentrations of reduced glutathione. In contrast, they increased reactive species formation (DCFH oxidation) and also provoked a significant increase of IL-1, IL-6 and TNFα release through the Erk signaling pathway. Finally, we investigated the effects of HMG, MGA and MGT on the phosphorylation of GFAP and the neurofilaments (NF) subunits NFL, NFM and NFH in striatal and cortical slices. Our results demonstrated that HMG, MGA and MGT caused hypophosphorylation of GFAP and of all NF subunits in both cerebral structures. We also found that the HMG-induced hypophosphorylation on the cytoskeletal proteins was mediated by the inhibition of protein kinases without altering protein phosphatases. Thus, we demonstrated that PKA inhibition was involved in the hypophosphorylation of Ser55 in the amino terminal region of NFL, as well as JNK inhibition resulting in the hypophosphorylation of KSPrepeats in the carboxyl terminal region of NFM and NFH subunits. It was also observed that the cytoskeletal hypophosphorylation was dependent on synaptic and extra synaptic (NR2B subunit) NMDA glutamatergic receptors and also on Ca2+. Furthermore, the nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME, and the antioxidant TROLOX (polar analog of 5 vitamin E) fully prevented the hypophosphorylation and the inhibition of PKA and JNK activities caused by HMG. We can then presume that all these data provide solid evidence that oxidative stress induced by HMG and MGA in rat striatum and cortical cultured astrocytes, beyond of a inflamatory response verified in this neural cell type and an hypophosphorylation of cytoskeletal proteins could represent important pathomechanisms that contribute, at least in part, the cerebral alterations observed in the patients afected by the HL deficiency.

(OMIM 246450), também conhecida por acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica (HMGA), é um distúrbio genético caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo predominante dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA) e 3-metilglutacônico (MGT), bem como em menor grau do ácido 3- hidroxiisovalérico em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves e anormalidades no córtex cerebral e gânglios da base cuja fisiopatogenia é pouco conhecida. No presente estudo investigamos os efeitos dos principais metabólitos acumulados na HMGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em estriado de ratos injetados com esses compostos e em astrócitos cultivados de córtex cerebral, bem como sobre a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de estriado e córtex cerebral de ratos com 30 dias de idade. Assim, estudamos inicialmente os efeitos da administração intrastriatal de HMG e MGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em ratos em desenvolvimento. Nossos resultados demonstram que o HMG e o MGA induziram dano oxidativo em lipídios e proteínas. Os dois ácidos também aumentaram a oxidação da 2'- 7'-diclorofluorescina (DCFH), ao passo que apenas o HMG induziu a produção de óxido nítrico. Em relação às defesas antioxidantes o HMG e o MGA provocaram uma diminuição das concentrações de glutationa reduzida e das atividades da superóxido dismutase e glutationa redutase, bem como um aumento da atividade da glutationa peroxidase. Já o HMG também causou um aumento de atividade da catalase e uma diminuição da atividade da glicose-6- fosfato desidrogenase. Finalmente observou-se que antioxidantes preveniram completamente ou atenuaram as alterações dos parâmetros de estresse oxidativo causadas pelo HMG, reforçando a participação de espécies reativas nesses efeitos. Observou-se também que MK-801, um antagonista nãocompetitivo do receptor glutamatérgico do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), preveniu alguns dos efeitos provocados pelo HMG, indicando o envolvimento do receptor NMDA no desequilíbrio redox causado por esse metabólito. Tendo em vista que os astrócitos são importantes para proteção neuronal e são susceptíveis a danos por neurotoxinas, o passo seguinte de nossa investigação foi determinar os efeitos do HMG e MGA sobre parâmetros importantes da homeostase redox e produção de citocinas em astrócitos corticais cultivados. Ambos os ácidos orgânicos reduziram a função mitocondrial astrocitária sem alterarem a viabilidade celular e também diminuíram as concentrações de glutationa reduzida. Em contrapartida, ambos metabólitos aumentaram a formação de espécies reativas (oxidação da DCFH) e também provocaram um aumento na liberação das IL-1β, IL-6 e TNFα através da via de sinalização de Erk. Finalmente investigamos os efeitos do HMG, MGA e MGT sobre a fosforilação da GFAP e subunidades NFL, NFM e NFH dos neurofilamentos (NF) em fatias de estriado e de córtex cerebral. Nossos resultados demonstraram que o HMG, o MGA e o MGT provocaram uma hipofosforilação da GFAP e todas as subunidades dos NF nas duas estruturas cerebrais. Verificamos ainda que a hipofosoforilação induzida por HMG nas proteínas do citoesqueleto foi mediada pela inibição das proteínas cinases, sem alterações de proteínas fosfatases. Assim, demonstramos que uma inibição da PKA estaria envolvida na hipofosforilação da Ser55 na região aminoterminal da NFL, 3 bem como uma inibição da JNK, resultaria na hipofosforilação das repetições do tipo KSP na região carboxiterminal das subunidades NFM e NFH. Observou-se também que a hipofosforilação do citoesqueleto era dependente dos receptores glutamatérgicos sinápticos e extrasinápticos (subunidade NR2B) do tipo NMDA e também do íon Ca2+. Além disso, o inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME, e o antioxidante TROLOX (análogo hidrosolúvel da vitamina E) preveniram completamente a hipofosforilação e a inibição das atividades da PKA e da JNK causada pelo HMG. Podemos então presumir que, os presentes dados fornecem evidências sólidas de que o estresse oxidativo induzido pelo HMG e MGA em estriados de ratos e em astrócitos corticais cultivados, além de uma resposta inflamatória evidenciada nessas células neurais e uma hipofosoforilação em proteínas do citoesqueleto possam representar mecanismos patológicos importantes que contribuem, ao menos em parte, com as alterações cerebrais observadas nos pacientes afetados pela deficiência da HL. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (HL) deficiency, also known as 3- hydroxy-3-methylglutaric aciduria (HMGA) is a genetic disorder biochemically characterized by predominant accumulation of 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA) and 3-methylglutaconic (MGT), as well as lesser amounts of 3-methylglutaconic and 3-hydroxyisovaleric acids in tissues and biological fluids of affected individuals. Clinically, the patients present neurological symptoms and basal ganglia injury, whose pathomechanisms are partially understood. In the present study, we investigated the effects of the main metabolites accumulating in HMGA on important parameters of oxidative stress in intrastriatally injected rats, in cortical cultured astrocytes, as well as on the phosphorylation of striatal and cortical cytoskeletal proteins of 30 day old rats. Thus, we first investigated the effects of the intrastiatal administration of HMG and MGA on important parameters of oxidative stress in developing rats. Our results demonstrate that HMG and MGA induced lipid and protein oxidative damage. HMG and MGA also increased 2',7'-dichlorofluorescein oxidation, whereas only HMG elicited nitric oxide production. Regarding the antioxidant defenses, both organic acids decreased reduced glutathione concentrations and the activities of superoxide dismutase and glutathione reductase and increased glutathione peroxidase activity. HMG also provoked an increase of catalase activity and a diminution of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. We finally observed that antioxidants fully prevented or attenuated HMG-induced alterations of the oxidative stress parameters, further indicating the participation of reactive species in these effects. We also observed that MK- 801, a non-competitive antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, prevented some of these effects, indicating the involvement of the NMDA receptor in the redox imbalance provoked HMG effects. Considering that astrocytes are important for neuronal protection and are susceptible to damage by neurotoxins the next step of this work was investigated the effects of HMG and MGA on important parameters of redox homeostasis and cytokine production in cortical cultured astrocytes. Both organic acids decreased astrocytic mitochondrial function withouth altering cell viability, and also decreased the concentrations of reduced glutathione. In contrast, they increased reactive species formation (DCFH oxidation) and also provoked a significant increase of IL-1, IL-6 and TNFα release through the Erk signaling pathway. Finally, we investigated the effects of HMG, MGA and MGT on the phosphorylation of GFAP and the neurofilaments (NF) subunits NFL, NFM and NFH in striatal and cortical slices. Our results demonstrated that HMG, MGA and MGT caused hypophosphorylation of GFAP and of all NF subunits in both cerebral structures. We also found that the HMG-induced hypophosphorylation on the cytoskeletal proteins was mediated by the inhibition of protein kinases without altering protein phosphatases. Thus, we demonstrated that PKA inhibition was involved in the hypophosphorylation of Ser55 in the amino terminal region of NFL, as well as JNK inhibition resulting in the hypophosphorylation of KSPrepeats in the carboxyl terminal region of NFM and NFH subunits. It was also observed that the cytoskeletal hypophosphorylation was dependent on synaptic and extra synaptic (NR2B subunit) NMDA glutamatergic receptors and also on Ca2+. Furthermore, the nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME, and the antioxidant TROLOX (polar analog of 5 vitamin E) fully prevented the hypophosphorylation and the inhibition of PKA and JNK activities caused by HMG. We can then presume that all these data provide solid evidence that oxidative stress induced by HMG and MGA in rat striatum and cortical cultured astrocytes, beyond of a inflamatory response verified in this neural cell type and an hypophosphorylation of cytoskeletal proteins could represent important pathomechanisms that contribute, at least in part, the cerebral alterations observed in the patients afected by the HL deficiency.