Orientador: Luiz Carlos Marques / Resumo: A produção de ovinos no Brasil está em constante ascensão e tal fato leva ao aumento do número de animais confinados, visando maior ganho de peso em curto período de tempo. Essa situação predispõe os animais a desordens como acidose ruminal subaguda (ARS) e, consequentemente, laminite, gerando perdas econômicas pela diminuição da produtividade do rebanho e, em casos graves, descarte de animais. Com o objetivo de avaliar a ocorrência de estresse oxidativo, a expressão das metaloproteinases (MMPs) 2 e 9 e seus inibidores (TIMPs) 1 e 2 e também a termografia infravermelha podal (TIV) oito ovelhas adultas foram utilizadas, sendo as mesmas divididas entre os grupos controle (GC) contendo três animais e o grupo indução (GI) contendo cinco animais. Para indução da ARS os animais do GI receberam dieta com alto teor de alimento concentrado durante 30 dias. Todos os animais do GI apresentaram diminuição do pH ruminal, indicando a ocorrência de ARS, e também sinais clínicos de laminite em diversos momentos ao longo do período. Somente foi expressa a forma pró ativa da MMP 2, com valores aumentados nos dias 6 e 11, além da detecção dos TIMPs 1 e 2 ao longo de todo o período. Com relação ao estresse oxidativo, as variáveis relacionadas com a liberação de fatores oxidantes como a capacidade oxidante total (TOC), a peroxidação lipídica (LPO) e o índice de estresse oxidativo (IEO) encontram-se elevadas nos animais do GI, notadamente a partir do dia 20. A região da banda coronária e pele adja... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The production of sheep in Brazil is constantly rising and this fact leads to an increase in the number of confined animals, aiming to have a greater weight gain in a short period of time. This situation predisposes the animals to disorders such as subacute ruminal acidosis (SARA) and, consequently, laminitis, generating economic losses by decreasing the productivity of the herd and, in severe cases, disposal of animals. With the objective of evaluating the occurrence of oxidative stress, the expression of metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 and their inhibitors (TIMPs) 1 and 2 and also the infrared thermography (IT) eight adult ewes were used, divided among control group (CG) containing three animals and the induction group (IG) with five animals. For the induction of SARA, GI animals received a diet with high content of concentrated food during 30 days. All animals from IG group showed a decrease in ruminal pH, indicating the occurrence of SARA, as well as clinical signs of laminitis at various times during the period. Only the pro-active form of MMP 2 was expressed, with values increased on days 6 and 11, besides the detection of TIMPs 1 and 2 all long the period. Regarding oxidative stress, the variables related to the release of oxidant factors such as total oxidant capacity (TOC), lipid peroxidation (LPO) and oxidative stress index (OSI) are high in IG animals, mainly from day 20. The region of the coronary band and adjacent skin was evaluated through the IT. All IG anima... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As desordens do metabolismo do propionato, acidemia propiônica (PAemia) e acidemia metilmalônica (MMAemia), são doenças hereditárias, autossômicas recessivas, bioquimicamente caracterizadas pelo acúmulo predominante dos ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA), respectivamente, nos tecidos e fluidos biológicos dos indivíduos afetados. Esses distúrbios comprometem o catabolismo dos aminoácidos isoleucina, valina, metionina e treonina, ácidos graxos com número ímpar de átomos de carbono e colesterol. Estas alterações no metabolismo levam a episódios de acidose metabólica grave no período neonatal, hiperamonemia, hipo/hiperglicemia, além de manifestações neurológicas, como letargia, hipotonia, convulsões e atraso no desenvolvimento psicomotor. O tratamento dessas acidemias orgânicas consiste na restrição da ingestão de proteínas e dos aminoácidos precursores do propionato, suplementada com uma fórmula semi-sintética contendo aminoácidos essenciais e L-carnitina. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que os ácidos propiônico e metilmalônico estimulam a oxidação lipídica e protéica e reduzem as defesas antioxidantes em cérebro de ratos. Entretanto, os efeitos oxidantes desses ácidos orgânicos sobre o DNA e a ocorrência de estresse oxidativo em pacientes com desordens do metabolismo do propionato têm sido pouco investigados. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o dano oxidativo a proteínas e a lipídios, bem como a atividade da enzima butirilcolinesterase em pacientes com PAemia e MMAemia, avaliando o efeito do tratamento com Lcarnitina e dieta hipoprotéica sobre esses parâmetros e investigar o efeito in vitro dos ácidos propiônico e metilmalônico sobre o dano ao DNA, na presença e ausência de L-carnitina. Para tanto, foram utilizadas amostras de plasma e urina de pacientes com essas desordens obtidas no momento do diagnóstico e durante o tratamento com L-carnitina (100 mg/Kg/dia) e dieta hipoprotéica. Os resultados demonstraram um aumento significativo nas concentrações plasmáticas de malondialdeído e de proteínas carboniladas, e nas concentrações urinárias de ditirosina e isoprostanos, bem como uma redução significativa de tióis totais e da capacidade antioxidante, no plasma e urina respectivamente, de pacientes com PAemia e MMAemia no momento do diagnóstico dessas doenças. Por outro lado, os pacientes com PAemia e MMAemia em tratamento com dieta hipoprotéica, Lcarnitina e fórmula semi-sintética de aminoácidos apresentaram concentrações significativamente menores de malondialdeído, proteínas carboniladas, isoprostanos e di-tirosina em relação aos pacientes não-tratados. Além disso, foi observada uma relação inversa entre as concentrações plasmáticas de L-carnitina livre (r= -0,67, p<0,05) e total (r= -0,66, p<0,05) com as concentrações de malondialdeído, bem como entre os marcadores urinários de dano oxidativo e as concentrações de carnitina total e livre. Na continuidade do trabalho, foi investigado o efeito in vitro da L-carnitina, em concentrações detectadas no sangue de pacientes com PAemia e MMAemia não-tratados (30 μM) e tratados (60-150 μM), sobre o dano ao DNA em leucócitos periféricos humanos saudáveis induzido pelos ácidos propiônico e metilmalônico, através do ensaio do cometa. Os resultados desse estudo demonstraram que os ácidos propiônico (2-5 mM) e metilmalônico (0,5-5 mM) foram capazes de estimular significativamente in vitro o dano ao DNA quando comparado ao grupo controle. O tratamento in vitro com Lcarnitina reduziu significativamente os índices de dano ao DNA induzidos por PA e MMA 5 mM, de maneira dose-dependente. Ainda, o tratamento com L-carnitina evitou a indução de dano classes 3 e 4 pelo MMA, e a concentração de 150 μM de L-carnitina preveniu os efeitos lesivos de ambos os ácidos sobre o DNA. Por último, foi investigada a atividade da enzima butirilcolinesterase e as concentrações de malondialdeído no plasma de pacientes com desordens do metabolismo do propionato não-tratados (no momento do diagnóstico) e em uso de L-carnitina e dieta hipoprotéica. Os resultados encontrados mostraram que a atividade da butirilcolinesterase está significativamente reduzida, enquanto as concentrações de malondialdeído estão aumentadas no plasma dos pacientes no diagnóstico. Por outro lado, pacientes em tratamento apresentaram concentrações de malondialdeído e atividade da butirilcolinesterase estatisticamente similar ao grupo controle. Também foi observada uma correlação negativa significativa entre a atividade da enzima e as concentrações de malondialdeído no plasma dos pacientes afetados. Concluindo, os resultados desse trabalho permitem inferir que o tratamento com L-carnitina e dieta hipoprotéica é capaz de conferir proteção contra o dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA) e a redução da atividade da enzima butirilcolinesterase que podem contribuir, ao menos em parte, na fisiopatogenia das desordens do metabolismo do propionato. / The disorders of propionate metabolism, propionic acidemia (PAemia) and methylmalonic acidemia (MMAemia), are inherited autosomal recessive diseases, biochemically characterized by the predominat accumulation of propionic acid (PA) and methylmalonic acid (MMA), respectively, in tissues and biological fluids of affected individuals. These disorders impair the catabolism of amino acids isoleucine, valine, methionine and threonine, odd-chain fatty acids and cholesterol. These alterations in the metabolism lead to severe metabolic acidosis in the neonatal period, with hyperammonemia, hypo/hyperglycemia and neurological manifestations, such as lethargy, hypotonia, seizures, and delayed psychomotor development. The treatment of these organic acidemias consists of a low-protein diet, restricted in amino acids precursors of propionate, supplemented with a semisynthetic formula containing essential amino acids and L-carnitine. In vitro and in vivo studies have demonstrated that methylmalonic and propionic acids stimulate lipid and protein oxidation and reduce antioxidant defenses in rat brain. However, the oxidant effects of these organic acids on DNA and the occurrence of oxidative stress in patients with disorders of propionate metabolism have been poorly investigated. So, the objective of the present study was to investigate lipid and protein oxidative damage, as well as the butyrylcholinesterase activity in patients with PAemia MMAemia, verifing the effect of treatment with L-carnitine and lowprotein diet on these parameters, and to investigate in vitro the effect of propionic and methylmalonic acids on DNA damage, in the presence or absence of Lcarnitine. For this purpose, plasma and urine samples were obtained from patients with Paemia and MMAemia at the moment of diagnosis and during the treatment with L-carnitine (100 mg/Kg/day) and low-protein diet. The results demonstrated a significant increase of malondialdehyde plasma concentrations and carbonylated proteins, and of urinary concentrations of di-tyrosine and isoprostanes, as well as a significant reduction of total sulfhydryl groups and the antioxidant capacity, in plasma and urine, respectively, from patients with PAemia and MMAemia at diagnosis. On the other hand, patients with PAemia and MMAemia under treatment with L-carnitine, low-protein diet and amino acids semi-synthetic formula presented a significant reduction of malondialdehyde, protein carbonyl groups, isoprostanes and di-tyrosine in relation to untreated patients. Furthermore, it was observed an inverse correlation between free (r= -0,67, p<0,05) and total (r= -0,66, p<0,05) plasma L-carnitine concentrations and the malondialdehyde levels, as well as between the urinary biomarkers of oxidative damage and the free and total Lcarnitine concentrations. Subsequently, it was investigated the in vitro effect of Lcarnitine, at concentrations detected in blood of untreated (30 μM) and treated patients with PAemia and MMAemia (60-150 μM) on DNA damage induced by propionic and methylmalonic acids in human healthy peripheral leukocytes, using the comet assay. The results of this study showed that propionic (2-5 mM) and methylmalonic (0.5-5 mM) acids were able to significantly stimulate in vitro DNA damage index (DI) when compared to the control group. In vitro treatment with Lcarnitine significantly reduced DNA damage induced by 5 mM PA and MMA, in a concentration-dependent manner. Furthermore, L-carnitine prevented cells with damage classes 3 and 4 induced by 5 mM MMA, and the dose of 150 μM of this compound prevented the harmful effects on DNA by both acids. Finally, it was investigated the butyrylcholinesterase activity and the malondialdehyde concentrations in plasma from patients with disorders of propionate metabolism at diagnosis and under therapy with L-carnitine and low-protein diet. The found results showed that the butyrylcholinesterase activity is significantly reduced, whereas the malondialdehyde concentrations are increased in plasma from patients at diagnosis. On the other hand, patients under treatment presented malondialdehyde levels and butyrylcholinesterase activity statistically similar to controls. It was also observed a significant negative correlation between this enzyme activity and the malondialdehyde concentrations in plasma from the affected patients. In conclusion, these results allow to suggest that the treatment with L-carnitine and protein restricted diet may offer protection against the oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA) and the reduced butyrylcholinesterase activity that may contribute, at least in part, to the pathophysiology of the disorders of propionate metabolism.

As desordens do metabolismo do propionato, acidemia propiônica (PAemia) e acidemia metilmalônica (MMAemia), são doenças hereditárias, autossômicas recessivas, bioquimicamente caracterizadas pelo acúmulo predominante dos ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA), respectivamente, nos tecidos e fluidos biológicos dos indivíduos afetados. Esses distúrbios comprometem o catabolismo dos aminoácidos isoleucina, valina, metionina e treonina, ácidos graxos com número ímpar de átomos de carbono e colesterol. Estas alterações no metabolismo levam a episódios de acidose metabólica grave no período neonatal, hiperamonemia, hipo/hiperglicemia, além de manifestações neurológicas, como letargia, hipotonia, convulsões e atraso no desenvolvimento psicomotor. O tratamento dessas acidemias orgânicas consiste na restrição da ingestão de proteínas e dos aminoácidos precursores do propionato, suplementada com uma fórmula semi-sintética contendo aminoácidos essenciais e L-carnitina. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que os ácidos propiônico e metilmalônico estimulam a oxidação lipídica e protéica e reduzem as defesas antioxidantes em cérebro de ratos. Entretanto, os efeitos oxidantes desses ácidos orgânicos sobre o DNA e a ocorrência de estresse oxidativo em pacientes com desordens do metabolismo do propionato têm sido pouco investigados. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o dano oxidativo a proteínas e a lipídios, bem como a atividade da enzima butirilcolinesterase em pacientes com PAemia e MMAemia, avaliando o efeito do tratamento com Lcarnitina e dieta hipoprotéica sobre esses parâmetros e investigar o efeito in vitro dos ácidos propiônico e metilmalônico sobre o dano ao DNA, na presença e ausência de L-carnitina. Para tanto, foram utilizadas amostras de plasma e urina de pacientes com essas desordens obtidas no momento do diagnóstico e durante o tratamento com L-carnitina (100 mg/Kg/dia) e dieta hipoprotéica. Os resultados demonstraram um aumento significativo nas concentrações plasmáticas de malondialdeído e de proteínas carboniladas, e nas concentrações urinárias de ditirosina e isoprostanos, bem como uma redução significativa de tióis totais e da capacidade antioxidante, no plasma e urina respectivamente, de pacientes com PAemia e MMAemia no momento do diagnóstico dessas doenças. Por outro lado, os pacientes com PAemia e MMAemia em tratamento com dieta hipoprotéica, Lcarnitina e fórmula semi-sintética de aminoácidos apresentaram concentrações significativamente menores de malondialdeído, proteínas carboniladas, isoprostanos e di-tirosina em relação aos pacientes não-tratados. Além disso, foi observada uma relação inversa entre as concentrações plasmáticas de L-carnitina livre (r= -0,67, p<0,05) e total (r= -0,66, p<0,05) com as concentrações de malondialdeído, bem como entre os marcadores urinários de dano oxidativo e as concentrações de carnitina total e livre. Na continuidade do trabalho, foi investigado o efeito in vitro da L-carnitina, em concentrações detectadas no sangue de pacientes com PAemia e MMAemia não-tratados (30 μM) e tratados (60-150 μM), sobre o dano ao DNA em leucócitos periféricos humanos saudáveis induzido pelos ácidos propiônico e metilmalônico, através do ensaio do cometa. Os resultados desse estudo demonstraram que os ácidos propiônico (2-5 mM) e metilmalônico (0,5-5 mM) foram capazes de estimular significativamente in vitro o dano ao DNA quando comparado ao grupo controle. O tratamento in vitro com Lcarnitina reduziu significativamente os índices de dano ao DNA induzidos por PA e MMA 5 mM, de maneira dose-dependente. Ainda, o tratamento com L-carnitina evitou a indução de dano classes 3 e 4 pelo MMA, e a concentração de 150 μM de L-carnitina preveniu os efeitos lesivos de ambos os ácidos sobre o DNA. Por último, foi investigada a atividade da enzima butirilcolinesterase e as concentrações de malondialdeído no plasma de pacientes com desordens do metabolismo do propionato não-tratados (no momento do diagnóstico) e em uso de L-carnitina e dieta hipoprotéica. Os resultados encontrados mostraram que a atividade da butirilcolinesterase está significativamente reduzida, enquanto as concentrações de malondialdeído estão aumentadas no plasma dos pacientes no diagnóstico. Por outro lado, pacientes em tratamento apresentaram concentrações de malondialdeído e atividade da butirilcolinesterase estatisticamente similar ao grupo controle. Também foi observada uma correlação negativa significativa entre a atividade da enzima e as concentrações de malondialdeído no plasma dos pacientes afetados. Concluindo, os resultados desse trabalho permitem inferir que o tratamento com L-carnitina e dieta hipoprotéica é capaz de conferir proteção contra o dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA) e a redução da atividade da enzima butirilcolinesterase que podem contribuir, ao menos em parte, na fisiopatogenia das desordens do metabolismo do propionato. / The disorders of propionate metabolism, propionic acidemia (PAemia) and methylmalonic acidemia (MMAemia), are inherited autosomal recessive diseases, biochemically characterized by the predominat accumulation of propionic acid (PA) and methylmalonic acid (MMA), respectively, in tissues and biological fluids of affected individuals. These disorders impair the catabolism of amino acids isoleucine, valine, methionine and threonine, odd-chain fatty acids and cholesterol. These alterations in the metabolism lead to severe metabolic acidosis in the neonatal period, with hyperammonemia, hypo/hyperglycemia and neurological manifestations, such as lethargy, hypotonia, seizures, and delayed psychomotor development. The treatment of these organic acidemias consists of a low-protein diet, restricted in amino acids precursors of propionate, supplemented with a semisynthetic formula containing essential amino acids and L-carnitine. In vitro and in vivo studies have demonstrated that methylmalonic and propionic acids stimulate lipid and protein oxidation and reduce antioxidant defenses in rat brain. However, the oxidant effects of these organic acids on DNA and the occurrence of oxidative stress in patients with disorders of propionate metabolism have been poorly investigated. So, the objective of the present study was to investigate lipid and protein oxidative damage, as well as the butyrylcholinesterase activity in patients with PAemia MMAemia, verifing the effect of treatment with L-carnitine and lowprotein diet on these parameters, and to investigate in vitro the effect of propionic and methylmalonic acids on DNA damage, in the presence or absence of Lcarnitine. For this purpose, plasma and urine samples were obtained from patients with Paemia and MMAemia at the moment of diagnosis and during the treatment with L-carnitine (100 mg/Kg/day) and low-protein diet. The results demonstrated a significant increase of malondialdehyde plasma concentrations and carbonylated proteins, and of urinary concentrations of di-tyrosine and isoprostanes, as well as a significant reduction of total sulfhydryl groups and the antioxidant capacity, in plasma and urine, respectively, from patients with PAemia and MMAemia at diagnosis. On the other hand, patients with PAemia and MMAemia under treatment with L-carnitine, low-protein diet and amino acids semi-synthetic formula presented a significant reduction of malondialdehyde, protein carbonyl groups, isoprostanes and di-tyrosine in relation to untreated patients. Furthermore, it was observed an inverse correlation between free (r= -0,67, p<0,05) and total (r= -0,66, p<0,05) plasma L-carnitine concentrations and the malondialdehyde levels, as well as between the urinary biomarkers of oxidative damage and the free and total Lcarnitine concentrations. Subsequently, it was investigated the in vitro effect of Lcarnitine, at concentrations detected in blood of untreated (30 μM) and treated patients with PAemia and MMAemia (60-150 μM) on DNA damage induced by propionic and methylmalonic acids in human healthy peripheral leukocytes, using the comet assay. The results of this study showed that propionic (2-5 mM) and methylmalonic (0.5-5 mM) acids were able to significantly stimulate in vitro DNA damage index (DI) when compared to the control group. In vitro treatment with Lcarnitine significantly reduced DNA damage induced by 5 mM PA and MMA, in a concentration-dependent manner. Furthermore, L-carnitine prevented cells with damage classes 3 and 4 induced by 5 mM MMA, and the dose of 150 μM of this compound prevented the harmful effects on DNA by both acids. Finally, it was investigated the butyrylcholinesterase activity and the malondialdehyde concentrations in plasma from patients with disorders of propionate metabolism at diagnosis and under therapy with L-carnitine and low-protein diet. The found results showed that the butyrylcholinesterase activity is significantly reduced, whereas the malondialdehyde concentrations are increased in plasma from patients at diagnosis. On the other hand, patients under treatment presented malondialdehyde levels and butyrylcholinesterase activity statistically similar to controls. It was also observed a significant negative correlation between this enzyme activity and the malondialdehyde concentrations in plasma from the affected patients. In conclusion, these results allow to suggest that the treatment with L-carnitine and protein restricted diet may offer protection against the oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA) and the reduced butyrylcholinesterase activity that may contribute, at least in part, to the pathophysiology of the disorders of propionate metabolism.

As desordens do metabolismo do propionato, acidemia propiônica (PAemia) e acidemia metilmalônica (MMAemia), são doenças hereditárias, autossômicas recessivas, bioquimicamente caracterizadas pelo acúmulo predominante dos ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA), respectivamente, nos tecidos e fluidos biológicos dos indivíduos afetados. Esses distúrbios comprometem o catabolismo dos aminoácidos isoleucina, valina, metionina e treonina, ácidos graxos com número ímpar de átomos de carbono e colesterol. Estas alterações no metabolismo levam a episódios de acidose metabólica grave no período neonatal, hiperamonemia, hipo/hiperglicemia, além de manifestações neurológicas, como letargia, hipotonia, convulsões e atraso no desenvolvimento psicomotor. O tratamento dessas acidemias orgânicas consiste na restrição da ingestão de proteínas e dos aminoácidos precursores do propionato, suplementada com uma fórmula semi-sintética contendo aminoácidos essenciais e L-carnitina. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que os ácidos propiônico e metilmalônico estimulam a oxidação lipídica e protéica e reduzem as defesas antioxidantes em cérebro de ratos. Entretanto, os efeitos oxidantes desses ácidos orgânicos sobre o DNA e a ocorrência de estresse oxidativo em pacientes com desordens do metabolismo do propionato têm sido pouco investigados. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o dano oxidativo a proteínas e a lipídios, bem como a atividade da enzima butirilcolinesterase em pacientes com PAemia e MMAemia, avaliando o efeito do tratamento com Lcarnitina e dieta hipoprotéica sobre esses parâmetros e investigar o efeito in vitro dos ácidos propiônico e metilmalônico sobre o dano ao DNA, na presença e ausência de L-carnitina. Para tanto, foram utilizadas amostras de plasma e urina de pacientes com essas desordens obtidas no momento do diagnóstico e durante o tratamento com L-carnitina (100 mg/Kg/dia) e dieta hipoprotéica. Os resultados demonstraram um aumento significativo nas concentrações plasmáticas de malondialdeído e de proteínas carboniladas, e nas concentrações urinárias de ditirosina e isoprostanos, bem como uma redução significativa de tióis totais e da capacidade antioxidante, no plasma e urina respectivamente, de pacientes com PAemia e MMAemia no momento do diagnóstico dessas doenças. Por outro lado, os pacientes com PAemia e MMAemia em tratamento com dieta hipoprotéica, Lcarnitina e fórmula semi-sintética de aminoácidos apresentaram concentrações significativamente menores de malondialdeído, proteínas carboniladas, isoprostanos e di-tirosina em relação aos pacientes não-tratados. Além disso, foi observada uma relação inversa entre as concentrações plasmáticas de L-carnitina livre (r= -0,67, p<0,05) e total (r= -0,66, p<0,05) com as concentrações de malondialdeído, bem como entre os marcadores urinários de dano oxidativo e as concentrações de carnitina total e livre. Na continuidade do trabalho, foi investigado o efeito in vitro da L-carnitina, em concentrações detectadas no sangue de pacientes com PAemia e MMAemia não-tratados (30 μM) e tratados (60-150 μM), sobre o dano ao DNA em leucócitos periféricos humanos saudáveis induzido pelos ácidos propiônico e metilmalônico, através do ensaio do cometa. Os resultados desse estudo demonstraram que os ácidos propiônico (2-5 mM) e metilmalônico (0,5-5 mM) foram capazes de estimular significativamente in vitro o dano ao DNA quando comparado ao grupo controle. O tratamento in vitro com Lcarnitina reduziu significativamente os índices de dano ao DNA induzidos por PA e MMA 5 mM, de maneira dose-dependente. Ainda, o tratamento com L-carnitina evitou a indução de dano classes 3 e 4 pelo MMA, e a concentração de 150 μM de L-carnitina preveniu os efeitos lesivos de ambos os ácidos sobre o DNA. Por último, foi investigada a atividade da enzima butirilcolinesterase e as concentrações de malondialdeído no plasma de pacientes com desordens do metabolismo do propionato não-tratados (no momento do diagnóstico) e em uso de L-carnitina e dieta hipoprotéica. Os resultados encontrados mostraram que a atividade da butirilcolinesterase está significativamente reduzida, enquanto as concentrações de malondialdeído estão aumentadas no plasma dos pacientes no diagnóstico. Por outro lado, pacientes em tratamento apresentaram concentrações de malondialdeído e atividade da butirilcolinesterase estatisticamente similar ao grupo controle. Também foi observada uma correlação negativa significativa entre a atividade da enzima e as concentrações de malondialdeído no plasma dos pacientes afetados. Concluindo, os resultados desse trabalho permitem inferir que o tratamento com L-carnitina e dieta hipoprotéica é capaz de conferir proteção contra o dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA) e a redução da atividade da enzima butirilcolinesterase que podem contribuir, ao menos em parte, na fisiopatogenia das desordens do metabolismo do propionato. / The disorders of propionate metabolism, propionic acidemia (PAemia) and methylmalonic acidemia (MMAemia), are inherited autosomal recessive diseases, biochemically characterized by the predominat accumulation of propionic acid (PA) and methylmalonic acid (MMA), respectively, in tissues and biological fluids of affected individuals. These disorders impair the catabolism of amino acids isoleucine, valine, methionine and threonine, odd-chain fatty acids and cholesterol. These alterations in the metabolism lead to severe metabolic acidosis in the neonatal period, with hyperammonemia, hypo/hyperglycemia and neurological manifestations, such as lethargy, hypotonia, seizures, and delayed psychomotor development. The treatment of these organic acidemias consists of a low-protein diet, restricted in amino acids precursors of propionate, supplemented with a semisynthetic formula containing essential amino acids and L-carnitine. In vitro and in vivo studies have demonstrated that methylmalonic and propionic acids stimulate lipid and protein oxidation and reduce antioxidant defenses in rat brain. However, the oxidant effects of these organic acids on DNA and the occurrence of oxidative stress in patients with disorders of propionate metabolism have been poorly investigated. So, the objective of the present study was to investigate lipid and protein oxidative damage, as well as the butyrylcholinesterase activity in patients with PAemia MMAemia, verifing the effect of treatment with L-carnitine and lowprotein diet on these parameters, and to investigate in vitro the effect of propionic and methylmalonic acids on DNA damage, in the presence or absence of Lcarnitine. For this purpose, plasma and urine samples were obtained from patients with Paemia and MMAemia at the moment of diagnosis and during the treatment with L-carnitine (100 mg/Kg/day) and low-protein diet. The results demonstrated a significant increase of malondialdehyde plasma concentrations and carbonylated proteins, and of urinary concentrations of di-tyrosine and isoprostanes, as well as a significant reduction of total sulfhydryl groups and the antioxidant capacity, in plasma and urine, respectively, from patients with PAemia and MMAemia at diagnosis. On the other hand, patients with PAemia and MMAemia under treatment with L-carnitine, low-protein diet and amino acids semi-synthetic formula presented a significant reduction of malondialdehyde, protein carbonyl groups, isoprostanes and di-tyrosine in relation to untreated patients. Furthermore, it was observed an inverse correlation between free (r= -0,67, p<0,05) and total (r= -0,66, p<0,05) plasma L-carnitine concentrations and the malondialdehyde levels, as well as between the urinary biomarkers of oxidative damage and the free and total Lcarnitine concentrations. Subsequently, it was investigated the in vitro effect of Lcarnitine, at concentrations detected in blood of untreated (30 μM) and treated patients with PAemia and MMAemia (60-150 μM) on DNA damage induced by propionic and methylmalonic acids in human healthy peripheral leukocytes, using the comet assay. The results of this study showed that propionic (2-5 mM) and methylmalonic (0.5-5 mM) acids were able to significantly stimulate in vitro DNA damage index (DI) when compared to the control group. In vitro treatment with Lcarnitine significantly reduced DNA damage induced by 5 mM PA and MMA, in a concentration-dependent manner. Furthermore, L-carnitine prevented cells with damage classes 3 and 4 induced by 5 mM MMA, and the dose of 150 μM of this compound prevented the harmful effects on DNA by both acids. Finally, it was investigated the butyrylcholinesterase activity and the malondialdehyde concentrations in plasma from patients with disorders of propionate metabolism at diagnosis and under therapy with L-carnitine and low-protein diet. The found results showed that the butyrylcholinesterase activity is significantly reduced, whereas the malondialdehyde concentrations are increased in plasma from patients at diagnosis. On the other hand, patients under treatment presented malondialdehyde levels and butyrylcholinesterase activity statistically similar to controls. It was also observed a significant negative correlation between this enzyme activity and the malondialdehyde concentrations in plasma from the affected patients. In conclusion, these results allow to suggest that the treatment with L-carnitine and protein restricted diet may offer protection against the oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA) and the reduced butyrylcholinesterase activity that may contribute, at least in part, to the pathophysiology of the disorders of propionate metabolism.

A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA), dano oxidativo e alterações neurológicas, como degeneração estriatal e convulsões. Considerando que o óxido nítrico é um mensageiro químico trans-sináptico que está envolvido em diversos eventos fisiopatologógicos e seu papel na toxicidade induzida pelo MMA é pouco conhecido, nós decidimos investigar a participação deste radical livre nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intraestriatal de MMA. No primeiro trabalho, foi evidenciado que a administração intraestriatal de um inibidor não-seletivo da enzima óxido nítrico sintase, metil éster de Nϖ-nitro-L-arginina (LNAME: 10-4 - 100 nmol/0,5 μl), exerceu efeito bifásico nas convulsões e na carbonilação proteíca induzidas pela injeção de MMA (4,5 μmol/1,5 μl; 30 minutos após a injeção de L-NAME) no estriado de ratos. Estes resultados sugeriram um envolvimento do óxido nítrico nas convulsões e no dano oxidativo induzido pelo MMA. Em um segundo momento, confirmamos o envolvimento do óxido nítrico nas convulsões induzidas por MMA, uma vez que a injeção intraestriatal de MMA causou um aumento na concentração de nitrito e nitrato (NO2 e NO3) estriatal. Além disso, os episódios convulsivos induzidos por MMA apresentaram uma correlação significativa com a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase no estriado injetado, mas não com os níveis de carbonilação protéica, um marcador de dano oxidativo protéico. Neste estudo também foi avaliado o efeito da administração intraestriatal do azul de metileno (AM; 0,015 a 1,5 nmol/ 0,5 μl), que possui atividade antioxidante e é um inibidor da guanilato ciclase, nas convulsões e dano oxidativo induzidos pelo MMA. O AM (1,5 nmol/0,5 μl) diminuiu a formação de NO2 e NO3 estriatal e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses dados sugerem que a atividade da Na+,K+-ATPase pode ser de grande importância para a gênese das convulsões induzidas pelo MMA e que o AM exerce efeito neuroprotetor contra as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo MMA. Além disso, se essas alterações ocorerem nos pacientes com acidemia metilmalônica, é possível propor que o AM poderia ser considerado como uma terapia adjuvante para o tratamento desta acidemia. O efeito da administração do 7-nitroindazol (7-NI; 3-60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima NOSn, nas convulsões, carbonilação protéica, produção de NO2 e NO3 e na atividade da Na+,K+-ATPase após trinta minutos da administração intraestriatal de MMA (6 μmol/ 2 μl) também foi avaliado. O tratamento com 7-NI (60 mg/kg, i.p.) potencializou as convulsões, aumentou a carbonilação protéica e reduziu a produção de NO2 e NO3 induzidos pelo MMA, entretanto, este tratamento não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase. A adminstração intraestriatal de L-arginina (50 nmol/ 0.5 μl), mas não de D-arginina (5 and 50 nmol/ 0.5 μl), aumentou a produção de NO2 e NO3 e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses resultados sugerem que o óxido nítrico neuronal pode exercer um efeito protetor sobre as convulsões bem como nas alterações neuroquímicas evidenciadas neste modelo de acidemia orgânica. Concluindo, estes resultados ampliam o papel dos radicais livres nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intra-estriatal de MMA.

Diversos trabalhos têm relacionado a fisiopatogenia da acidemia glutárica tipo I (GA I) com a excitotoxicidade glutamatérgica. Ainda que sob intenso debate, a maioria desses trabalhos se baseia na semelhança estrutural existente entre o glutamato e os principais ácidos orgânicos acumulados na GA I, os ácidos glutárico (GA) e 3-hidroxiglutárico (3-OHGA). Tendo em vista a janela de vulnerabilidade cerebral dos pacientes afetados pela GA I durante os primeiros anos de vida e o distinto padrão de expressão e propriedades de receptores e transportadores glutamatérgicos ao longo do desenvolvimento, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos ácidos GA e 3-OHGA sobre a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática e sobre a captação de glutamato por fatias e preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado de ratos de 7 a 60 dias de vida. Nossos resultados demonstraram que o 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Observamos ainda que esse ácido parece interagir com receptores do tipo NMDA, agindo como um fraco agonista desses receptores por aumentar a ligação de MK-801 em receptores de membrana e o influxo de Ca2+ em fatias de córtex cerebral de ratos. Através do estudo ontogenético da ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática de ratos na presença de GA e 3-OHGA, verificamos que o GA inibe a ligação de glutamato a seus receptores de membrana em córtex cerebral e estriado de ratos de 7 e 15 dias de vida. A utilização de antagonistas glutamatérgicos juntamente com a inibição da ligação de cainato a seus receptores na presença de GA indicaram que os efeitos desse ácido sobre a ligação de glutamato a seus receptores parecem envolver receptores do tipo não- NMDA, possivelmente do tipo cainato. O ácido 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato somente a transportadores de membrana de estriado de ratos de 7 dias de vida. Os estudos de captação de glutamato mostraram que o GA inibe o transporte desse neurotransmissor apenas em fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida. Esse efeito não foi devido à morte celular e foi prevenido por pré-administração de N-acetilcisteína sugerindo o envolvimento de dano oxidativo na presença do GA. Além disso, o efeito do GA parece envolver os transportadores glutamatérgicos do tipo GLAST, expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento cerebral. Em contraste, o ácido 3-OHGA não afetou a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral e estriado de ratos. Observamos também que os ácidos GA e 3-OHGA não afetaram a captação de glutamato por preparações sinaptossomais de cérebro de ratos. Os efeitos detectados no presente estudo pelos ácidos GA e 3-OHGA em períodos específicos do desenvolvimento e também nas distintas estruturas cerebrais estudadas podem estar relacionados com a expressão diferenciada de receptores e transportadores glutamatérgicos no cérebro de ratos. Apesar de não explicarem a janela de vulnerabilidade estriatal, tais resultados podem auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano neurológico ocorrido durante os primeiros anos de vida dos pacientes com GA I. / The role of excitotoxicity in the cerebral damage of glutaric acidemia type I (GA I) is under intense debate. Several studies relate the excitotoxic actions of the major metabolites accumulating in GA I, glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric acids (3-OHGA), based on the chemical structural similarity between these organic acids and glutamate. Considering that GA I patients present a window of cerebral vulnerability during the first years of life and the variable ontogenetic pattern of glutamate receptors and transporters expression and properties, the objective of the present work was to investigate the effects of GA and 3-OHGA on glutamate binding to receptors and transporters from synaptic plasma membranes and on glutamate uptake by slices and synaptosomal preparations from cerebral cortex and striatum during rat brain development. Our results demonstrated that 3-OHGA inhibited glutamate binding to receptors and transporters from plasma membranes of cerebral cortex of 30-day-old rats. Moreover, its effect on glutamate receptors seems to be directed towards NMDA receptors and suggests that 3-OHGA acts as a weak agonist of these receptors by increasing the MK-801 binding to membrane receptors and Ca2+ influx into cerebral cortex slices of rats. The ontogenetic study of glutamate binding to receptors and transporters in the presence of GA and 3- OHGA revealed that GA decreased the glutamate binding to receptors from plasma membranes of cerebral cortex and striatum of 7- and 15-day-old rats. In addition, by using glutamate antagonists and kainate binding assay, we verified that this effect involved non-NMDA receptors, probably kainate receptors. On the other hand, 3-OHGA inhibited glutamate binding to transporters from plasma membranes of striatum of 7-day-old rats. The glutamate uptake studies showed that GA decreased glutamate transport only in cerebral cortex slices of 7-day-old rats. Furthermore, this effect was not due to cellular death and was prevented by N-acetylcysteine preadministration suggesting the involvement of oxidative damage. Moreover, immunoblot analysis and glutamate uptake assays in the presence of GA and dihydrokainate (DHK) revealed that GA effect seems to involve GLAST transporters, which are expressed in early stages of rat brain development. In contrast, 3-OHGA did not affect glutamate uptake by brain slices. We also observed that both GA and 3-OHGA did not affect glutamate uptake by synaptosomal preparations from rat brain. Concluding, the effects provoked by GA and 3-OHGA at specific ages of development and also in distinct cerebral structures may possibly be explained by the differential ontogenetic and regional specific expression of the glutamate receptors and transporters in rat brain. Although these results can not explain the window of striatal vulnerability, they may contribute to elucidate the mechanisms of the neurological damage occurred during the first years of life in GA I patients.

A acidemia glutárica tipo I (AG I) causada pela deficiência severa da enzima glutaril-CoA desidrogenase, que catalisa a degradação de lisina (Lis), resulta no acúmulo predominante dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidroxiglutárico (3HG). Visto que os mecanismos responsáveis pelos danos cortical e estriatal observados nos pacientes ainda não estão totalmente esclarecidos, avaliamos a homeostase redox em diferentes regiões cerebrais (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (fígado e coração) de camundongos selvagens (Gcdh+/+) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-, modelo genético da AG I) com 15, 30 e 60 dias de vida. Os animais foram submetidos a uma sobrecarga de Lis através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) ou de uma dieta enriquecida com esse aminoácido (2,8 % ou 4,7% de Lis) por 60 horas ou 40 dias (2,8% de Lis). Determinamos as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), conteúdo de grupamentos sulfidrilas e formação de grupamentos carbonila, nitratos e nitritos e oxidação da 2’,7’- diclorofluoresceína (DCFH), concentrações de glutationa reduzida (GSH), bem como as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, glutationa redutase, superóxido dismutase, catalase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Inicialmente verificamos que os grupamentos sulfidrilas estavam reduzidas em cérebro e as concentrações de GSH estavam diminuidas em fígado de animais Gcdh-/- de 15 dias, quando comparados aos animais Gcdh+/+ alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis, além de diminuir os níveis de GSH e os grupamentos tióis em animais Gcdh-/-, aumentou a formação de carbonilas e a oxidação de DCFH, bem como alterou as atividades das enzimas antioxidantes em cérebro e fígado, quando comparados aos animais Gcdh+/+ que também receberam Lis. Por outro lado, os parâmetros avaliados em camundongos de 30 dias de vida não diferiram no cérebro e tecidos periféricos dos animais Gcdh-/- em relação aos camundongos selvagens alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis em animais Gcdh- /- de 30 dias de vida provocou um aumento das concentrações cerebrais de AG e 3HG, sendo aproximadamente 40% mais altas no estriado quando comparadas com as observadas em córtex cerebral. A injeção aguda de Lis e a administração da dieta enriquecida com Lis em animais Gcdh-/- de 30 dias provocaram dano oxidativo lipídico e proteico e alteraram as defesas antioxidantes em estriado e córtex cerebral, mas não nos outros tecidos desses camundongos com relação aos animais Gcdh+/+. Além disso, animais Gcdh-/- de 60 dias de vida tratados com dieta padrão ou dieta enriquecida com Lis (2,8%) por 40 dias, a partir do 21º dia de vida, mostraram apenas um aumento nos níveis de TBA-RS em córtex cerebral e estriado, enquanto que outros parâmetros avaliados não foram significativamente alterados. Finalmente, através de coloração com hematoxilina e eosina, observou-se a presença de vacúolos no estriado de animais Gcdh-/- de 60 dias de vida após 40 dias de dieta rica em Lis (2,8%). Já em córtex cerebral se encontraram vacúolos nos animais Gcdh-/- com dieta padrão, o que não foi acentuado pela sobrecarga de Lis. Concluindo, presumimos que uma alteração da homeostase redox celular causada por sobrecarga de Lis, principalmente nos estágios iniciais do desenvolvimento, possa contribuir para a patogênese do dano cerebral particularmente estriatal na AG I. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an organic acidemia caused by the severe deficiency of glutaryl-CoA dehydrogenase, that catalyzes the degradation of lysine (Lys), biochemically characterized by the predominant accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissues and biological fluids of patients. Considering that the mechanisms underlying the cortical and striatal damage observed in affected individuals remain unclear, we assessed parameters of redox homeostasis in different brain regions (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (liver and heart) of wildtype (Gcdh+/+) and knockout mice for the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (Gcdh-/-, a genetic model of GA I) with 15, 30 and 60 days old. The animals were submitted to an overload of Lys through a single intraperitoneal injection (8 umol / g) or to an enriched diet with this amino acid (2.8% or 4.7 % Lys) for 60 hours or 40 days (2.8% Lys). We determined the levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS), concentrations of sulfhydryl and carbonyl groups, nitrates and nitrites and oxidation of 2’,7’- dichlorofluorescein (DCFH), concentrations of reduced glutathione (GSH) as well as the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase, catalase and glucose-6- phosphate dehydrogenase. We initially found that the sulfhydryl groups were reduced in the brain and GSH concentrations were decreased in the liver of 15-day-old Gcdh-/- animals, compared to Gcdh+/+ animals. Besides decreasing the concentrations of GSH and thiol groups in Gcdh-/- mice, Lys acute injection also increased carbonyl formation and DCFH oxidation, and altered the profile of antioxidant enzyme activities in brain and liver, when compared to Gcdh+/+ mice receiving Lys. The parameters measured in 30-day-old Gcdh- /- mice did not differ in brain and peripheral tissues, as compared to wild type mice treated with normal diet. However, an acute injection of Lys caused an increase of GA and 3HG concentrations in the brain, approximately 40 % higher in the striatum, when compared to the cerebral cortex levels. The Lys acute injection and the enriched Lys diet caused protein oxidative damage and altered both enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses in striatum and cerebral cortex of Gcdh-/- mice, but not in other tissues of these mice, when compared to the wild type mice. Furthermore, 60-day-old Gcdh-/- mice treated with a standard or a Lys enriched diet (2.8 %) for 40 days (from the 21th day of life) showed only an increase of TBA-RS levels in cerebral cortex and striatum, whereas the other parameters analyzed were not altered. Finally, histological brain sections of 60-day-old mice, stained with hematoxilin and eosin, showed the presence of vacuoles in striatum of Gcdh-/- animals 40 days after the diet supplemented with Lys (2.8%). In the cerebral cortex, vacuoles were observed in Gcdh-/- animals with standard diet, but this was not accentuated by Lys overload. In conclusion, it may be presumed that alterations in the cellular redox homeostasis caused by Lys overload, especially in the early stages of development, contribute to the pathogenesis of brain damage observed in GA I, particularly in striatum.

Diversos trabalhos têm relacionado a fisiopatogenia da acidemia glutárica tipo I (GA I) com a excitotoxicidade glutamatérgica. Ainda que sob intenso debate, a maioria desses trabalhos se baseia na semelhança estrutural existente entre o glutamato e os principais ácidos orgânicos acumulados na GA I, os ácidos glutárico (GA) e 3-hidroxiglutárico (3-OHGA). Tendo em vista a janela de vulnerabilidade cerebral dos pacientes afetados pela GA I durante os primeiros anos de vida e o distinto padrão de expressão e propriedades de receptores e transportadores glutamatérgicos ao longo do desenvolvimento, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos ácidos GA e 3-OHGA sobre a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática e sobre a captação de glutamato por fatias e preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado de ratos de 7 a 60 dias de vida. Nossos resultados demonstraram que o 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Observamos ainda que esse ácido parece interagir com receptores do tipo NMDA, agindo como um fraco agonista desses receptores por aumentar a ligação de MK-801 em receptores de membrana e o influxo de Ca2+ em fatias de córtex cerebral de ratos. Através do estudo ontogenético da ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática de ratos na presença de GA e 3-OHGA, verificamos que o GA inibe a ligação de glutamato a seus receptores de membrana em córtex cerebral e estriado de ratos de 7 e 15 dias de vida. A utilização de antagonistas glutamatérgicos juntamente com a inibição da ligação de cainato a seus receptores na presença de GA indicaram que os efeitos desse ácido sobre a ligação de glutamato a seus receptores parecem envolver receptores do tipo não- NMDA, possivelmente do tipo cainato. O ácido 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato somente a transportadores de membrana de estriado de ratos de 7 dias de vida. Os estudos de captação de glutamato mostraram que o GA inibe o transporte desse neurotransmissor apenas em fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida. Esse efeito não foi devido à morte celular e foi prevenido por pré-administração de N-acetilcisteína sugerindo o envolvimento de dano oxidativo na presença do GA. Além disso, o efeito do GA parece envolver os transportadores glutamatérgicos do tipo GLAST, expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento cerebral. Em contraste, o ácido 3-OHGA não afetou a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral e estriado de ratos. Observamos também que os ácidos GA e 3-OHGA não afetaram a captação de glutamato por preparações sinaptossomais de cérebro de ratos. Os efeitos detectados no presente estudo pelos ácidos GA e 3-OHGA em períodos específicos do desenvolvimento e também nas distintas estruturas cerebrais estudadas podem estar relacionados com a expressão diferenciada de receptores e transportadores glutamatérgicos no cérebro de ratos. Apesar de não explicarem a janela de vulnerabilidade estriatal, tais resultados podem auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano neurológico ocorrido durante os primeiros anos de vida dos pacientes com GA I. / The role of excitotoxicity in the cerebral damage of glutaric acidemia type I (GA I) is under intense debate. Several studies relate the excitotoxic actions of the major metabolites accumulating in GA I, glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric acids (3-OHGA), based on the chemical structural similarity between these organic acids and glutamate. Considering that GA I patients present a window of cerebral vulnerability during the first years of life and the variable ontogenetic pattern of glutamate receptors and transporters expression and properties, the objective of the present work was to investigate the effects of GA and 3-OHGA on glutamate binding to receptors and transporters from synaptic plasma membranes and on glutamate uptake by slices and synaptosomal preparations from cerebral cortex and striatum during rat brain development. Our results demonstrated that 3-OHGA inhibited glutamate binding to receptors and transporters from plasma membranes of cerebral cortex of 30-day-old rats. Moreover, its effect on glutamate receptors seems to be directed towards NMDA receptors and suggests that 3-OHGA acts as a weak agonist of these receptors by increasing the MK-801 binding to membrane receptors and Ca2+ influx into cerebral cortex slices of rats. The ontogenetic study of glutamate binding to receptors and transporters in the presence of GA and 3- OHGA revealed that GA decreased the glutamate binding to receptors from plasma membranes of cerebral cortex and striatum of 7- and 15-day-old rats. In addition, by using glutamate antagonists and kainate binding assay, we verified that this effect involved non-NMDA receptors, probably kainate receptors. On the other hand, 3-OHGA inhibited glutamate binding to transporters from plasma membranes of striatum of 7-day-old rats. The glutamate uptake studies showed that GA decreased glutamate transport only in cerebral cortex slices of 7-day-old rats. Furthermore, this effect was not due to cellular death and was prevented by N-acetylcysteine preadministration suggesting the involvement of oxidative damage. Moreover, immunoblot analysis and glutamate uptake assays in the presence of GA and dihydrokainate (DHK) revealed that GA effect seems to involve GLAST transporters, which are expressed in early stages of rat brain development. In contrast, 3-OHGA did not affect glutamate uptake by brain slices. We also observed that both GA and 3-OHGA did not affect glutamate uptake by synaptosomal preparations from rat brain. Concluding, the effects provoked by GA and 3-OHGA at specific ages of development and also in distinct cerebral structures may possibly be explained by the differential ontogenetic and regional specific expression of the glutamate receptors and transporters in rat brain. Although these results can not explain the window of striatal vulnerability, they may contribute to elucidate the mechanisms of the neurological damage occurred during the first years of life in GA I patients.

A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA), dano oxidativo e alterações neurológicas, como degeneração estriatal e convulsões. Considerando que o óxido nítrico é um mensageiro químico trans-sináptico que está envolvido em diversos eventos fisiopatologógicos e seu papel na toxicidade induzida pelo MMA é pouco conhecido, nós decidimos investigar a participação deste radical livre nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intraestriatal de MMA. No primeiro trabalho, foi evidenciado que a administração intraestriatal de um inibidor não-seletivo da enzima óxido nítrico sintase, metil éster de Nϖ-nitro-L-arginina (LNAME: 10-4 - 100 nmol/0,5 μl), exerceu efeito bifásico nas convulsões e na carbonilação proteíca induzidas pela injeção de MMA (4,5 μmol/1,5 μl; 30 minutos após a injeção de L-NAME) no estriado de ratos. Estes resultados sugeriram um envolvimento do óxido nítrico nas convulsões e no dano oxidativo induzido pelo MMA. Em um segundo momento, confirmamos o envolvimento do óxido nítrico nas convulsões induzidas por MMA, uma vez que a injeção intraestriatal de MMA causou um aumento na concentração de nitrito e nitrato (NO2 e NO3) estriatal. Além disso, os episódios convulsivos induzidos por MMA apresentaram uma correlação significativa com a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase no estriado injetado, mas não com os níveis de carbonilação protéica, um marcador de dano oxidativo protéico. Neste estudo também foi avaliado o efeito da administração intraestriatal do azul de metileno (AM; 0,015 a 1,5 nmol/ 0,5 μl), que possui atividade antioxidante e é um inibidor da guanilato ciclase, nas convulsões e dano oxidativo induzidos pelo MMA. O AM (1,5 nmol/0,5 μl) diminuiu a formação de NO2 e NO3 estriatal e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses dados sugerem que a atividade da Na+,K+-ATPase pode ser de grande importância para a gênese das convulsões induzidas pelo MMA e que o AM exerce efeito neuroprotetor contra as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo MMA. Além disso, se essas alterações ocorerem nos pacientes com acidemia metilmalônica, é possível propor que o AM poderia ser considerado como uma terapia adjuvante para o tratamento desta acidemia. O efeito da administração do 7-nitroindazol (7-NI; 3-60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima NOSn, nas convulsões, carbonilação protéica, produção de NO2 e NO3 e na atividade da Na+,K+-ATPase após trinta minutos da administração intraestriatal de MMA (6 μmol/ 2 μl) também foi avaliado. O tratamento com 7-NI (60 mg/kg, i.p.) potencializou as convulsões, aumentou a carbonilação protéica e reduziu a produção de NO2 e NO3 induzidos pelo MMA, entretanto, este tratamento não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase. A adminstração intraestriatal de L-arginina (50 nmol/ 0.5 μl), mas não de D-arginina (5 and 50 nmol/ 0.5 μl), aumentou a produção de NO2 e NO3 e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses resultados sugerem que o óxido nítrico neuronal pode exercer um efeito protetor sobre as convulsões bem como nas alterações neuroquímicas evidenciadas neste modelo de acidemia orgânica. Concluindo, estes resultados ampliam o papel dos radicais livres nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intra-estriatal de MMA.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Tissue methylmalonic acid (MMA) accumulation is the biochemical hallmark of methylmalonic acidemia. Clinically, the disease is characterized by progressive neurological deterioration and renal failure, whose pathophysiology is still undefined. In the present study we investigated the effect of acute MMA administration on some important parameters of brain neurotransmission in cerebral cortex of rats, namely Na+/K+-ATP-ase, ouabain-sensitive ATPases and acetylcholinesterase activities, in the presence or absence of kidney injury induced by gentamicin administration. Thirty-day old Wistar rats were divided into four groups: control group (saline /saline); MMA (saline /MMA 1.67 µmol.g-1); gentamicin (gentamicin 70 mg.kg-1 /saline) and MMA plus gentamicin (gentamicin / MMA). Animals received one intraperitoneal injection of saline or gentamicin and, one hour after, the animals received three consecutive subcutaneous injections of MMA or saline, with an 11 hours interval between injections. One hour after the last injection the animals were killed and the cerebral cortex isolated. MMA administration by itself was not able to modify Na+/K+-ATPase, ATPases ouabain-sensitive or acetylcholinesterase activities in cerebral cortex of young rats. In rats receiving gentamicin simultaneously with MMA, it was observed an increase in the acetylcholinesterase activity in cerebral cortex, without any alteration in the activity of the other studied enzymes. Therefore, it may be speculated that cholinergic imbalance may play a role in the pathogenesis of the brain damage occurring in this disorder. Furthermore, the pathophysiology of tissue damage cannot be exclusively attributed to MMA toxicity, and control of kidney function should be considered as a priority in the management of these patients, specifically during episodes of metabolic decompensation, when MMA levels are higher. / O acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) é o principal achado bioquímico da acidemia metilmalônica. Clinicamente, a doença é caracterizada por deterioração neurológica progressiva e insuficiência renal, cuja fisiopatologia ainda encontra-se indefinida. No presente estudo investigamos o efeito da administração aguda de MMA em alguns parâmetros importantes de neurotransmissão no córtex cerebral de ratos. Os parâmetros avaliados foram, a atividade das enzimas Na+/K+-ATPase, ATPases insensíveis a ouabaína e atividade da acetilcolinesterase, na presença ou na ausência de lesão renal induzida pela administração de gentamicina. Os ratos Wistar com 30 dias de idade foram divididos em quatro grupos: grupo controle (salina / salina); MMA (salina / 1,67 µmol.g-1 de MMA); gentamicina (70 mg.kg-1 de gentamicina / salina) e MMA juntamente com gentamicina (gentamicina / MMA). Os animais receberam uma injeção intraperitoneal de salina ou de gentamicina e, uma hora após, os animais receberam três injeções subcutâneas consecutivas de MMA ou de salina, com um intervalo de 11 horas entre injeções. Uma hora após a última injeção os animais foram mortos e o córtex cerebral isolado. A administração de MMA não foi capaz de modificar as atividades da Na+/K+-ATPase, das ATPases insensíveis a ouabaína ou da acetilcolinesterase no córtex cerebral de ratos jovens. Nos ratos que receberam gentamicina simultaneamente com MMA, observou-se um aumento na atividade da acetilcolinesterase no córtex cerebral, sem nenhuma alteração na atividade das outras enzimas estudadas. Consequentemente, pode-se especular que o desequilíbrio colinérgico pode exercer um papel na patogênese dos danos cerebrais que ocorrem nesta doença. Além disso, a fisiopatologia dos danos teciduais não pode ser atribuída exclusivamente à toxicidade do MMA, e o controle da função renal deve ser considerado como uma prioridade no cuidado destes pacientes, especificamente durante episódios de descompensação metabólica, quando os níveis de MMA são mais elevados.