Introduction and Objectives: The PDGFβ receptor and its ligand, PDGF-BB, are expressed throughout the central nervous system (CNS), including the hippocampas. Several reports confirm that PDGFβ receptors are neuroprotective against N-methyl-D-asparate (NMDA)-induced cell death in hippocampal neurons. NMDA receptor dysfunction is important for the expression of many symptoms of mental health disorders such as schizophrenia. The serotonin (5-HT) type 7 receptor was the most recent of the 5-HT receptor family to be identified and cloned. 5-HT receptors interact with several signaling systems in the CNS including receptors activated by the excitatory neurotransmitter glutamate such as the NMDA receptor. Although there is extensive interest in targeting the 5-HT7 receptor with novel therapeutic compounds, the function and signaling properties of 5-HT7 receptors in neurons remains poorly characterized. Methods: The SH-SY5Y neuroblastoma cell line, primary hippocampal cultures, and hippocampal slices were treated with 5-HT7 receptor agonists and antagonists. Western blotting was used to measure PDGFß receptor expression and phosphorylation as well as NMDA receptor subunit expression and phosphorylation levels. Real-time RT-PCR was used to measure mRNA level of PDGFß receptor in neuronal cultures. Cell death assays (MAP2, MTT) were used to measure the neuroprotective effects of 5-HT7 and PDGFß receptor activation. Results: My research involved elucidating the molecular mechanisms of neuroprotection after 5-HT7-induced PDGFß receptor upregulation. I demonstrated that 24 h treatment with the selective 5-HT7 receptor agonist, LP 12, increased not only the expression but also the activation of PDGFß receptors as measured by the phosphorylation of tyrosine 1021, the phospholipase Cγ binding site. Activation of the 5-HT7 receptor also selectively changed the expression and phosphorylation state of the NR2B subunit of the NMDA receptor. Activation of 5-HT7 receptors was neuroprotective against NMDA-induced toxicity in primary hippocampal neurons and this effect required PDGFß receptor kinase activity. Thus, long-term (24 h) activation of 5-HT7 receptors was neuroprotective via increasing the expression of a negative regulator of NMDA activity, the PDGFß receptor. In contrast, acute activation (5-30 min) of 5-HT7 receptor increased NMDA evoked current and altered NMDA receptor subunit phosphorylation in hippocampal neurons in a manner that was different from what we observed in our 24 h experiments. Conclusions: I identified two 5-HT7 receptor to NMDA receptor pathways: acute activation of the receptor increased NMDA-evoked currents whereas long-term 5-HT7 agonist treatment prevented NMDA-induced excitotoxicity in a PDGFß receptor-dependent manner. This research is significant in the ongoing advances for the treatment of mental heath disorders, such as schizophrenia and depression, that involve the 5-HT, glutamate, and neuronal growth factor systems.

Dados pré-clínicos e clínicos indicam que o canabidiol (CBD), um composto não-psicotomimético presente na planta Cannabis sativa, induz efeitos tipo-antipsicóticos. No entanto, poucos estudos em animais de laboratório investigaram as propriedades antipsicóticas do tratamento repetido com CBD. As alterações comportamentais induzidas pelo tratamento repetido com antagonistas dos receptores glutamatérgicos do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) têm sido propostas como um modelo animal de esquizofrenia. Evidências sugerem que uma hipofunção dos receptores NMDA estaria envolvida nos sintomas positivos, bem como nos sintomas negativos e cognitivos da esquizofrenia. Assim, no presente estudo, nós avaliamos se o tratamento repetido com CBD atenuaria as alterações comportamentais e moleculares induzidas pela administração crônica de um desses antagonistas, o MK-801. Camundongos C57BL/6J receberam injeções intraperitoneais diárias de MK-801 (0,1, 0,5 ou 1 mg/kg) durante 14, 21 ou 28 dias. Vinte e quatro horas após a última injeção, os animais foram submetidos ao teste de inibição pelo pré-pulso (PPI). Posteriormente, foi avaliado se o tratamento repetido com CBD (15, 30 e 60 mg/kg) atenuaria o prejuízo no teste de PPI induzido pelo MK-801 (1 mg/kg; por 28 dias). O tratamento com CBD iniciou-se no sexto dia após o início da administração de MK-801 e continuou até o final do tratamento. Nós também avaliamos se o tratamento com CBD atenuaria as alterações comportamentais induzidas pelo MK-801 nos testes de interação social e reconhecimento de objeto. Imediatamente após os testes comportamentais, os cérebros dos animais foram removidos e processados para posterior avaliação de alterações moleculares. Foram avaliadas as alterações na expressão das proteínas FosB/FosB e parvalbumina, um marcador de atividade neuronal e uma proteína de ligação ao cálcio expressa em uma subclasse de interneurônios GABAérgicos, respectivamente. Alterações na expressão do RNAm para o gene da subunidade obrigatória GluN1 do receptor NMDA (GRN1) também foram avaliadas. Adicionalmente, um número crescente de estudos indica que condições neuroinflamatórias e células gliais, como microglia e astrócitos, parecem estar envolvidas na patogênese da esquizofrenia. E, devido ao fato que o CBD, além de suas propriedades antipsicóticas, também induz efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores, nós também avaliamos possíveis alterações na expressão de NeuN (um marcador neuronal), Iba-1 (um marcador de microglia) e GFAP (um marcador de astrócitos) induzidas pelos tratamentos. Os efeitos do CBD foram comparados àqueles induzidos pelo antipsicótico atípico clozapina. A administração de MK-801, na dose de 1 mg/kg, por 28 dias induziu um prejuízo no teste de PPI, um efeito atenuado pelo tratamento repetido com CBD (30 e 60 mg/kg). Adicionalmente, o CBD também foi capaz de atenuar os prejuízos nos testes de interação social e reconhecimento de objeto induzidos pelo MK-801. Além das alterações comportamentais, o tratamento repetido com MK-801 aumentou a expressão da proteína FosB/FosB e diminuiu a expressão da parvalbumina no córtex pré-frontal medial (CPFm). Uma diminuição da expressão do mRNA para GRN1 no hipocampo também foi observada. O tratamento com MK-801 resultou ainda em aumento no número de astrócitos GFAP-positivos no CPFm e na porcentagem de células microgliais Iba-1-positivas apresentando um fenótipo reativo no CPFm e hipocampo dorsal, mas sem alterar o número total de células Iba-1-positivas. Nenhuma alteração no número de células NeuN-positivas foi observada. Assim como para as alterações comportamentais, as alterações moleculares induzidas pelo MK-801 também foram atenuadas pelo CBD. Entretanto, o CBD por si só não induziu qualquer efeito. Além disso, os efeitos do CBD foram semelhantes àqueles induzidos pelo tratamento repetido com clozapina. Estes resultados indicam que o tratamento repetido com o CBD, semelhante à clozapina, atenuou as alterações comportamentais tipo-esquizofrenia e as alterações moleculares observadas após a administração repetida de um antagonista dos receptores NMDA. Estes dados reforçam a proposta de que o CBD possui propriedades antipsicóticas. Embora os possíveis mecanismos de ação envolvidos nesses efeitos não estejam completamente elucidados, eles poderiam envolver as propriedades antiinflamatórias e neuroprotetoras do CBD. Além disso, nossos dados suportam a visão de que a inibição da microglia ativada pode ser benéfica para a melhora dos sintomas da esquizofrenia / Preclinical and clinical data suggest that cannabidiol (CBD), a major non-psychotomimetic compound from Cannabis sativa, induces antipsychotic-like effects. However, the antipsychotic properties of repeated CBD treatment have been poorly investigated. Behavioral changes induced by repeated treatment with glutamate NMDA receptor antagonists have been proposed as an animal model of schizophrenia-like symptoms. Evidence suggests that NMDA receptor hypofunction could be involved, in addition to the positive, also to the negative symptoms and cognitive deficits found in schizophrenia patients. In the present study we evaluated if repeated treatment with CBD would attenuate the behavioral and molecular changes induced by chronic administration of one of these antagonists, MK-801. Male C57BL/6J mice received daily intraperitoneal injections of MK-801 (0.1, 0.5 or 1 mg/kg) for 14, 21 or 28 days. Twenty-four hours after the last injection animals were submitted to the prepulse inhibition (PPI) test. After that, we investigated if repeated treatment with CBD (15, 30 and 60 mg/kg) would attenuate the PPI impairment induced by chronic treatment with MK-801 (1 mg/kg; 28 days). We also evaluate if the repeated CBD treatment would attenuate the MK-801-induced behavioral changes in social interaction and novel object recognition tests. CBD treatment began on the 6th day after the start of MK-801 administration and continued until the end of the treatment. Immediately after the behavioral tests, the mice brains were removed and processed to evaluate molecular changes. We measured changes in FosB/FosB and parvalbumin expression, a marker of neuronal activity and a calcium-binding protein expressed in a subclass of GABAergic interneurons, respectively. Changes in the mRNA expression of the NMDA receptor GluN1 subunit gene (GRN1) were also evaluated. Additionally, an increasing number of data has linked schizophrenia with neuroinflammatory conditions, and glial cells, such as microglia and astrocytes, have become increasingly attractive as candidates accounting for the pathogenesis of schizophrenia. And besides its antipsychotic properties, CBD also induces anti-inflammatory and neuroprotective effects. Thus, we also evaluated changes in NeuN (a neuronal marker), Iba-1 (a microglia marker) and GFAP (an astrocyte marker) expression in the medial prefrontal cortex (mPFC), dorsal striatum, nucleus accumbens core and shell, and dorsal hippocampus by immunohistochemistry. CBD effects were compared to those induced by the atypical antipsychotic clozapine. MK-801 administration at the dose of 1 mg/kg for 28 days impaired PPI responses. Chronic treatment with CBD (30 and 60 mg/kg) attenuated MK801-induced PPI impairment. CBD treatment also attenuated the impairment in social interaction and NOR tests induced by MK-801 treatment. Besides behavioral disruption, MK-801 treatment increased FosB/FosB expression and decreased parvalbumin expression in the mPFC. A decreased mRNA level of GRN1 in the hippocampus was also observed. Repeated MK-801 treatment also increased the number of GFAP-positive astrocytes in the mPFC and increased the percentage of Iba-1-positive microglia cells with a reactive phenotype in the mPFC and dorsal hippocampus without changing the number of Iba-1-positive cells. In addition, no change in the number of NeuN-positive cells was observed. All the molecular changes were attenuated by CBD. CBD by itself did not induce any effect. Moreover, CBD effects were similar to those induced by repeated clozapine treatment. These results indicate that repeated treatment with CBD, similar to clozapine, reverses the psychotomimetic-like effects and attenuates molecular changes observed after chronic administration of an NMDA receptor antagonist. These data reinforce the proposal that CBD may induce antipsychotic-like effects. Although the possible mechanism of action of these effects is still unknown, it may involve CBD anti-inflammatory and neuroprotective properties. Furthermore, our data support the view that inhibition of microglial activation may improve schizophrenia symptoms

Dados pré-clínicos e clínicos indicam que o canabidiol (CBD), um composto não-psicotomimético presente na planta Cannabis sativa, induz efeitos tipo-antipsicóticos. No entanto, poucos estudos em animais de laboratório investigaram as propriedades antipsicóticas do tratamento repetido com CBD. As alterações comportamentais induzidas pelo tratamento repetido com antagonistas dos receptores glutamatérgicos do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) têm sido propostas como um modelo animal de esquizofrenia. Evidências sugerem que uma hipofunção dos receptores NMDA estaria envolvida nos sintomas positivos, bem como nos sintomas negativos e cognitivos da esquizofrenia. Assim, no presente estudo, nós avaliamos se o tratamento repetido com CBD atenuaria as alterações comportamentais e moleculares induzidas pela administração crônica de um desses antagonistas, o MK-801. Camundongos C57BL/6J receberam injeções intraperitoneais diárias de MK-801 (0,1, 0,5 ou 1 mg/kg) durante 14, 21 ou 28 dias. Vinte e quatro horas após a última injeção, os animais foram submetidos ao teste de inibição pelo pré-pulso (PPI). Posteriormente, foi avaliado se o tratamento repetido com CBD (15, 30 e 60 mg/kg) atenuaria o prejuízo no teste de PPI induzido pelo MK-801 (1 mg/kg; por 28 dias). O tratamento com CBD iniciou-se no sexto dia após o início da administração de MK-801 e continuou até o final do tratamento. Nós também avaliamos se o tratamento com CBD atenuaria as alterações comportamentais induzidas pelo MK-801 nos testes de interação social e reconhecimento de objeto. Imediatamente após os testes comportamentais, os cérebros dos animais foram removidos e processados para posterior avaliação de alterações moleculares. Foram avaliadas as alterações na expressão das proteínas FosB/FosB e parvalbumina, um marcador de atividade neuronal e uma proteína de ligação ao cálcio expressa em uma subclasse de interneurônios GABAérgicos, respectivamente. Alterações na expressão do RNAm para o gene da subunidade obrigatória GluN1 do receptor NMDA (GRN1) também foram avaliadas. Adicionalmente, um número crescente de estudos indica que condições neuroinflamatórias e células gliais, como microglia e astrócitos, parecem estar envolvidas na patogênese da esquizofrenia. E, devido ao fato que o CBD, além de suas propriedades antipsicóticas, também induz efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores, nós também avaliamos possíveis alterações na expressão de NeuN (um marcador neuronal), Iba-1 (um marcador de microglia) e GFAP (um marcador de astrócitos) induzidas pelos tratamentos. Os efeitos do CBD foram comparados àqueles induzidos pelo antipsicótico atípico clozapina. A administração de MK-801, na dose de 1 mg/kg, por 28 dias induziu um prejuízo no teste de PPI, um efeito atenuado pelo tratamento repetido com CBD (30 e 60 mg/kg). Adicionalmente, o CBD também foi capaz de atenuar os prejuízos nos testes de interação social e reconhecimento de objeto induzidos pelo MK-801. Além das alterações comportamentais, o tratamento repetido com MK-801 aumentou a expressão da proteína FosB/FosB e diminuiu a expressão da parvalbumina no córtex pré-frontal medial (CPFm). Uma diminuição da expressão do mRNA para GRN1 no hipocampo também foi observada. O tratamento com MK-801 resultou ainda em aumento no número de astrócitos GFAP-positivos no CPFm e na porcentagem de células microgliais Iba-1-positivas apresentando um fenótipo reativo no CPFm e hipocampo dorsal, mas sem alterar o número total de células Iba-1-positivas. Nenhuma alteração no número de células NeuN-positivas foi observada. Assim como para as alterações comportamentais, as alterações moleculares induzidas pelo MK-801 também foram atenuadas pelo CBD. Entretanto, o CBD por si só não induziu qualquer efeito. Além disso, os efeitos do CBD foram semelhantes àqueles induzidos pelo tratamento repetido com clozapina. Estes resultados indicam que o tratamento repetido com o CBD, semelhante à clozapina, atenuou as alterações comportamentais tipo-esquizofrenia e as alterações moleculares observadas após a administração repetida de um antagonista dos receptores NMDA. Estes dados reforçam a proposta de que o CBD possui propriedades antipsicóticas. Embora os possíveis mecanismos de ação envolvidos nesses efeitos não estejam completamente elucidados, eles poderiam envolver as propriedades antiinflamatórias e neuroprotetoras do CBD. Além disso, nossos dados suportam a visão de que a inibição da microglia ativada pode ser benéfica para a melhora dos sintomas da esquizofrenia / Preclinical and clinical data suggest that cannabidiol (CBD), a major non-psychotomimetic compound from Cannabis sativa, induces antipsychotic-like effects. However, the antipsychotic properties of repeated CBD treatment have been poorly investigated. Behavioral changes induced by repeated treatment with glutamate NMDA receptor antagonists have been proposed as an animal model of schizophrenia-like symptoms. Evidence suggests that NMDA receptor hypofunction could be involved, in addition to the positive, also to the negative symptoms and cognitive deficits found in schizophrenia patients. In the present study we evaluated if repeated treatment with CBD would attenuate the behavioral and molecular changes induced by chronic administration of one of these antagonists, MK-801. Male C57BL/6J mice received daily intraperitoneal injections of MK-801 (0.1, 0.5 or 1 mg/kg) for 14, 21 or 28 days. Twenty-four hours after the last injection animals were submitted to the prepulse inhibition (PPI) test. After that, we investigated if repeated treatment with CBD (15, 30 and 60 mg/kg) would attenuate the PPI impairment induced by chronic treatment with MK-801 (1 mg/kg; 28 days). We also evaluate if the repeated CBD treatment would attenuate the MK-801-induced behavioral changes in social interaction and novel object recognition tests. CBD treatment began on the 6th day after the start of MK-801 administration and continued until the end of the treatment. Immediately after the behavioral tests, the mice brains were removed and processed to evaluate molecular changes. We measured changes in FosB/FosB and parvalbumin expression, a marker of neuronal activity and a calcium-binding protein expressed in a subclass of GABAergic interneurons, respectively. Changes in the mRNA expression of the NMDA receptor GluN1 subunit gene (GRN1) were also evaluated. Additionally, an increasing number of data has linked schizophrenia with neuroinflammatory conditions, and glial cells, such as microglia and astrocytes, have become increasingly attractive as candidates accounting for the pathogenesis of schizophrenia. And besides its antipsychotic properties, CBD also induces anti-inflammatory and neuroprotective effects. Thus, we also evaluated changes in NeuN (a neuronal marker), Iba-1 (a microglia marker) and GFAP (an astrocyte marker) expression in the medial prefrontal cortex (mPFC), dorsal striatum, nucleus accumbens core and shell, and dorsal hippocampus by immunohistochemistry. CBD effects were compared to those induced by the atypical antipsychotic clozapine. MK-801 administration at the dose of 1 mg/kg for 28 days impaired PPI responses. Chronic treatment with CBD (30 and 60 mg/kg) attenuated MK801-induced PPI impairment. CBD treatment also attenuated the impairment in social interaction and NOR tests induced by MK-801 treatment. Besides behavioral disruption, MK-801 treatment increased FosB/FosB expression and decreased parvalbumin expression in the mPFC. A decreased mRNA level of GRN1 in the hippocampus was also observed. Repeated MK-801 treatment also increased the number of GFAP-positive astrocytes in the mPFC and increased the percentage of Iba-1-positive microglia cells with a reactive phenotype in the mPFC and dorsal hippocampus without changing the number of Iba-1-positive cells. In addition, no change in the number of NeuN-positive cells was observed. All the molecular changes were attenuated by CBD. CBD by itself did not induce any effect. Moreover, CBD effects were similar to those induced by repeated clozapine treatment. These results indicate that repeated treatment with CBD, similar to clozapine, reverses the psychotomimetic-like effects and attenuates molecular changes observed after chronic administration of an NMDA receptor antagonist. These data reinforce the proposal that CBD may induce antipsychotic-like effects. Although the possible mechanism of action of these effects is still unknown, it may involve CBD anti-inflammatory and neuroprotective properties. Furthermore, our data support the view that inhibition of microglial activation may improve schizophrenia symptoms

O ácido metilmalônico (MMA) é um agente convulsivante endógeno que se acumula na acidemia metilmalônica, um erro inato no metabolismo caracterizado por disfunções neurológicas severas, predispondo ao aparecimento de convulsão. O mecanismo responsável pelas convulsões induzidas pelo MMA envolve a ativação do receptor NMDA. O envolvimento GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA ainda não foi demonstrado. Desta forma, no presente estudo objetivou investigar o envolvimento de macanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA. Ratos adultos foram injetados (i.c.v.) com muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK- 801 (6 nmol/1 ml), piridoxine (2 mmol/ 4 ml) ou salina (0.15 mmol/1 ml). Após trinta minutos, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) ou NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) eram injetados. Após estas injeções, os animais eram transferidos imediatamente para um campo aberto, sendo observado o aparecimento de convulsões. Após a avaliação comportamental, foi dosada a atividade glutamato descarboxilase (GAD) em homogeneizado de córtex cerebral, mensurando a quantidade de 14CO2 liberado do L-[14C]-glutamato. As convulsões foram confirmadas pelo estudo eletrencefalográfico. O MMA induziu convulsões do tipo crônicas de forma dose-dependente e reduziu a atividade da GAD no córtex cerebral ex vivo. A atividade da GAD correlacionou-se negativamente com a duração das convulsões (r=- 0.873, P<0.01), mas somente o MK-801 e a piridoxina reverteram à inibição da GAD pelo MMA. Estes resultados sugerem o envolvimento de mecanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA, e que a inibição da GAD depende da ativação de receptores NMDA ou da proteção da enzima pela piridoxina. Por fim, o presente estudo propôs, de forma inovadora, o envolvimento do sistema GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA e o envolvimento dos receptores NMDA na falha da transmissão GABAérgica. / Methylmalonic acid (MMA) is an endogenous convulsing compound that accumulates in methylmalonic acidemia, an inborn error of the metabolism characterized by severe neurological dysfunction, including seizures. The mechanisms by which MMA causes seizures involves the activation of the NMDA receptors, but whether GABAergic mechanisms are involved in the convulsions induced by MMA is not known. Therefore, in the current study we investigated the involvement of GABAergic mechanisms in the convulsions induced by MMA. Adult rats were injected (i.c.v.) with muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK-801 (6 nmol/1 ml), pyridoxine (2 mmol/ 4 ml) or physiological saline (0.15 mmol/1 ml). After thirty minutes, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) or NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) was injected. The animals were immediately transferred to an open field and observed for the appearance of convulsions. After behavioral evaluation, glutamate decarboxylase (GAD) activity was determined in cerebral cortex homogenates by measuring the 14CO2 released from L-[14C]-glutamic acid. Convulsions were confirmed by electroencephalographic recording in a subset of animals. MMA caused the appearance of clonic convulsions in a dose-dependent manner and decreased GAD activity in the cerebral cortex ex vivo. GAD activity negatively correlated with duration of MMA-induced convulsions (r=-0.873, P<0.01), in an individual basis. Muscimol, baclofen, MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced convulsions, but only MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced GAD inhibition. These data suggest GABAergic mechanisms are involved in the convulsive action of MMA, and that GAD inhibition by MMA depends on the activation of NMDA receptors or enzyme protection by pyridoxine. While in this study we present novel data about the role of the GABAergic system in MMAinduced convulsions, the central role of NMDA receptors in the neurochemical actions of MMA is further reinforced since they seem to trigger GABAergic failure.

O ácido metilmalônico (MMA) é um agente convulsivante endógeno que se acumula na acidemia metilmalônica, um erro inato no metabolismo caracterizado por disfunções neurológicas severas, predispondo ao aparecimento de convulsão. O mecanismo responsável pelas convulsões induzidas pelo MMA envolve a ativação do receptor NMDA. O envolvimento GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA ainda não foi demonstrado. Desta forma, no presente estudo objetivou investigar o envolvimento de macanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA. Ratos adultos foram injetados (i.c.v.) com muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK- 801 (6 nmol/1 ml), piridoxine (2 mmol/ 4 ml) ou salina (0.15 mmol/1 ml). Após trinta minutos, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) ou NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) eram injetados. Após estas injeções, os animais eram transferidos imediatamente para um campo aberto, sendo observado o aparecimento de convulsões. Após a avaliação comportamental, foi dosada a atividade glutamato descarboxilase (GAD) em homogeneizado de córtex cerebral, mensurando a quantidade de 14CO2 liberado do L-[14C]-glutamato. As convulsões foram confirmadas pelo estudo eletrencefalográfico. O MMA induziu convulsões do tipo crônicas de forma dose-dependente e reduziu a atividade da GAD no córtex cerebral ex vivo. A atividade da GAD correlacionou-se negativamente com a duração das convulsões (r=- 0.873, P<0.01), mas somente o MK-801 e a piridoxina reverteram à inibição da GAD pelo MMA. Estes resultados sugerem o envolvimento de mecanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA, e que a inibição da GAD depende da ativação de receptores NMDA ou da proteção da enzima pela piridoxina. Por fim, o presente estudo propôs, de forma inovadora, o envolvimento do sistema GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA e o envolvimento dos receptores NMDA na falha da transmissão GABAérgica. / Methylmalonic acid (MMA) is an endogenous convulsing compound that accumulates in methylmalonic acidemia, an inborn error of the metabolism characterized by severe neurological dysfunction, including seizures. The mechanisms by which MMA causes seizures involves the activation of the NMDA receptors, but whether GABAergic mechanisms are involved in the convulsions induced by MMA is not known. Therefore, in the current study we investigated the involvement of GABAergic mechanisms in the convulsions induced by MMA. Adult rats were injected (i.c.v.) with muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK-801 (6 nmol/1 ml), pyridoxine (2 mmol/ 4 ml) or physiological saline (0.15 mmol/1 ml). After thirty minutes, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) or NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) was injected. The animals were immediately transferred to an open field and observed for the appearance of convulsions. After behavioral evaluation, glutamate decarboxylase (GAD) activity was determined in cerebral cortex homogenates by measuring the 14CO2 released from L-[14C]-glutamic acid. Convulsions were confirmed by electroencephalographic recording in a subset of animals. MMA caused the appearance of clonic convulsions in a dose-dependent manner and decreased GAD activity in the cerebral cortex ex vivo. GAD activity negatively correlated with duration of MMA-induced convulsions (r=-0.873, P<0.01), in an individual basis. Muscimol, baclofen, MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced convulsions, but only MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced GAD inhibition. These data suggest GABAergic mechanisms are involved in the convulsive action of MMA, and that GAD inhibition by MMA depends on the activation of NMDA receptors or enzyme protection by pyridoxine. While in this study we present novel data about the role of the GABAergic system in MMAinduced convulsions, the central role of NMDA receptors in the neurochemical actions of MMA is further reinforced since they seem to trigger GABAergic failure.

O ácido metilmalônico (MMA) é um agente convulsivante endógeno que se acumula na acidemia metilmalônica, um erro inato no metabolismo caracterizado por disfunções neurológicas severas, predispondo ao aparecimento de convulsão. O mecanismo responsável pelas convulsões induzidas pelo MMA envolve a ativação do receptor NMDA. O envolvimento GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA ainda não foi demonstrado. Desta forma, no presente estudo objetivou investigar o envolvimento de macanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA. Ratos adultos foram injetados (i.c.v.) com muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK- 801 (6 nmol/1 ml), piridoxine (2 mmol/ 4 ml) ou salina (0.15 mmol/1 ml). Após trinta minutos, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) ou NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) eram injetados. Após estas injeções, os animais eram transferidos imediatamente para um campo aberto, sendo observado o aparecimento de convulsões. Após a avaliação comportamental, foi dosada a atividade glutamato descarboxilase (GAD) em homogeneizado de córtex cerebral, mensurando a quantidade de 14CO2 liberado do L-[14C]-glutamato. As convulsões foram confirmadas pelo estudo eletrencefalográfico. O MMA induziu convulsões do tipo crônicas de forma dose-dependente e reduziu a atividade da GAD no córtex cerebral ex vivo. A atividade da GAD correlacionou-se negativamente com a duração das convulsões (r=- 0.873, P<0.01), mas somente o MK-801 e a piridoxina reverteram à inibição da GAD pelo MMA. Estes resultados sugerem o envolvimento de mecanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA, e que a inibição da GAD depende da ativação de receptores NMDA ou da proteção da enzima pela piridoxina. Por fim, o presente estudo propôs, de forma inovadora, o envolvimento do sistema GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA e o envolvimento dos receptores NMDA na falha da transmissão GABAérgica. / Methylmalonic acid (MMA) is an endogenous convulsing compound that accumulates in methylmalonic acidemia, an inborn error of the metabolism characterized by severe neurological dysfunction, including seizures. The mechanisms by which MMA causes seizures involves the activation of the NMDA receptors, but whether GABAergic mechanisms are involved in the convulsions induced by MMA is not known. Therefore, in the current study we investigated the involvement of GABAergic mechanisms in the convulsions induced by MMA. Adult rats were injected (i.c.v.) with muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK-801 (6 nmol/1 ml), pyridoxine (2 mmol/ 4 ml) or physiological saline (0.15 mmol/1 ml). After thirty minutes, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) or NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) was injected. The animals were immediately transferred to an open field and observed for the appearance of convulsions. After behavioral evaluation, glutamate decarboxylase (GAD) activity was determined in cerebral cortex homogenates by measuring the 14CO2 released from L-[14C]-glutamic acid. Convulsions were confirmed by electroencephalographic recording in a subset of animals. MMA caused the appearance of clonic convulsions in a dose-dependent manner and decreased GAD activity in the cerebral cortex ex vivo. GAD activity negatively correlated with duration of MMA-induced convulsions (r=-0.873, P<0.01), in an individual basis. Muscimol, baclofen, MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced convulsions, but only MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced GAD inhibition. These data suggest GABAergic mechanisms are involved in the convulsive action of MMA, and that GAD inhibition by MMA depends on the activation of NMDA receptors or enzyme protection by pyridoxine. While in this study we present novel data about the role of the GABAergic system in MMAinduced convulsions, the central role of NMDA receptors in the neurochemical actions of MMA is further reinforced since they seem to trigger GABAergic failure.

Methadone and ketamine have been used in neuropathic pain management, but the benefits of the association of both drugs are uncertain. Aiming to enhance the analgesic efficacy and to reduce the occurrence of adverse-effects, an oral solutionof methadone plus ketamine was tested in patients suffering of neuropathic pain of different etiologies and resistant to other analgesics. All patients were treated in the Clinical Care & Pain Management of Santa Maria University Hospital (HUSM) between October 2006 and March 2008. Pain (primary aim) was analyzed before and several times after starting the treatment, through the visual analogical scale (VAS), allodynia and burning or shooting pain evaluation. The development of adverse-effects (secondary aim), such as somnolence, nausea, vomit, dizziness, hallucination, constipation and headache, was also investigated. The first part of this thesis presented the case report of 18 neuropathic pain patients treated with the oral solution of methadone plus ketamine during 6 months.Except for one patient that discontinued the treatment due to intolerable adverse effect, all patients reported pain relief and lowprevalence of adverse effects throughout the treatment. The second part of this thesis presents arandomized, double-blind study conducted with 37 neuropathic patients. Patients were randomly assigned in three treatment groups: methadone group (n=13), ketamine group (n=11) and methadone plus ketaminegroup (n=13). All patients received the designated treatment by oral route, during 3 months. Methadone, ketamine or methadone plus ketamine treatmentgradually (better effect in 30 than in 7 days) and largely (inhibition of about 70% at the end of treatment) reduced the level of neuropathic pain (VAS) with nodifference between the treatment groups.The proportion of patients presenting burning or shooting pain was similarly reduced in all treatmentgroups, but the prevalence of allodynia was significantly reduced only in ketamine group. Excepted for the somnolence that was more prevalent in methadone and methadone plus ketamine groups, the prevalence of the adverse effects was very similar in all treatment groups. All together, the present data show that the combination of methadone plus ketamine was effective to reliefneuropathic pain resistant to other analgesics, though the combination of the two drugs did not show superior efficacy than those reached by methadone or ketamine alone. This study strengthens the use of methadone or ketamine as alternatives to treat neuropathic pain. The drug of choice, however, should be based on the patient background. / Metadona e cetamina têm sido usados no tratamento da dor neuropática, mas os benefícios da associação das duas drogas são desconhecidos. Com o objetivo de melhorar a eficácia analgésica e reduzir a ocorrência de efeitos adversos, uma solução oral de metadona mais cetamina foi testada em pacientes que sofrem de dor neuropática de diferentes etiologias e resistentes a outros tipos de tratamento. Todos os pacientes foram tratados no ambulatório da dor do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM) entre outubro de 2006 e março de 2008. A dor foi analisada antes e várias vezes depois de iniciar o tratamento, através da escala visual analógica (EVA), bem como alodinia, dor em queimação e/ou em choque. Efeitos adversos, como sonolência, náuseas, vômitos, tontura, alucinação, constipação e dor de cabeça, também foram investigados. A primeira parte desta tese apresenta um relato de caso de 18 pacientes com dor neuropática, submetidos ao tratamento com a solução oral de metadona mais cetamina durante seis meses. Exceto para um paciente que descontinuou o tratamento devido a efeitos adversos intoleráveis, todos os pacientes relataram alívio da dor e de baixa prevalência de efeitos adversos ao longo do tratamento. A segunda parte desta tese apresenta um estudo duplo-cego randomizado, realizado com 37 pacientes apresentando dor neuropática de diferentes etiologias. Os pacientes foram divididos aleatoriamente em três grupos de tratamento: grupo metadona (n = 13), grupo cetamina (n = 11) e grupo metadona mais cetamina (n = 13). Todos os pacientes receberam o tratamento designado por via oral, durante 3 meses. O tratamento com metadona, cetamina ou metadona mais cetamina, gradualmente (melhor efeito em 30 do que em 7 dias) e em grande parte (inibição de cerca de 70% no final do tratamento) reduziu o nível de dor neuropática sem apresentar diferença significativa entre os grupos. A dor em queimação ou em choque apresentada pelos pacientes foi igualmente reduzida em todos os grupos de tratamento, mas a prevalência de alodinia foi significativamente reduzida apenas no grupo cetamina. A sonolência foi mais prevalente nos grupos da metadona e metadona mais cetamina, a manifestação dos demais efeitos adversos foi muito semelhante em todos os grupos de tratamento.

The polyamines, putrescine, spermidine and spermine, are present in high concentrations in the central nervous system and, because of their policationic nature, they can interact with diverse cellular anionic targets (nucleic acids and proteins) and modulate the learning and memory by interacting with the polyamine binding site at N-methyl-D-aspartate receptor. In this study we investigated the effects of the systemic administration of spermidine and arcaine on the memory of the inhibitory avoidance task in rats. It was also determined whether the effects of the spermidine and arcaine involve state dependence. The animals were trained in an inhibitory avoidance apparatus (0.4 mA, 3s) and tested in the same apparatus 24 hours later. Immediate post-training administration of spermidine (50 mg/kg, i.p.) improved, while arcaine (10 and 30 mg/kg, i.p.) impaired step-down latencies in the inhibitory avoidance test. Administration of spermidine (50 mg/kg, i.p.) 15 minutes before testing did not alter the performance of rats which were injected with spermidine (50 mg/kg, i.p.) or vehicle immediately after training. However, administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) 15 minutes before testing reverted the impairment of memory caused by the administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) immediately after training. Administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) or MK-801 (0.03 mg/kg, i.p.) before testing partially reverted the impairment of memory caused by the administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) or MK-801 (0.03 mg/kg, i.p.) immediately after training, characterizing a crossed state dependence. The results suggest that memory improvement caused by the administration of spermidine immediately after training is not due to state dependence. In contrast, the impairment of memory induced by arcaine is due to state dependence. The crossed state dependence between arcaine and MK-801 supports that state dependence induced by arcaine is related to NMDA receptor hypofunction. / As poliaminas, putrescina, espermidina e espermina estão presentes em altas concentrações no sistema nervoso central e, por sua natureza policatiônica, podem interagir com sítios aniônicos de macromoléculas (ácidos nucléicos e proteínas) e modulam o aprendizado e a memória interagindo com o sítio de ligação das poliaminas no receptor N-metil-D-apartato. Neste estudo nós investigamos os efeitos da administração sistêmica de espermidina e arcaína sobre a memória da tarefa de esquiva inibitória em ratos. Também foi determinado se os efeitos da espermidina e arcaína envolvem dependência de estado. Os animais foram treinados em um aparelho de esquiva inibitória (0,4 mA, 3 seg) e testados no mesmo aparelho, 24 horas depois. A administração imediatamente após o treino de espermidina (50 mg/kg, i.p.) melhorou, enquanto que arcaína (10 e 30 mg/kg, i.p.) prejudicou a latência de descida da plataforma no teste da esquiva inibitória. A administração de espermidina (50 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes do teste não afetou a performance dos ratos que foram injetados com espermidina (50 mg/kg, i.p.) ou veículo imediatamente após o treino. Entretanto, a administração de arcaína (30 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes do teste reverteu o prejuízo da memória causado pela administração de arcaína (30 mg/kg, i.p.) imediatamente após o treino. A administração de arcaína (30 mg/kg, i.p.) ou MK-801 (0,03 mg/kg, i.p.) antes do teste reverteu parcialmente o prejuízo da memória causado pela administração de arcaína (30 mg/kg) ou MK-801 (0,03 mg/kg) imediatamente após o treino, caracterizando dependência de estado cruzada. Estes resultados sugerem que a melhora da memória causada pela administração de espermidina imediatamente após o treino não é devido à dependência de estado. Em contraste, o prejuízo da memória induzido pela arcaína é devido a uma dependência de estado. A dependência de estado cruzada entre arcaína e MK-801. sugere que a dependência de estado induzida pela arcaína envolve a hipofunção do receptor NMDA.

NMDA receptor is necessary for excitatory transmission in the central nervous system. Altered funtion of the NMDA receptors is associated with many neurodegenerative and neuropsychiatric diseases. All available crystal structures of the NMDAR meant great shift towards our understanding of details of the receptor and its function. Unfortunately, these up- to-date available structures present only certain functional states of receptors and also a few structural data are still missing. For complete comprehension of the process of activation and deactivation of NMDA receptors, we need to supplement the current information with more data. The aim of this thesis was to employ a combination of different approaches (computational modelling, cloning, biochemistry, protein expression and purification and mass spectrometry) to obtain new structural data, by which we would be able to fill in the gaps in current receptor models, especially at various functional states of the receptor. Key words: NMDA receptor, glutamate receptor, computational modelling, structure, cloning, protein expression

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors are ligand-gated ion channels activated by agonist glutamate and co-agonist glycine. They play a key role in mediating the fast excitatory synaptic neurotransmission in the mammalian central nervous system. To create a functional heterotetrameric receptor, the presence of two GluN1 subunits combined with GluN2 or GluN3 subunits is necessary. Previous studies confirmed the importance of M3 transmembrane helix and extracellularly localized cysteines in regulation of surface expression of functional NMDA receptors. The aim of my thesis is to elucidate an influence of clinically relevant mutations in M3 transmembrane helix and the role of all known cysteines that form disulphide bonds on surface delivery of NMDA receptor expressed in heterologous monkey kidney fibroblasts cell culture (COS-7). Using molecular biology methods, immunocytochemistry and microscopy I found that the clinically relevant mutations M641I and Y647S in GluN1 subunit and also the mutations of particular cysteines forming disulphide bonds caused substantial decrease of surface expression of NMDA receptors. Furthermore, I discovered that the effect of mutated GluN1 subunits on decrease of surface expression depends on the subunit composition. The contribution of my results lies in elucidating the...