A acidemia glutárica tipo I (AG I) causada pela deficiência severa da enzima glutaril-CoA desidrogenase, que catalisa a degradação de lisina (Lis), resulta no acúmulo predominante dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidroxiglutárico (3HG). Visto que os mecanismos responsáveis pelos danos cortical e estriatal observados nos pacientes ainda não estão totalmente esclarecidos, avaliamos a homeostase redox em diferentes regiões cerebrais (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (fígado e coração) de camundongos selvagens (Gcdh+/+) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-, modelo genético da AG I) com 15, 30 e 60 dias de vida. Os animais foram submetidos a uma sobrecarga de Lis através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) ou de uma dieta enriquecida com esse aminoácido (2,8 % ou 4,7% de Lis) por 60 horas ou 40 dias (2,8% de Lis). Determinamos as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), conteúdo de grupamentos sulfidrilas e formação de grupamentos carbonila, nitratos e nitritos e oxidação da 2’,7’- diclorofluoresceína (DCFH), concentrações de glutationa reduzida (GSH), bem como as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, glutationa redutase, superóxido dismutase, catalase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Inicialmente verificamos que os grupamentos sulfidrilas estavam reduzidas em cérebro e as concentrações de GSH estavam diminuidas em fígado de animais Gcdh-/- de 15 dias, quando comparados aos animais Gcdh+/+ alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis, além de diminuir os níveis de GSH e os grupamentos tióis em animais Gcdh-/-, aumentou a formação de carbonilas e a oxidação de DCFH, bem como alterou as atividades das enzimas antioxidantes em cérebro e fígado, quando comparados aos animais Gcdh+/+ que também receberam Lis. Por outro lado, os parâmetros avaliados em camundongos de 30 dias de vida não diferiram no cérebro e tecidos periféricos dos animais Gcdh-/- em relação aos camundongos selvagens alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis em animais Gcdh- /- de 30 dias de vida provocou um aumento das concentrações cerebrais de AG e 3HG, sendo aproximadamente 40% mais altas no estriado quando comparadas com as observadas em córtex cerebral. A injeção aguda de Lis e a administração da dieta enriquecida com Lis em animais Gcdh-/- de 30 dias provocaram dano oxidativo lipídico e proteico e alteraram as defesas antioxidantes em estriado e córtex cerebral, mas não nos outros tecidos desses camundongos com relação aos animais Gcdh+/+. Além disso, animais Gcdh-/- de 60 dias de vida tratados com dieta padrão ou dieta enriquecida com Lis (2,8%) por 40 dias, a partir do 21º dia de vida, mostraram apenas um aumento nos níveis de TBA-RS em córtex cerebral e estriado, enquanto que outros parâmetros avaliados não foram significativamente alterados. Finalmente, através de coloração com hematoxilina e eosina, observou-se a presença de vacúolos no estriado de animais Gcdh-/- de 60 dias de vida após 40 dias de dieta rica em Lis (2,8%). Já em córtex cerebral se encontraram vacúolos nos animais Gcdh-/- com dieta padrão, o que não foi acentuado pela sobrecarga de Lis. Concluindo, presumimos que uma alteração da homeostase redox celular causada por sobrecarga de Lis, principalmente nos estágios iniciais do desenvolvimento, possa contribuir para a patogênese do dano cerebral particularmente estriatal na AG I. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an organic acidemia caused by the severe deficiency of glutaryl-CoA dehydrogenase, that catalyzes the degradation of lysine (Lys), biochemically characterized by the predominant accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissues and biological fluids of patients. Considering that the mechanisms underlying the cortical and striatal damage observed in affected individuals remain unclear, we assessed parameters of redox homeostasis in different brain regions (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (liver and heart) of wildtype (Gcdh+/+) and knockout mice for the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (Gcdh-/-, a genetic model of GA I) with 15, 30 and 60 days old. The animals were submitted to an overload of Lys through a single intraperitoneal injection (8 umol / g) or to an enriched diet with this amino acid (2.8% or 4.7 % Lys) for 60 hours or 40 days (2.8% Lys). We determined the levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS), concentrations of sulfhydryl and carbonyl groups, nitrates and nitrites and oxidation of 2’,7’- dichlorofluorescein (DCFH), concentrations of reduced glutathione (GSH) as well as the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase, catalase and glucose-6- phosphate dehydrogenase. We initially found that the sulfhydryl groups were reduced in the brain and GSH concentrations were decreased in the liver of 15-day-old Gcdh-/- animals, compared to Gcdh+/+ animals. Besides decreasing the concentrations of GSH and thiol groups in Gcdh-/- mice, Lys acute injection also increased carbonyl formation and DCFH oxidation, and altered the profile of antioxidant enzyme activities in brain and liver, when compared to Gcdh+/+ mice receiving Lys. The parameters measured in 30-day-old Gcdh- /- mice did not differ in brain and peripheral tissues, as compared to wild type mice treated with normal diet. However, an acute injection of Lys caused an increase of GA and 3HG concentrations in the brain, approximately 40 % higher in the striatum, when compared to the cerebral cortex levels. The Lys acute injection and the enriched Lys diet caused protein oxidative damage and altered both enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses in striatum and cerebral cortex of Gcdh-/- mice, but not in other tissues of these mice, when compared to the wild type mice. Furthermore, 60-day-old Gcdh-/- mice treated with a standard or a Lys enriched diet (2.8 %) for 40 days (from the 21th day of life) showed only an increase of TBA-RS levels in cerebral cortex and striatum, whereas the other parameters analyzed were not altered. Finally, histological brain sections of 60-day-old mice, stained with hematoxilin and eosin, showed the presence of vacuoles in striatum of Gcdh-/- animals 40 days after the diet supplemented with Lys (2.8%). In the cerebral cortex, vacuoles were observed in Gcdh-/- animals with standard diet, but this was not accentuated by Lys overload. In conclusion, it may be presumed that alterations in the cellular redox homeostasis caused by Lys overload, especially in the early stages of development, contribute to the pathogenesis of brain damage observed in GA I, particularly in striatum.

A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA), dano oxidativo e alterações neurológicas, como degeneração estriatal e convulsões. Considerando que o óxido nítrico é um mensageiro químico trans-sináptico que está envolvido em diversos eventos fisiopatologógicos e seu papel na toxicidade induzida pelo MMA é pouco conhecido, nós decidimos investigar a participação deste radical livre nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intraestriatal de MMA. No primeiro trabalho, foi evidenciado que a administração intraestriatal de um inibidor não-seletivo da enzima óxido nítrico sintase, metil éster de Nϖ-nitro-L-arginina (LNAME: 10-4 - 100 nmol/0,5 μl), exerceu efeito bifásico nas convulsões e na carbonilação proteíca induzidas pela injeção de MMA (4,5 μmol/1,5 μl; 30 minutos após a injeção de L-NAME) no estriado de ratos. Estes resultados sugeriram um envolvimento do óxido nítrico nas convulsões e no dano oxidativo induzido pelo MMA. Em um segundo momento, confirmamos o envolvimento do óxido nítrico nas convulsões induzidas por MMA, uma vez que a injeção intraestriatal de MMA causou um aumento na concentração de nitrito e nitrato (NO2 e NO3) estriatal. Além disso, os episódios convulsivos induzidos por MMA apresentaram uma correlação significativa com a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase no estriado injetado, mas não com os níveis de carbonilação protéica, um marcador de dano oxidativo protéico. Neste estudo também foi avaliado o efeito da administração intraestriatal do azul de metileno (AM; 0,015 a 1,5 nmol/ 0,5 μl), que possui atividade antioxidante e é um inibidor da guanilato ciclase, nas convulsões e dano oxidativo induzidos pelo MMA. O AM (1,5 nmol/0,5 μl) diminuiu a formação de NO2 e NO3 estriatal e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses dados sugerem que a atividade da Na+,K+-ATPase pode ser de grande importância para a gênese das convulsões induzidas pelo MMA e que o AM exerce efeito neuroprotetor contra as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo MMA. Além disso, se essas alterações ocorerem nos pacientes com acidemia metilmalônica, é possível propor que o AM poderia ser considerado como uma terapia adjuvante para o tratamento desta acidemia. O efeito da administração do 7-nitroindazol (7-NI; 3-60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima NOSn, nas convulsões, carbonilação protéica, produção de NO2 e NO3 e na atividade da Na+,K+-ATPase após trinta minutos da administração intraestriatal de MMA (6 μmol/ 2 μl) também foi avaliado. O tratamento com 7-NI (60 mg/kg, i.p.) potencializou as convulsões, aumentou a carbonilação protéica e reduziu a produção de NO2 e NO3 induzidos pelo MMA, entretanto, este tratamento não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase. A adminstração intraestriatal de L-arginina (50 nmol/ 0.5 μl), mas não de D-arginina (5 and 50 nmol/ 0.5 μl), aumentou a produção de NO2 e NO3 e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses resultados sugerem que o óxido nítrico neuronal pode exercer um efeito protetor sobre as convulsões bem como nas alterações neuroquímicas evidenciadas neste modelo de acidemia orgânica. Concluindo, estes resultados ampliam o papel dos radicais livres nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intra-estriatal de MMA.

Diversos trabalhos têm relacionado a fisiopatogenia da acidemia glutárica tipo I (GA I) com a excitotoxicidade glutamatérgica. Ainda que sob intenso debate, a maioria desses trabalhos se baseia na semelhança estrutural existente entre o glutamato e os principais ácidos orgânicos acumulados na GA I, os ácidos glutárico (GA) e 3-hidroxiglutárico (3-OHGA). Tendo em vista a janela de vulnerabilidade cerebral dos pacientes afetados pela GA I durante os primeiros anos de vida e o distinto padrão de expressão e propriedades de receptores e transportadores glutamatérgicos ao longo do desenvolvimento, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos ácidos GA e 3-OHGA sobre a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática e sobre a captação de glutamato por fatias e preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado de ratos de 7 a 60 dias de vida. Nossos resultados demonstraram que o 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Observamos ainda que esse ácido parece interagir com receptores do tipo NMDA, agindo como um fraco agonista desses receptores por aumentar a ligação de MK-801 em receptores de membrana e o influxo de Ca2+ em fatias de córtex cerebral de ratos. Através do estudo ontogenético da ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática de ratos na presença de GA e 3-OHGA, verificamos que o GA inibe a ligação de glutamato a seus receptores de membrana em córtex cerebral e estriado de ratos de 7 e 15 dias de vida. A utilização de antagonistas glutamatérgicos juntamente com a inibição da ligação de cainato a seus receptores na presença de GA indicaram que os efeitos desse ácido sobre a ligação de glutamato a seus receptores parecem envolver receptores do tipo não- NMDA, possivelmente do tipo cainato. O ácido 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato somente a transportadores de membrana de estriado de ratos de 7 dias de vida. Os estudos de captação de glutamato mostraram que o GA inibe o transporte desse neurotransmissor apenas em fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida. Esse efeito não foi devido à morte celular e foi prevenido por pré-administração de N-acetilcisteína sugerindo o envolvimento de dano oxidativo na presença do GA. Além disso, o efeito do GA parece envolver os transportadores glutamatérgicos do tipo GLAST, expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento cerebral. Em contraste, o ácido 3-OHGA não afetou a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral e estriado de ratos. Observamos também que os ácidos GA e 3-OHGA não afetaram a captação de glutamato por preparações sinaptossomais de cérebro de ratos. Os efeitos detectados no presente estudo pelos ácidos GA e 3-OHGA em períodos específicos do desenvolvimento e também nas distintas estruturas cerebrais estudadas podem estar relacionados com a expressão diferenciada de receptores e transportadores glutamatérgicos no cérebro de ratos. Apesar de não explicarem a janela de vulnerabilidade estriatal, tais resultados podem auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano neurológico ocorrido durante os primeiros anos de vida dos pacientes com GA I. / The role of excitotoxicity in the cerebral damage of glutaric acidemia type I (GA I) is under intense debate. Several studies relate the excitotoxic actions of the major metabolites accumulating in GA I, glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric acids (3-OHGA), based on the chemical structural similarity between these organic acids and glutamate. Considering that GA I patients present a window of cerebral vulnerability during the first years of life and the variable ontogenetic pattern of glutamate receptors and transporters expression and properties, the objective of the present work was to investigate the effects of GA and 3-OHGA on glutamate binding to receptors and transporters from synaptic plasma membranes and on glutamate uptake by slices and synaptosomal preparations from cerebral cortex and striatum during rat brain development. Our results demonstrated that 3-OHGA inhibited glutamate binding to receptors and transporters from plasma membranes of cerebral cortex of 30-day-old rats. Moreover, its effect on glutamate receptors seems to be directed towards NMDA receptors and suggests that 3-OHGA acts as a weak agonist of these receptors by increasing the MK-801 binding to membrane receptors and Ca2+ influx into cerebral cortex slices of rats. The ontogenetic study of glutamate binding to receptors and transporters in the presence of GA and 3- OHGA revealed that GA decreased the glutamate binding to receptors from plasma membranes of cerebral cortex and striatum of 7- and 15-day-old rats. In addition, by using glutamate antagonists and kainate binding assay, we verified that this effect involved non-NMDA receptors, probably kainate receptors. On the other hand, 3-OHGA inhibited glutamate binding to transporters from plasma membranes of striatum of 7-day-old rats. The glutamate uptake studies showed that GA decreased glutamate transport only in cerebral cortex slices of 7-day-old rats. Furthermore, this effect was not due to cellular death and was prevented by N-acetylcysteine preadministration suggesting the involvement of oxidative damage. Moreover, immunoblot analysis and glutamate uptake assays in the presence of GA and dihydrokainate (DHK) revealed that GA effect seems to involve GLAST transporters, which are expressed in early stages of rat brain development. In contrast, 3-OHGA did not affect glutamate uptake by brain slices. We also observed that both GA and 3-OHGA did not affect glutamate uptake by synaptosomal preparations from rat brain. Concluding, the effects provoked by GA and 3-OHGA at specific ages of development and also in distinct cerebral structures may possibly be explained by the differential ontogenetic and regional specific expression of the glutamate receptors and transporters in rat brain. Although these results can not explain the window of striatal vulnerability, they may contribute to elucidate the mechanisms of the neurological damage occurred during the first years of life in GA I patients.

A acidemia glutárica tipo I (AG I) causada pela deficiência severa da enzima glutaril-CoA desidrogenase, que catalisa a degradação de lisina (Lis), resulta no acúmulo predominante dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidroxiglutárico (3HG). Visto que os mecanismos responsáveis pelos danos cortical e estriatal observados nos pacientes ainda não estão totalmente esclarecidos, avaliamos a homeostase redox em diferentes regiões cerebrais (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (fígado e coração) de camundongos selvagens (Gcdh+/+) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-, modelo genético da AG I) com 15, 30 e 60 dias de vida. Os animais foram submetidos a uma sobrecarga de Lis através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) ou de uma dieta enriquecida com esse aminoácido (2,8 % ou 4,7% de Lis) por 60 horas ou 40 dias (2,8% de Lis). Determinamos as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), conteúdo de grupamentos sulfidrilas e formação de grupamentos carbonila, nitratos e nitritos e oxidação da 2’,7’- diclorofluoresceína (DCFH), concentrações de glutationa reduzida (GSH), bem como as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, glutationa redutase, superóxido dismutase, catalase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Inicialmente verificamos que os grupamentos sulfidrilas estavam reduzidas em cérebro e as concentrações de GSH estavam diminuidas em fígado de animais Gcdh-/- de 15 dias, quando comparados aos animais Gcdh+/+ alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis, além de diminuir os níveis de GSH e os grupamentos tióis em animais Gcdh-/-, aumentou a formação de carbonilas e a oxidação de DCFH, bem como alterou as atividades das enzimas antioxidantes em cérebro e fígado, quando comparados aos animais Gcdh+/+ que também receberam Lis. Por outro lado, os parâmetros avaliados em camundongos de 30 dias de vida não diferiram no cérebro e tecidos periféricos dos animais Gcdh-/- em relação aos camundongos selvagens alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis em animais Gcdh- /- de 30 dias de vida provocou um aumento das concentrações cerebrais de AG e 3HG, sendo aproximadamente 40% mais altas no estriado quando comparadas com as observadas em córtex cerebral. A injeção aguda de Lis e a administração da dieta enriquecida com Lis em animais Gcdh-/- de 30 dias provocaram dano oxidativo lipídico e proteico e alteraram as defesas antioxidantes em estriado e córtex cerebral, mas não nos outros tecidos desses camundongos com relação aos animais Gcdh+/+. Além disso, animais Gcdh-/- de 60 dias de vida tratados com dieta padrão ou dieta enriquecida com Lis (2,8%) por 40 dias, a partir do 21º dia de vida, mostraram apenas um aumento nos níveis de TBA-RS em córtex cerebral e estriado, enquanto que outros parâmetros avaliados não foram significativamente alterados. Finalmente, através de coloração com hematoxilina e eosina, observou-se a presença de vacúolos no estriado de animais Gcdh-/- de 60 dias de vida após 40 dias de dieta rica em Lis (2,8%). Já em córtex cerebral se encontraram vacúolos nos animais Gcdh-/- com dieta padrão, o que não foi acentuado pela sobrecarga de Lis. Concluindo, presumimos que uma alteração da homeostase redox celular causada por sobrecarga de Lis, principalmente nos estágios iniciais do desenvolvimento, possa contribuir para a patogênese do dano cerebral particularmente estriatal na AG I. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an organic acidemia caused by the severe deficiency of glutaryl-CoA dehydrogenase, that catalyzes the degradation of lysine (Lys), biochemically characterized by the predominant accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissues and biological fluids of patients. Considering that the mechanisms underlying the cortical and striatal damage observed in affected individuals remain unclear, we assessed parameters of redox homeostasis in different brain regions (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (liver and heart) of wildtype (Gcdh+/+) and knockout mice for the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (Gcdh-/-, a genetic model of GA I) with 15, 30 and 60 days old. The animals were submitted to an overload of Lys through a single intraperitoneal injection (8 umol / g) or to an enriched diet with this amino acid (2.8% or 4.7 % Lys) for 60 hours or 40 days (2.8% Lys). We determined the levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS), concentrations of sulfhydryl and carbonyl groups, nitrates and nitrites and oxidation of 2’,7’- dichlorofluorescein (DCFH), concentrations of reduced glutathione (GSH) as well as the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase, catalase and glucose-6- phosphate dehydrogenase. We initially found that the sulfhydryl groups were reduced in the brain and GSH concentrations were decreased in the liver of 15-day-old Gcdh-/- animals, compared to Gcdh+/+ animals. Besides decreasing the concentrations of GSH and thiol groups in Gcdh-/- mice, Lys acute injection also increased carbonyl formation and DCFH oxidation, and altered the profile of antioxidant enzyme activities in brain and liver, when compared to Gcdh+/+ mice receiving Lys. The parameters measured in 30-day-old Gcdh- /- mice did not differ in brain and peripheral tissues, as compared to wild type mice treated with normal diet. However, an acute injection of Lys caused an increase of GA and 3HG concentrations in the brain, approximately 40 % higher in the striatum, when compared to the cerebral cortex levels. The Lys acute injection and the enriched Lys diet caused protein oxidative damage and altered both enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses in striatum and cerebral cortex of Gcdh-/- mice, but not in other tissues of these mice, when compared to the wild type mice. Furthermore, 60-day-old Gcdh-/- mice treated with a standard or a Lys enriched diet (2.8 %) for 40 days (from the 21th day of life) showed only an increase of TBA-RS levels in cerebral cortex and striatum, whereas the other parameters analyzed were not altered. Finally, histological brain sections of 60-day-old mice, stained with hematoxilin and eosin, showed the presence of vacuoles in striatum of Gcdh-/- animals 40 days after the diet supplemented with Lys (2.8%). In the cerebral cortex, vacuoles were observed in Gcdh-/- animals with standard diet, but this was not accentuated by Lys overload. In conclusion, it may be presumed that alterations in the cellular redox homeostasis caused by Lys overload, especially in the early stages of development, contribute to the pathogenesis of brain damage observed in GA I, particularly in striatum.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Methylmalonic acidemia is an inborn error of metabolism characterized clinically and biochemically by tissue accumulation of methylmalonic acid (MMA) and neurological dysfunction, including convulsion. Furthermore, clinical data suggest that infections conditions can precipitate metabolic crisis and cause neurological changes observed in patients of acidemia. Provided that the MMA cause neurological complications, and that the inflammation can contribute to the occurrence of convulsions and cognitive deficit in several animal models, it is possible to suggest that inflammatory mediators, such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), facilitate MMA-induced convulsions. The iNOS is one of three isoforms of nitric oxide synthase (NOS), which generates nitric oxide (NO), a simple gaseous signaling molecule and free radical. The iNOS is induced at injury/inflammation sites, but is also constitutively expressed on some cells, such as in neurons. Studies in experimental models have already demonstrated that NO generated in the central nervous system (CNS), by endothelial and neuronal isoforms of NOS, is involved in MMA-induced convulsions. However, until the present moment are scarce the data in the literature evaluating the relationship of iNOS in experimental models of Methylmalonic Acidemia. The results published in the article has shown that iNOS knock-out C57BL/6 mice, when injected acutely with MMA (2 μmols/2 μl, intracerebroventricularly), have a shorter duration of seizures, no significant change in the mean amplitude of electroencephalographic waves (EEG); not increase the levels of nitrite and nitrate (NOx) compared to animals injected with saline, but have a partial reduction in the levels of 3-nitrotyrosine (3-NT) compared to wild animals that were also treated with MMA; similarly, show a partially lower inhibition of Na+,K+-ATPase, but exhibit no difference in succinate dehydrogenase (SDH) inhibition on cerebral cortex compared to wild mice which also received MMA. The results submitted in the manuscript has shown that Wistar rats, after being injected chronically with MMA (from 5th to 28th day of life, twice daily, with doses ranging from 0.76 to 1.67 mmol/g depending on the age of the animal, via subcutaneous) showed a reduced index of recognition in spatial learning/memory test, but show no anxiety at elevated plus maze test; they have a reduction in neutrophils, but an increase in the number of mononuclear leukocytes in the blood; and in addition show increased levels of interleukin-1beta (IL-1β), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), iNOS and 3-NT in the cerebral cortex. Considering the data presented in both studies, it was concluded that the MMA can cause seizures, nitrosative stress and inhibition of Na+,K+-ATPase activity in cerebral cortex of mice by mechanisms related to NO production via iNOS; and that the MMA can also cause neurocognitive deficits, altered immune system in blood and increase of pro-inflammatory cytokines, leading to increased expression of iNOS and nitrosative stress. / A Acidemia Metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado bioquimicamente e clinicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e disfunção neurológica, incluindo convulsões e déficit cognitivo. Além disso, dados clínicos sugerem que quadros infecciosos podem precipitar crises metabólicas e causar as alterações neurológicas observadas nos pacientes com essa acidemia. Desde que o MMA causa complicações neurológicas, e que a inflamação pode contribuir para a ocorrência de convulsões e déficits cognitivos em vários modelos animais, é possível sugerir que mediadores inflamatórios, como a enzima Óxido Nítrico Sintase Induzível (iNOS), facilitem as convulsões induzidas por MMA. A iNOS é uma das três isoformas da enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS), que gera o óxido nítrico (NO), uma molécula gasosa simples, sinalizadora e um radical livre. A iNOS é induzida em sítios de lesão/inflamação, mas também se expressa constitutivamente em algumas células, como nos neurônios. Estudos em modelos experimentais já demonstraram que o NO gerado no sistema nervos central (SNC), pelas isoformas endotelial e neuronal da NOS, tem envolvimento nas convulsões induzidas por MMA. Contudo, até o presente momento são escassos os dados na literatura avaliando a relação da iNOS em modelos experimentais da Acidemia Metilmalônica. Os resultados publicados no artigo mostraram que camundongos C57BL/6 nocaute para iNOS, ao serem injetados agudamente com MMA (2 μmols/2 μL, via intracerebroventricular), apresentam uma duração menor das convulsões, sem alteração significativa na amplitude média das ondas eletroencefalográficas (EEG); não aumentam os níveis de nitrito e nitrato (NOx) comparado aos animais injetados com solução salina, mas têm uma redução parcial nos níveis de 3-nitrotirosina (3-NT) comparado aos animais selvagens que também foram tratados com MMA; semelhantemente, mostram uma inibição parcialmente menor na atividade da enzima Na+,K+-ATPase; mas não exibem diferença na inibição da atividade da succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral quando comparados aos camundongos selvagens que também receberam MMA. Os resultados apresentados no manuscrito submetido mostram que ratos Wistar, após serem injetados cronicamente com MMA (do 5º ao 28º dia de vida, duas vezes ao dia, com doses variando de 0,76 à 1,67 mmol/g em função da idade do animal, via subcutânea), apresentam um reduzido índice de reconhecimento em teste de memória/aprendizado espacial, mas não demonstram ansiedade no teste do labirinto em cruz elevado; têm uma redução no número de neutrófilos, mas um aumento no número de leucócitos mononucleares no sangue; e além disso mostram aumento nos níveis de interleucina-1beta (IL-1β), do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), de iNOS e de 3-NT no córtex cerebral. Considerando os dados apresentados nos dois estudos, concluiu-se que o MMA pode causar convulsões, estresse nitrosativo e inibição da enzima Na+,K+-ATPase no córtex cerebral de camundongos por mecanismos relacionados à produção de NO via iNOS; e que o MMA também pode causar déficit neurocognitivo, alteração do sistema imunológico no sangue, e aumento de citocinas pró-inflamatórias, levando ao aumento na expressão da iNOS e estresse nitrosativo.

A epilepsia é uma desordem neurológica que afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos erros inatos do metabolismo (EIM) não serem a causa frequente de epilepsia, o sintoma mais comum presente em desordens metabólicas são crises epilépticas. Dentro dos EIM, estão as acidemias orgânicas que podem levar a geração de crises epiléticas durante um episódio de descompensação metabólica aguda, como por exemplo a acidemia glutárica tipo I (AG I). A AG I é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Tal alteração leva ao acúmulo de ácidos orgânicos em fluidos e tecidos. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a doença evolui com sinais clínicos de macrocefalia, déficits neurológicos e epilepsia. O aumento dos níveis de ácidos orgânicos no cérebro diminui a atividade da enzima Glutamato Descarboxilase (GAD) no parênquima cerebral e inibe a atividade da enzima Na+,K+,-ATPase. De acordo com estes achados, prévias análises bioquímicas de neocórtex e comportamentais de um modelo animal de AG I, camundongo nocaute para a enzima GCDH tratado com dieta com sobrecarga de lisina (4,7%) (Gcdh-/--Lis), mostram decréscimo do imunoconteúdo da GAD cortical, diminuição da liberação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) e diminuição da atividade Na+,K+,-ATPase e presença de crises epilépticas espontâneas Neste trabalho (aprovado pelo CEP-HCPA-140270) usamos este modelo animal de AG I para avaliar a função sináptica GABAérgica neocortical através de estudos eletrofisiológicos e bioquímicos, além de avaliar a expressão e o estado de fosforilação subunidade α da Na+,K+,-ATPase no neocórtex. A atividade da enzima GAD neocortical foi medida pela técnica de HPLC; as correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas e miniaturas (CIPS) nos neurônios piramidais foram avaliadas através da técnica eletrofisiológica de patch-clamp in vitro e avaliação da expressão total e a fosforilação do resíduo de Ser943 da Na+,K+,-ATPase neocortical foi feita através da técnica de Western Blot em camundongos Gcdh-/--Lis (P30-P45). Os resultados foram comparados com animais Gcdh-/- e Gcdh+/+ tratados com dieta normal (Gcdh-/--N e Gcdh+/+, respectivamente). Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade da GAD neocortical nos animais Gcdh-/--Lis quando compara aos animais Gcdh+/+ (P<0,05). A frequência das CIPS espontâneas e miniaturas nas células piramidais da camada V do neocórtex dos animais Gcdh-/-- Lis foi significativamente menor quando comparada às células dos animais Gcdh-/--N e Gcdh+/+ (P<0,0003). A curva de probabilidade cumulativa e a análise estatística de Kolmogorov-Smirnov confirmaram a diminuição na frequência das CIPS espontâneas e miniaturas (P<0,0001). A expressão da subunidade α da bomba Na+,K+-ATPase mostrou-se aumentada no neocórtex dos animais Gcdh-/--Lis quando comparada aos demais grupos (P<0,001). A avaliação do estado de fosforilação do resíduo de Ser943 revelou que os animais Gcdh-/--Lis apresentaram um aumento significativo da expressão do resíduo943 no neocórtex quando comparada aos demais grupos (P<0,001). Nossos dados sugerem que os animais Gcdh-/--Lis apresentam uma redução na transmissão sináptica GABAérgica neocortical que pode estar associada à disfunção da enzima GAD; e uma diminuição da atividade da bomba Na+,K+-ATPase neocortical possivelmente causada pela diminuição da expressão da enzima e pelo aumento da fosforilação do resíduo Ser943 da subunidade α no neocortical. Estas alterações em conjunto podem estar contribuindo para os mecanismos de epileptogênese na AG I. / The epilepsy is a neurological disorder that affects approximately 65 million people throughout the world. Despite of inborn errors of metabolism (IEM) not being a frequent cause of epilepsy, the most common symptom in metabolic disorders are epileptic seizures. Within the IEM, are the organic acidemias, such as, glutaric acidemia type I (GAI), that are associated with epileptic seizures during acute metabolic decompensation. The GAI is an autosomal recessive disease caused by deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH).This deficiency leads to the accumulation of organic acids in body fluids and tissues. If not diagnosed and treated early, this disease evolves to neurological deficits, macrocephaly and epilepsy. The increased levels of organic acids in the brain, such as glutaric, glutaconic and 3-hydroxyglutaric acids, decreases the activity of the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) in the brain parenchyma and cause the inhibition of the enzyme activity NA+,K+-ATPase. Interestingly, previous biochemical and behavioral analysis of an animal model of GAI, the GCDH knockout mice treated with lysine overload diet (4.7%) (Gcdh-/--Lis), had shown decreased GAD immune content, reduced GABA release and decreased activity Na+,K+-ATPase in the neocortex; and development of spontaneous seizures. In this work (approved by the CEP-HCPA-140270) we used this animal model to study the neocortical GABAergic synaptic function and the expression and the phosphorylation state of Na+,K+-ATPase α subunit in the neocortex. The GAD activity was measured by HPLC technique; the spontaneous and miniature inhibitory post-synaptic currents (IPSC) were evaluated by in vitro patch-clamping recordings from pyramidal cells; and the expression and the phosphorylation of total residue to Ser943 of Na+, K+- ATPase was performed by Western Blot in mice Gcdh-/--Lis (P30-P45). As controls we used Gcdh (Gcdh-/--N) and Gcdh+/+ animals treated with normal diet. Our results showed a significant decrease in the neocortical GAD activity in Gcdh-/--Lis mice when compared to Gcdh+/+ group (P<0.05). The spontaneous and miniature IPSC frequencies onto layer V pyramidal cells from Gcdh-/--Lis mice were significantly lower when compared to Gcdh-/--N and Gcdh+/+ mice (P<0.0003). The cumulative probability and the statistical analysis the Kolmogorov-Smirnov confirmed the decrease in the frequency of spontaneous and miniature IPSC (P<0.0001). The expression of Na+,K+-ATPase α subunit was higher in the neocortex from Gcdh-/--Lis when compared to the other groups (P<0.001). Also, the Gcdh-/--Lis mice had a significant increased fosforilation of Na+,K+-ATPase residual Ser943 in the neocortex when compared to the other groups (P<0.001). Our data suggested that the neocortex of Gcdh-/--Lys mice exhibited reduction in GABAergic inhibition that may be attributed to a GAD dysfunction level; and decreased Na+,K+-ATPase activity that could be caused by decrease in its expression and increased phosphorylation of residue Ser943 α subunit. Taken altogether, these alterations could contribute to the mechanisms of epileptogenesis observed in GAI.

O ácido metilmalônico (MMA) é um agente convulsivante endógeno que se acumula na acidemia metilmalônica, um erro inato no metabolismo caracterizado por disfunções neurológicas severas, predispondo ao aparecimento de convulsão. O mecanismo responsável pelas convulsões induzidas pelo MMA envolve a ativação do receptor NMDA. O envolvimento GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA ainda não foi demonstrado. Desta forma, no presente estudo objetivou investigar o envolvimento de macanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA. Ratos adultos foram injetados (i.c.v.) com muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK- 801 (6 nmol/1 ml), piridoxine (2 mmol/ 4 ml) ou salina (0.15 mmol/1 ml). Após trinta minutos, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) ou NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) eram injetados. Após estas injeções, os animais eram transferidos imediatamente para um campo aberto, sendo observado o aparecimento de convulsões. Após a avaliação comportamental, foi dosada a atividade glutamato descarboxilase (GAD) em homogeneizado de córtex cerebral, mensurando a quantidade de 14CO2 liberado do L-[14C]-glutamato. As convulsões foram confirmadas pelo estudo eletrencefalográfico. O MMA induziu convulsões do tipo crônicas de forma dose-dependente e reduziu a atividade da GAD no córtex cerebral ex vivo. A atividade da GAD correlacionou-se negativamente com a duração das convulsões (r=- 0.873, P<0.01), mas somente o MK-801 e a piridoxina reverteram à inibição da GAD pelo MMA. Estes resultados sugerem o envolvimento de mecanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA, e que a inibição da GAD depende da ativação de receptores NMDA ou da proteção da enzima pela piridoxina. Por fim, o presente estudo propôs, de forma inovadora, o envolvimento do sistema GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA e o envolvimento dos receptores NMDA na falha da transmissão GABAérgica. / Methylmalonic acid (MMA) is an endogenous convulsing compound that accumulates in methylmalonic acidemia, an inborn error of the metabolism characterized by severe neurological dysfunction, including seizures. The mechanisms by which MMA causes seizures involves the activation of the NMDA receptors, but whether GABAergic mechanisms are involved in the convulsions induced by MMA is not known. Therefore, in the current study we investigated the involvement of GABAergic mechanisms in the convulsions induced by MMA. Adult rats were injected (i.c.v.) with muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK-801 (6 nmol/1 ml), pyridoxine (2 mmol/ 4 ml) or physiological saline (0.15 mmol/1 ml). After thirty minutes, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) or NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) was injected. The animals were immediately transferred to an open field and observed for the appearance of convulsions. After behavioral evaluation, glutamate decarboxylase (GAD) activity was determined in cerebral cortex homogenates by measuring the 14CO2 released from L-[14C]-glutamic acid. Convulsions were confirmed by electroencephalographic recording in a subset of animals. MMA caused the appearance of clonic convulsions in a dose-dependent manner and decreased GAD activity in the cerebral cortex ex vivo. GAD activity negatively correlated with duration of MMA-induced convulsions (r=-0.873, P<0.01), in an individual basis. Muscimol, baclofen, MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced convulsions, but only MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced GAD inhibition. These data suggest GABAergic mechanisms are involved in the convulsive action of MMA, and that GAD inhibition by MMA depends on the activation of NMDA receptors or enzyme protection by pyridoxine. While in this study we present novel data about the role of the GABAergic system in MMAinduced convulsions, the central role of NMDA receptors in the neurochemical actions of MMA is further reinforced since they seem to trigger GABAergic failure.

A epilepsia é uma desordem neurológica que afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos erros inatos do metabolismo (EIM) não serem a causa frequente de epilepsia, o sintoma mais comum presente em desordens metabólicas são crises epilépticas. Dentro dos EIM, estão as acidemias orgânicas que podem levar a geração de crises epiléticas durante um episódio de descompensação metabólica aguda, como por exemplo a acidemia glutárica tipo I (AG I). A AG I é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Tal alteração leva ao acúmulo de ácidos orgânicos em fluidos e tecidos. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a doença evolui com sinais clínicos de macrocefalia, déficits neurológicos e epilepsia. O aumento dos níveis de ácidos orgânicos no cérebro diminui a atividade da enzima Glutamato Descarboxilase (GAD) no parênquima cerebral e inibe a atividade da enzima Na+,K+,-ATPase. De acordo com estes achados, prévias análises bioquímicas de neocórtex e comportamentais de um modelo animal de AG I, camundongo nocaute para a enzima GCDH tratado com dieta com sobrecarga de lisina (4,7%) (Gcdh-/--Lis), mostram decréscimo do imunoconteúdo da GAD cortical, diminuição da liberação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) e diminuição da atividade Na+,K+,-ATPase e presença de crises epilépticas espontâneas Neste trabalho (aprovado pelo CEP-HCPA-140270) usamos este modelo animal de AG I para avaliar a função sináptica GABAérgica neocortical através de estudos eletrofisiológicos e bioquímicos, além de avaliar a expressão e o estado de fosforilação subunidade α da Na+,K+,-ATPase no neocórtex. A atividade da enzima GAD neocortical foi medida pela técnica de HPLC; as correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas e miniaturas (CIPS) nos neurônios piramidais foram avaliadas através da técnica eletrofisiológica de patch-clamp in vitro e avaliação da expressão total e a fosforilação do resíduo de Ser943 da Na+,K+,-ATPase neocortical foi feita através da técnica de Western Blot em camundongos Gcdh-/--Lis (P30-P45). Os resultados foram comparados com animais Gcdh-/- e Gcdh+/+ tratados com dieta normal (Gcdh-/--N e Gcdh+/+, respectivamente). Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade da GAD neocortical nos animais Gcdh-/--Lis quando compara aos animais Gcdh+/+ (P<0,05). A frequência das CIPS espontâneas e miniaturas nas células piramidais da camada V do neocórtex dos animais Gcdh-/-- Lis foi significativamente menor quando comparada às células dos animais Gcdh-/--N e Gcdh+/+ (P<0,0003). A curva de probabilidade cumulativa e a análise estatística de Kolmogorov-Smirnov confirmaram a diminuição na frequência das CIPS espontâneas e miniaturas (P<0,0001). A expressão da subunidade α da bomba Na+,K+-ATPase mostrou-se aumentada no neocórtex dos animais Gcdh-/--Lis quando comparada aos demais grupos (P<0,001). A avaliação do estado de fosforilação do resíduo de Ser943 revelou que os animais Gcdh-/--Lis apresentaram um aumento significativo da expressão do resíduo943 no neocórtex quando comparada aos demais grupos (P<0,001). Nossos dados sugerem que os animais Gcdh-/--Lis apresentam uma redução na transmissão sináptica GABAérgica neocortical que pode estar associada à disfunção da enzima GAD; e uma diminuição da atividade da bomba Na+,K+-ATPase neocortical possivelmente causada pela diminuição da expressão da enzima e pelo aumento da fosforilação do resíduo Ser943 da subunidade α no neocortical. Estas alterações em conjunto podem estar contribuindo para os mecanismos de epileptogênese na AG I. / The epilepsy is a neurological disorder that affects approximately 65 million people throughout the world. Despite of inborn errors of metabolism (IEM) not being a frequent cause of epilepsy, the most common symptom in metabolic disorders are epileptic seizures. Within the IEM, are the organic acidemias, such as, glutaric acidemia type I (GAI), that are associated with epileptic seizures during acute metabolic decompensation. The GAI is an autosomal recessive disease caused by deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH).This deficiency leads to the accumulation of organic acids in body fluids and tissues. If not diagnosed and treated early, this disease evolves to neurological deficits, macrocephaly and epilepsy. The increased levels of organic acids in the brain, such as glutaric, glutaconic and 3-hydroxyglutaric acids, decreases the activity of the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) in the brain parenchyma and cause the inhibition of the enzyme activity NA+,K+-ATPase. Interestingly, previous biochemical and behavioral analysis of an animal model of GAI, the GCDH knockout mice treated with lysine overload diet (4.7%) (Gcdh-/--Lis), had shown decreased GAD immune content, reduced GABA release and decreased activity Na+,K+-ATPase in the neocortex; and development of spontaneous seizures. In this work (approved by the CEP-HCPA-140270) we used this animal model to study the neocortical GABAergic synaptic function and the expression and the phosphorylation state of Na+,K+-ATPase α subunit in the neocortex. The GAD activity was measured by HPLC technique; the spontaneous and miniature inhibitory post-synaptic currents (IPSC) were evaluated by in vitro patch-clamping recordings from pyramidal cells; and the expression and the phosphorylation of total residue to Ser943 of Na+, K+- ATPase was performed by Western Blot in mice Gcdh-/--Lis (P30-P45). As controls we used Gcdh (Gcdh-/--N) and Gcdh+/+ animals treated with normal diet. Our results showed a significant decrease in the neocortical GAD activity in Gcdh-/--Lis mice when compared to Gcdh+/+ group (P<0.05). The spontaneous and miniature IPSC frequencies onto layer V pyramidal cells from Gcdh-/--Lis mice were significantly lower when compared to Gcdh-/--N and Gcdh+/+ mice (P<0.0003). The cumulative probability and the statistical analysis the Kolmogorov-Smirnov confirmed the decrease in the frequency of spontaneous and miniature IPSC (P<0.0001). The expression of Na+,K+-ATPase α subunit was higher in the neocortex from Gcdh-/--Lis when compared to the other groups (P<0.001). Also, the Gcdh-/--Lis mice had a significant increased fosforilation of Na+,K+-ATPase residual Ser943 in the neocortex when compared to the other groups (P<0.001). Our data suggested that the neocortex of Gcdh-/--Lys mice exhibited reduction in GABAergic inhibition that may be attributed to a GAD dysfunction level; and decreased Na+,K+-ATPase activity that could be caused by decrease in its expression and increased phosphorylation of residue Ser943 α subunit. Taken altogether, these alterations could contribute to the mechanisms of epileptogenesis observed in GAI.

Estudamos a homeostase energética no cérebro (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (coração e músculo esquelético) de camundongos selvagens (WT) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-), modelo animal genético para estudo da acidemia glutárica tipo I (AG I), com 15 e 30 dias de vida. Esses animais também foram submetidos a uma sobrecarga de lisina através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) desse aminoácido ou de uma dieta rica em lisina (4,7 %) por 60 horas. Os parâmetros da homeostase energética analisados foram as atividades dos complexos I-III, II, II-III e IV da cadeia respiratória, das enzimas do ciclo do ácido cítrico (CAC) citrato sintase (CS), aconitase, isocitrato desidrogenase (IDH), α- cetoglutarato desidrogenase, sucinato desidrogenase e malato desidrogenase, da creatina quinase (CK) e da Na+, K+ - ATPase, bem como a liberação de lactato, os parâmetros respiratórios mitocondriais estados 3 e 4, razão de controle respiratório e o estado desacoplado, além do potencial de membrana mitocondrial na presença ou ausência de Ca2+. Estudos histológicos também foram conduzidos no córtex cerebral e estriado dos camundongos WT e Gcdh-/- de 30, 60 e 90 dias de vida submetidos por um pequeno (60 horas) ou longo (30 dias) período com dieta com alta concentração de lisina (4,7 %). Verificamos leves alterações nas atividades dos complexos da cadeia respiratória no cérebro, coração e músculo esquelético dos animais Gcdh-/- quando comparados aos WT com 15 e 30 dias de vida. Além disso, demonstramos uma diminuição significativa das atividades da CS e IDH em preparações mitocondriais de estriado de camundongos Gcdh-/- submetidos a uma sobrecarga de lisina associada a um pequeno aumento na liberação de lactato. No entanto, não encontramos alterações nos parâmetros respiratórios e no potencial de membrana em mitocôndrias de estriado dos camundongos Gcdh-/-quando comparados aos WT. Por outro lado, as atividades da Na+, K+-ATPase (cérebro) e CK (cérebro e músculo esquelético) foram significativamente menores em camundongos Gcdh-/- com 15 dias de vida quando submetidos a uma injeção intraperitoneal de lisina. Além disso, encontramos uma redução na atividade da Na+, K+-ATPase associada com uma diminuição da sua expressão em córtex cerebral, mas não em estriado e hipocampo, de camundongos Gcdh-/- com 30 dias de vida submetidos ou não a uma dieta rica em lisina. Finalmente, a análise histológica revelou a presença de vacúolos no córtex cerebral dos camundongos Gcdh-/- com 60 e 90 dias de vida, bem como no estriado dos animais Gcdh-/- com 90 dias de vida que foram alimentados com uma dieta rica em lisina por 30 dias. Concluindo, presumimos que uma redução das atividades da Na+, K+-ATPase e CK possa contribuir para o dano neurológico encontrado nos camundongos Gcdh-/- e possivelmente nos pacientes com AG I. / We studied energy homeostasis in the brain (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (heart and skeletal muscle) from 15 and 30- day-old wild type (WT) and glutaryl-CoA dehydrogenase deficient (Gcdh-/-) mice, which is a genetic animal model to study glutaric academia type I (GA I). These animals were also submitted to lysine overload through an intraperitoneal injection (8 μmol/g) of this amino acid or supplementing the mice with a high lysine (4.7 %) diet for 60 hours. The energy homeostasis parameters evaluated were the activities of the respiratory chain complexes I-III, II, II-III and IV, of the citric acid cycle (CAC) enzymes citrate synthase (CS), aconitase, isocitrate dehydrogenase (IDH), α-ketoglutarate dehydrogenase, succinate dehydrogenase and malate dehydrogenase, creatine kinase (CK) and Na+, K+ - ATPase, as well as the lactate release, the mitochondrial respiratory parameters states 3 and 4, respiratory control ratio and uncoupled state, besides the mitochondrial membrane potential in the presence or absence of Ca2+. Histological studies were also conducted in the cerebral cortex and striatum from 30, 60 and 90-day-old WT and Gcdh-/- mice submitted for a short (60 hours) or long (30 days) period to a high lysine (4.7 %) diet. We verified mild alterations in the respiratory chain activity in the brain, heart and skeletal muscle from Gcdh-/- animals when compared to 15 and 30-day-old WT mice. Furthermore, we demonstrated a reduction in the activities of CS and IDH in striatum mitochondrial preparations from Gcdh-/- mice submitted to a lysine overload associated with a mild increase of lactate release. However, we did not find alterations in the respiratory parameters and membrane potential in striatum mitochondria from Gcdh-/- mice when compared to WT. On the other hand, the activities of Na+, K+-ATPase (brain) and CK (brain and skeletal muscle) were significantly reduced in 15-day-old Gcdh-/- mice when received an intraperitoneal injection of lysine. Moreover, a reduction in the Na+, K+-ATPase activity associated with a diminution of its expression was observed in the cerebral cortex, but not in striatum and hippocampus, from 30-day-old Gcdh-/- mice submitted or not to a high lysine diet. Finally, the histological analyses revealed the presence of vacuoles in the cerebral cortex from 60 and 90-day-old Gcdh-/- mice, as well as in the striatum from 90-day-old Gcdh-/- animals that were fed a high Lys chow for 30 days. In conclusion, we presume that a reduction in the activities of Na+, K+- ATPase and CK may contribute to the brain damage found in Gcdh-/- mice and possibly in GA I patients.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde. / A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva causado pela deficiência da enzima metilmalonilCoA mutase. Os principais sinais e sintomas incluem danos neurológicos, renais e hepáticos. Essa doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de ácidos orgânicos no plasma, na urina e em tecidos dos pacientes afetados, particularmente o ácido metilmalônico (MMA). Adicionalmente, os pacientes apresentam quadros de hiperamonemia, especialmente durante crises metabólicas. Entretanto, até o momento, não se sabe a influência da hiperamonemia na fisiopatologia da doença, bem como a toxicidade do MMA associado à hiperamonemia. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar parâmetros bioenergéticos e inflamatórios em rim e fígado em um modelo animal de acidemia metilmalônica associada à hiperamonemia. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar machos com 7, 15, 30 e 60 dias de vida, divididos em 4 grupos experimentais: controle, MMA, acetato de amônio (AA) e MMA+AA. Os animais do grupo controle receberam solução de NaCl 0,9 % e os animais dos grupos tratados receberam MMA (1,76 µmol/g; s.c) associado ou não ao AA (2,65 µmol/g; i.p) por cinco dias.. Os resultados mostram aumento significativo da taxa de creatinina sérica no grupo de animais com 7 e 30 dias de vida nos grupos AA e MMA+AA, bem como aumento das concentrações de ureia, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase e creatina cinase em animais com 60 dias. Adicionalmente, foi observada uma redução da taxa de filtração glomerular nos grupos de animais com 7, 30 e 60 dias. A análise histológica apresentou resultados heterogêneos, como dilatação dos túbulos, vacuolização nos túbulos proximais e dilatação dos túbulos distais, assim como desestruturação celular com desintegração da sua estrutura, alteração do epitélio e retração glomerular no grupo MMA+AA. Também foram encontradas alterações significativas na atividade da enzima citrato sintase no tecido hepático de animais com 15, 30 e 60 dias e no tecido renal de animais com 15 dias de vida. A atividade da enzima succinato desidrogenase se mostrou diminuída no grupo de animais com 15, 30 e 60 dias sobre o tecido hepático e renal. Além disso, as atividades dos complexos da cadeia respiratória foram alteradas estatisticamente. A atividade do complexo IV foi aumentada em rins de animais com 15 dias de vida. Por outro lado, a atividade do complexo II-III da cadeia respiratória foi aumentada em tecido hepático de animais do grupo MMA+AA. No grupo de animais com 30 dias de vida, houve alteração das atividades dos complexos I e II no tecido hepático, bem como complexos e II, II-III e IV no tecido renal de animais com 60 dias de vida. Aliados a esses resultados, foram observadas alterações estatisticamente significativas nos níveis de interleucina 6 e fator de necrose tumoral alfa (TNFα) em tecido hepático dos animais do grupos MMA, AA e MMA+AA e de TNFα no tecido renal de animais com 30 dias de vida dos grupos MMA e MMA+AA. Tomados em conjunto, esses achados sugerem que alterações bioenergéticas e inflamatórios ocasionadas pela toxicidade da hiperamonemia associada ao MMA podem colaborar para os danos hepáticos e renais apresentados por pacientes acometidos pela acidemia metilmalônica.