Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-13Bitstream added on 2014-06-13T18:54:10Z : No. of bitstreams: 1 vollet_vc_me_jabo.pdf: 318235 bytes, checksum: 6655731840e36911039095829647715f (MD5) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Secretaria da Educação do Estado de São Paulo / Os objetivos deste trabalho foram: avaliar o crescimento inicial e quantificar os teores de glicina betaína (GB) do sistema radicular dos genótipos de guandu, IAC Fava Larga e Caqui, sob efeito do estresse salino associado à poliamina exógena (espermidina) visando, nestes genótipos, verificar a utilização da GB como marcador bioquímico-fisiológico à salinidade e o efeito atenuante da espermidina (Spd) quando associada ao estresse salino. Para tanto, foram utilizados diferentes níveis de NaCl (0; 20; 60 e 80 mM) e Spd (0,0 mM e 0,5 mM). Após 10 dias da semeadura, as plântulas foram aclimatadas por 20 dias em solução nutritiva, em sala de crescimento com condições semi-controladas. Para o crescimento das raízes foram avaliadas as variáveis diâmetro, densidade e massa seca. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados no esquema fatorial 2x2x4 (IAC Fava Larga e Caqui; 0,0 mM e 0,5 mM de Spd e 0; 20; 60 e 80 mM de NaCl), com cinco repetições. Foram determinados os teores de glicina betaína em raízes de plântulas 50 dias após a germinação. Os resultados evidenciaram que o diâmetro do sistema radicular do genótipo Caqui foi, significativamente, maior que o da Fava Larga no nível 0,0 mM de Spd, a adição de Spd causou aumento no diâmetro do IAC Fava Larga e redução da densidade e massa seca do sistema radicular de ambos genótipos, o estresse salino reduziu, acentuadamente, o diâmetro e a massa seca do sistema radicular de ambos genótipos, para o genótipo IAC Fava Larga, a GB pode ser considerada um marcador bioquímico-fisiológico sob estresse salino de 20 mM e 60 mM, a adição de Spd a 0,5 mM causou aumento nos teores de glicina betaína no sistema radicular do genótipo IAC Fava Larga e as raízes do genótipo IAC Fava Larga foram menos sensíveis ao estresse salino comparado as do Caqui. / The objective of this work is to evaluate the initial growth and the levels of glycine betaine in pigeonpea roots under salt stress associated with exogenous polyamine (Spd) application, to evaluate the use of glycine betaine as biochemical marker for salt stress tolerance and the effect of Spd when associated to salt stress, as well as obtain forage legumes that can be used as soil salinity indicators. The genotypes IAC Fava Larga and Caqui were used in this study. Soil salinity was studied with NaCl concentrations of 0; 20; 60 and 80 mM, while Spd was applied at rates of 0.0 mM and 0.5 mM. Ten days after seeding, seedlings were acclimated for 20 days in hydroponic solution in a grow room under partially controlled conditions. Also, growths of roots were determined (density, diameter and dry mass). The experiment was arranged in randomized block design, in a 2x2x4 factorial with five replications. The levels of glycine betaine were determined in seedlings 50 days after germination. The results show that diameter in roots of Caqui genotype is bigger than IAC Fava Larga; Adition of Spd results in a increase of diameter and reduction of density and dry mass in both genotypes roots; The saline stress reduced the diameter and dry mass in both genotypes roots; The addition of 0.5 mM spermidine increased the concentration of glycine betaine in roots of the IAC Fava Larga genotype; Glycine betaine can be considered a biochemical marker for moderate salt stress in IAC Fava Larga roots.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The endogenous poliaminas, putrescine, spermidina and spermine are aliphatics amines that are present in high concentrations in the central nervous system (SNC). The action of the poliamines involves the modulation of several ionic channels, including the subtype of glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA). The processes mediated by NMDA receptor include synaptic plasticity and formation of neural circuitry. It is believed that these plasticities happening in some cerebral areas specifies, as the hippocampus, are critical for the learning and memory processes. It is described that spermidine (SPD), as well as the protein kinase are directly involved with processes of formation of the memory. Therefore, we investigated the involvement of the Ca2+ dependent (PKC) and cAMP-dependent (PKA) protein kinase in the facilitatory effect induced by SPD on the memory of males Wistar rats. For that, the rats were bilaterally cannulae in the hippocampus, after the surgical recovery, the animals were trained in the inhibitory avoidance task and injected (0.5 μL) bilaterally in the hippocampus. A subset of the animals was euthanized 30 or 180 min after injections and activity of PKC, PKA and cAMP response element-binding protein (CREB), in the hippocampus, was determined for Western blot. The other animals had a testing session, 24 h pos-training in the inhibitory avoidance apparatus. The post-training administration of the 3-[1-(Dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-4-(indol-3-yl)maleimide hydrochloride [GF 109203X, 2.5 ρmol intrahippocampal (ih)], inhibitor of PKC, N-[2-bromocinnamylamino ethyl]-(5-isoquinoline sulfonamide) [H-89, 0.5 ρmol intrahippocampal (ih)], PKA inhibitor or arcaine (0.02 nmol ih), the antagonist of the NMDA receptor polyamine-binding site prevented memory improvement induced by SPD (0.2 nmol ih). The SPD (0.2 nmol), in the hippocampus, facilitated PKC 30 min, PKA and CREB phosphorylation 180 min after administration, and increased translocation of the catalytic subunit of PKA into the nucleus. GF 109203X, (2.5 ρmol) prevented the stimulatory effect of SPD on PKC, PKA and CREB phosphorylation. Furthermore, arcaine (0.02 nmol) and H-89 (0.5 ρmol) prevented the stimulatory effect of SPD on PKA and CREB phosphorylation 180 min after administration. None of the drugs studies altered the locomotor activity of the animals. These results suggest that the facilitatory effect of the memory induced by the ih administration SPD involves the cross talk between PKC and PKA/CREB, with PKC activation follow by PKA/CREB pathways activation in rats. / As poliaminas endógenas, putrescina, espermidina e espermina, são aminas alifáticas que estão presentes em altas concentrações no sistema nervoso central (SNC). As poliaminas modulam diversos canais iônicos, incluindo o subtipo de receptor glutamatérgico N-metil D-aspartato (NMDA). Os processos mediados pelo receptor NMDA incluem plasticidade sináptica e formação de circuitos neurais. Acredita-se que estas plasticidades ocorrendo em algumas regiões cerebrais específicas, como o hipocampo, são críticas para os processos de aprendizado e memória. Está descrito que a espermidina (SPD), assim como as proteínas quinase, esta diretamente envolvida com os processos de formação da memória. Assim, investigamos o envolvimento das proteínas quinases dependente de AMPc (PKA) e dependente de Ca2+ (PKC) sobre a melhora da memória induzida por SPD em ratos. Para isso, ratos Wistar machos foram canulados bilateralmente no hipocampo e após a recuperação cirúrgica treinados na tarefa de esquiva inibitória. Imediatamente após o treino os animais receberam através das cânulas (0,5 μl/sítio) a administração de N-[2-bromocinamilamino etil]-(5-isoquinolina sulfonamida) [H-89, 0,5 ρmol intrahipocampal (ih)], inibidor da PKA, 3-[1-(Dimetilaminopropil)indol-3-il]-4-(indol-3-il)maleimida hidrochloride [GF 109203X, 2,5 ρmol (ih)], inibidor da PKC, arcaína (0,02 nmol, ih), antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA ou SPD (0,2 nmol, ih). Um grupo de animais foi eutanasiado 30 ou 180 minutos após a administração das drogas e a atividade da PKC, PKA e o elemento ligante responsivo ao AMPc (CREB), no hipocampo, foi determinada por Western blot. Os outros animais foram submetidos à sessão de teste, 24 horas depois do treino na esquiva inibitória. A administração de H-89, GF 109203X ou arcaína preveniu a melhora da memória induzida por SPD. A SPD (0,2 nmol) aumentou a fosforilação da PKC 30 min, da PKA e do CREB 180 min após a injeção e aumentou a translocação da subunidade catalítica da PKA do citosol para o núcleo. GF 109203X, (2,5 ρmol) preveniu o efeito estimulatório da SPD sobre a fosforilação da PKC, PKA e CREB. Além disso, arcaína (0,02 nmol) e H- 89 (0,5 ρmol) preveniram o efeito estimulatório da SPD sobre a fosforilação da PKA e CREB 180 min depois da injeção. Nenhuma das drogas alterou a atividade motora dos animais. Estes resultados sugerem que o efeito facilitatório da memória induzido pela administração ih de SPD envolve um cruzamento entre PKC e PKA/CREB, com a ativação inicial da PKC, seguida da ativação da cascata PKA/CREB em ratos. Assim, poderemos determinar um possível mecanismo de ação da espermidina nos processos de formação da memória, e desta forma, fornecer subsídios para o desenvolvimento de fármacos.

There is evidence that while polyamines facilitate seizures by positively modulating N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAr), selective antagonists of the NR2B-subunit decrease seizures. However, it remains undetermined whether traxoprodil (CP-101,606), an ifenprodil analog that acts as a selective antagonist of the NR2B subunit of the NMDAr, decreases seizure activity. In the current study we investigated whether traxoprodil alters PTZ-induced seizures in adult male Wistar rats by behavioral and electroencephalographical methods. Spermidine (SPD) (2 nmol/site; i.c.v.) facilitated behavioral and electroencephalographical seizures induced by a normally subeffective dose of PTZ (35 mg/kg; i.p.), but did not alter seizure activity induced by convulsant dose of PTZ (70 mg/kg; i.p). Traxoprodil (20 nmol i.c.v.) increased the latency to generalized tonic clonic seizures induced by PTZ (70 mg/kg; i.p). The oral administration of traxoprodil (60 mg/kg) increased the latency to clonic and tonic-clonic seizures, and decreased total time spent in seizures. These data constitute pharmacological evidence supporting a role for NR2B subunit in PTZ-induced seizures. While more studies are necessary to determine whether traxoprodil is a useful anticonvulsant in clinical settings, NR2B subunits may represent new targets of drug development for convulsive disorders. / Há evidências de que as poliaminas facilitam convulsões por modular positivamente os receptores N-metil-D-aspartato (NMDAr), e que os antagonistas seletivos a subunidade NR2B do NMDAr têm atividade anticonvulsivante. Entretanto, permanece indeterminado se o traxoprodil (CP-101,606), um análogo do ifenprodil que age como antagonista seletivo na subunidade NR2B do NMDAr, tem efeito anticonvulsivante. Neste estudo investigamos se o traxoprodil altera as convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em ratos Wistar machos por meio de métodos comportamentais e eletroencéfalográficos (EEG). Espermidina (SPD) (2 nmol/sítio; i.c.v.) facilita as convulsões comportamentais e eletroencéfalográficas induzidas por doses subconvulsivantes de PTZ (35 mg/kg; i.p.), mas não altera a atividade convulsiva induzida por dose plenamente convulsivante de PTZ (70 mg/kg; i.p.). Traxoprodil (20 nmol i.c.v.) aumenta a latência para convulsão tônico-clônica generalizada induzida por PTZ (70 mg/kg; i.p.). A administração oral de traxoprodil (60 mg/kg) aumenta as latências para convulsão clônica e tônico-clônica generalizada e diminui a duração total das convulsões induzidas por PTZ (70 mg/kg; i.p.). Esses dados mostram que o traxoprodil diminui as convulsões induzidas por PTZ, um modelo animal com bom poder de predição de atividade convulsivante em humanos, e sugerem um papel para a subunidade NR2B nas convulsões induzidas por PTZ. Enquanto mais estudos são necessários para determinar se o traxoprodil tem, de fato, atividade anticonvulsivante na clínica, as subunidades NR2B podem representar um novo alvo para o desenvolvimento de drogas anticonvulsivantes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Polyamines, such as spermidine and spermine, have been reported to improve memory retention through the activation of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAr). However whether polyamine agonists and antagonists alter extinction remains unclear. In the current study, we investigated whether spermidine and polyamine antagonists that selectively block the NR2B subunit at the NMDAr alter the extinction of contextual conditioned fear in male Wistar rats. While the bilateral intrahippocampal administration of exogenous spermidine (2 nmol/site) facilitated the extinction of fear conditioning, the injection of the antagonists arcaine (0.2 nmol/site), ifenprodil (20 nmol/site) and traxoprodil (0.2 nmol/site), disrupted fear extinction. NMDAr antagonists, at doses that had no effect per se, reversed the facilitatory effect of spermidine on fear extinction. These results suggest that exogenous and endogenous polyamines facilitate the extinction of contextual conditioned fear through activation of NR2B subunit-containing NMDAr in the hippocampus. Since extinction-based exposure therapy is widely used as treatment for a number of anxiety-related disorders, including phobias and post-traumatic stress, the currently reported facilitation of extinction by polyaminergic agents suggest these compounds as putative candidates for drug development. / As poliaminas, como espermidina e espermina, são aminas alifáticas que estão presentes no sistema nervoso central e que se ligam na subunidade NR2B do receptor N-metil-D-aspartato (rNMDA). Tem-se demonstrado que a administração sistêmica, intrahipocampal e intraamígdala de poliaminas melhoram a aquisição e retenção da memória em ratos. Entretanto, seu efeito sobre a extinção do medo condicionado não foi investigado. No presente estudo, investigamos se a administração intrahipocampal de espermidina e de antagonistas seletivos para a subunidade NR2B do rNMDA alteram a extinção do medo condicionado contextual em ratos Wistar machos. A administração intrahipocampal de espermidina (2 nmol/sítio) facilitou a extinção do medo condicionado, enquanto que a injeção dos antagonistas do rNMDA, arcaína (0,2 nmol/sítio), ifenprodil (20 nmol/sítio) e traxoprodil (0,2 nmol/sítio), bloquearam a extinção do medo condicionado contextual. Já a administração dos antagonistas do rNMDA, em doses sem efeito per se, reverteu a facilitação da extinção induzida por espermidina. Estes resultados sugerem que as poliaminas facilitam a extinção do medo condicionado contextual através da ativação da subunidade NR2B do rNMDA hipocampal. Tendo em vista que a terapia baseada em exposição é um método amplamente utilizado como tratamento para diversos tipos de distúrbios relacionados com ansiedade, incluindo fobias e estresse pós-traumático, a facilitação da extinção causada pela administração de espermidina coloca este composto com um possível candidato para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento destas patologias.

The polyamines, putrescine, spermidine and spermine, are present in high concentrations in the central nervous system and, because of their policationic nature, they can interact with diverse cellular anionic targets (nucleic acids and proteins) and modulate the learning and memory by interacting with the polyamine binding site at N-methyl-D-aspartate receptor. In this study we investigated the effects of the systemic administration of spermidine and arcaine on the memory of the inhibitory avoidance task in rats. It was also determined whether the effects of the spermidine and arcaine involve state dependence. The animals were trained in an inhibitory avoidance apparatus (0.4 mA, 3s) and tested in the same apparatus 24 hours later. Immediate post-training administration of spermidine (50 mg/kg, i.p.) improved, while arcaine (10 and 30 mg/kg, i.p.) impaired step-down latencies in the inhibitory avoidance test. Administration of spermidine (50 mg/kg, i.p.) 15 minutes before testing did not alter the performance of rats which were injected with spermidine (50 mg/kg, i.p.) or vehicle immediately after training. However, administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) 15 minutes before testing reverted the impairment of memory caused by the administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) immediately after training. Administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) or MK-801 (0.03 mg/kg, i.p.) before testing partially reverted the impairment of memory caused by the administration of arcaine (30 mg/kg, i.p.) or MK-801 (0.03 mg/kg, i.p.) immediately after training, characterizing a crossed state dependence. The results suggest that memory improvement caused by the administration of spermidine immediately after training is not due to state dependence. In contrast, the impairment of memory induced by arcaine is due to state dependence. The crossed state dependence between arcaine and MK-801 supports that state dependence induced by arcaine is related to NMDA receptor hypofunction. / As poliaminas, putrescina, espermidina e espermina estão presentes em altas concentrações no sistema nervoso central e, por sua natureza policatiônica, podem interagir com sítios aniônicos de macromoléculas (ácidos nucléicos e proteínas) e modulam o aprendizado e a memória interagindo com o sítio de ligação das poliaminas no receptor N-metil-D-apartato. Neste estudo nós investigamos os efeitos da administração sistêmica de espermidina e arcaína sobre a memória da tarefa de esquiva inibitória em ratos. Também foi determinado se os efeitos da espermidina e arcaína envolvem dependência de estado. Os animais foram treinados em um aparelho de esquiva inibitória (0,4 mA, 3 seg) e testados no mesmo aparelho, 24 horas depois. A administração imediatamente após o treino de espermidina (50 mg/kg, i.p.) melhorou, enquanto que arcaína (10 e 30 mg/kg, i.p.) prejudicou a latência de descida da plataforma no teste da esquiva inibitória. A administração de espermidina (50 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes do teste não afetou a performance dos ratos que foram injetados com espermidina (50 mg/kg, i.p.) ou veículo imediatamente após o treino. Entretanto, a administração de arcaína (30 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes do teste reverteu o prejuízo da memória causado pela administração de arcaína (30 mg/kg, i.p.) imediatamente após o treino. A administração de arcaína (30 mg/kg, i.p.) ou MK-801 (0,03 mg/kg, i.p.) antes do teste reverteu parcialmente o prejuízo da memória causado pela administração de arcaína (30 mg/kg) ou MK-801 (0,03 mg/kg) imediatamente após o treino, caracterizando dependência de estado cruzada. Estes resultados sugerem que a melhora da memória causada pela administração de espermidina imediatamente após o treino não é devido à dependência de estado. Em contraste, o prejuízo da memória induzido pela arcaína é devido a uma dependência de estado. A dependência de estado cruzada entre arcaína e MK-801. sugere que a dependência de estado induzida pela arcaína envolve a hipofunção do receptor NMDA.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Spermidine (SPD) is an endogenous polyamine with polycationic structure present in the central nervous system of mammals. SPD regulates biological processes, such as Ca2+ influx by glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA receptor), which has been associated with nitric oxide synthase (NOS) and cGMP/PKG pathway activation and a decrease of Na+,K+-ATPase activity in rats cerebral córtex synaptossomes. Decreased Na+,K+-ATPase activity, as well as decreased enzyme expression, directly impairs neurotransmitter signaling with deleterious consequences on learning and memory. The enzyme Na+,K+-ATPase establishes Na+ and K+ gradients across membranes of excitable cells and by this means maintains membrane potential and controls intracellular pH and volume. However, it has not been defined whether SPD modulates Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus. In this study we investigated whether SPD alters Na+,K+-ATPase activity in slices of hippocampus from rats, and possible underlying mechanisms. Hippocampal slices and homogenates were incubated with SPD (0.05-10 μM) for 30 minutes. SPD (0.5 and 1 μM) decreased Na+,K+-ATPase activity in slices, but not in homogenates. MK-801 (100 μM), a non-competitive antagonist of NMDA receptor, arcaine (0.5 μM), an antagonist of the polyamine binding site at the NMDA receptor, and L-NAME (100 μM), a nitric oxide synthase inhibitor, prevented the inhibitory effect of SPD (0.5 μM). ODQ (10 μM), a guanylate cyclase inhibitor, and KT5823 (2 μM), a protein kinase G inhibitor, also prevented the inhibitory effect of SPD on Na+,K+-ATPase activity. SPD (0.5 and 1.0 μM) increased NO2 plus NO3 (NOx) levels in slices, MK-801 (100 μM) and arcaine (0.5 μM) prevented the effect of SPD (0.5 μM) on the NOx content. These results suggest that SPD-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity involves NMDA/NOS/cGMP/PKG pathway. / A espermidina (SPD) é uma poliamina endógena com estrutura policatiônica presente no sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. A SPD regula muitos processos biológicos, como o influxo de cálcio através dos receptores glutamatérgicos N-metil-D-aspartato (NMDA), o qual tem sido associado com a ativação da enzima óxido nítrico sintase (NOS) e da via de sinalização da guanosina mono fosfato cíclica/proteína quinase dependente de GMPc (GMPc/PKG). Sabe-se que uma diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase, bem como a sua expressão, prejudica diretamente a sinalização de neurotransmissores, comprometendo tanto aprendizado e a memória. A enzima Na+,K+-ATPase estabelece os gradientes de Na+ e K+ através da membrana de células excitáveis e desta forma mantém o potencial de membrana e contribui para o controle do volume e do pH celular. No entanto, não está bem definido se a SPD modula a atividade da Na+,K+-ATPase no hipocampo de ratos. Neste estudo foi investigado se SPD altera a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias de hipocampo de ratos, e o possível mecanismo envolvido neste processo. As fatias e o homogeneizado de hipocampo foram incubados com SPD (0,05-10 M) por 30 minutos. SPD (0,5 e 1 M) diminuíram a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias, mas não no homogeneizado de hipocampo. MK-801 (100 μM), um antagonista não competitivo do receptor NMDA, arcaína (0,5 M), um antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA, e L-NAME (100 μM), um inibidor da NOS, preveniram o efeito inibitório da SPD (0,5 M). ODQ (10 μM), um inibidor da enzima guanilato ciclase, e KT5823 (2 μM), um inibidor da proteína quinase dependente de GMPc, também preveniram o efeito inibitório da SPD sobre a atividade da Na+,K+-ATPase. SPD (0,5 e 1,0 μM) aumentaram os níveis de NO2 plus NO3 (NOx) nas fatias de hipocampo. MK-801 (100 μM) e arcaína (0,5 μM) preveniram o efeito da SPD (0,5 μM) sobre conteúdo de NOx. Estes resultados sugerem que a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase induzida pela SPD envolve a via de sinalização NMDA/NOS/GMPc/PKG.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The long-term memory involves three stages: acquisition, consolidation and extinction. However was recently described a new phase of consolidation, called the persistence of memory. At this stage, crucial events occur 12 hours after the acquisition, in which the synthesis of new proteins and brain derived neurotrophic factor, are essential. The polyamines putrescine, spermidine and spermine, they act as endogenous modulators of various ion channels, including the glutamatergic receptor subtype N-methyl-D-aspartate. Systemic and intra-cerebral spermidine, immediately after training, improves memory in various tasks in rats. However, no studies demonstrating the effect of spermidine on the persistent memory. Thus, we investigated the effect of systemic administration of spermidine, and arcaine, antagonist of polyamine site on the N-methyl-D-aspartate, the persistence of memory, through the task of contextual fear conditioning. For this study, were used adult male Wistar rats, which underwent a training session on the task of contextual fear conditioning, and 12 hours after training, received a systemic administration of spermidine (0.1-30 mg/kg ), arcaine (0.1-10 mg/ kg) or the combination of spermidine and arcaine. In the second or the seventh day after training the mice were tested. Systemic administration of spermidine improved, whereas systemic administration of impaired arcaine the persistence of memory, when the rats were tested in the second and seventh day after training. The arcaine (0.1 mg / kg) in a dose that has no effect per se prevented improved starry induced by spermidine (10 mg/kg), whereas spermidine (1 mg/kg) dose not effect per se has prevented the worsening of starry arcaine induced (10 mg/kg), when the rats were tested in the second and seventh day after training. These results suggest the involvement of spermidine in persistent memory in rats. / A memória de longa duração envolve três fases: aquisição, consolidação e evocação. No entanto, recentemente foi descrita uma nova fase de consolidação, denominada de persistência da memória. Nesta fase, ocorrem eventos cruciais 12 horas após a aquisição, na qual a síntese de novas proteínas e do fator neurotrófico derivado do encéfalo, são essenciais. As poliaminas putrescina, espermidina e espermina, atuam como moduladores endógenos de diversos canais iônicos, incluindo o subtipo de receptor glutamatérgico N-metil-D-aspartato. A administração sistêmica e intra-cerebral de espermidina, imediatamente após o treino, melhora a memória em diversas tarefas em ratos. Entretanto, não há estudos demonstrando o efeito da espermidina sobre a persistência da memória. Assim, nós investigamos o efeito da administração sistêmica de espermidina, e de arcaína, antagonista do sítio das poliaminas no receptor N-metil-D-aspartato, na persistência da memória, através da tarefa de medo condicionado contextual. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar machos adultos, os quais, foram submetidos a uma sessão de treino na tarefa de medo condicionado contextual, e 12 horas após o treinamento, receberam uma administração sistêmica de espermidina (0,1-30 mg/kg), arcaína (0,1-10 mg/kg) ou a associação de espermidina e arcaína. No segundo ou no sétimo dia após o treino os ratos foram submetidos ao teste. A administração sistêmica de espermidina melhorou, enquanto que a administração sistêmica de arcaína prejudicou a persistência da memória, quando os ratos foram testados no segundo e no sétimo dia após o treino. A arcaína (0,1 mg/kg) na dose que não possui efeito per se, preveniu a melhora da persistência da memória induzida pela espermidina (10 mg/kg), enquanto que a espermidina (1 mg/kg) na dose que não possui efeito per se, preveniu a piora da persistência da memória induzida pela arcaína (10 mg/kg), quando os ratos foram testados no segundo e no sétimo dia após o treino. Estes resultados sugerem o envolvimento da espermidina na persistência da memória em ratos.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The morphine addiction is a chronic disease that involves biological, cognitive and behavioral changes developed after repeated and compulsive drug use. Even after long periods of abstinence relapses occur to users, especially when faced with situations that resemble the use thereof. The protocol of conditioned place preference (CPP) has been one of the most widely used experimental models to measure the positive reinforcing effects (conditioned place preference) and negative (conditioned place aversion) of several drugs, including morphine. Studies show that antagonists of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) block morphine-induced CPP, suggesting that this receptor is involved in the effects of morphine. Since polyamines act at the NMDA receptor, spermidine (SPD) positive allosteric modulating shape and arcaine acting as an antagonist of the polyamine site on this receiver, the purpose of this study the effect of polyamines on the preference induced conditioned place was to evaluate morphine. Adult male Swiss mice were pre-conditioned once a day for 15 minutes for two consecutive device in the CPP, the next day days were subjected twice daily for conditioning sessions with different drugs and protocols for four consecutive days. Twenty-four hours after the last conditioning session the animals were subjected to the test. The CPP score was calculated for the time spent in the compartment paired with the drug on test day, minus the time spent in the same compartment on the second day of the preconditioning. The results of this study showed that morphine (2.5-10 mg/kg, ip) induced CPP, but not aversion induced conditioned place aversion, the SPD (3-30 mg/kg, ip) and arcaine (0.3-3 mg/kg, ip) did not preferably nor induced conditioned place aversion. However, arcaine (3 mg/kg) administered 15 min before morphine (5 mg/kg) attenuated the pre-training acquisition of morphine-induced PCL. The arcaine (3 mg/kg) administered immediately after conditioning with morphine (5 mg/kg) blocked morphine induced PCL. Also, arcaine (3 mg/kg) administered 30 min pretest blocked morphine induced expression CPP. Furthermore, the effect of arcaine on attenuate the effect of morphine was prevented by the administration of SPD before conditioning, but was not reversed by postconditioning pre-test administration and SPD. These data indicate that arcaine blocks the rewarding effect of morphine and arcaine suggests that it could be a therapeutic target in the development of drugs to treat addiction to morphine. / A adicção a morfina consiste em uma doença crônica que envolve alterações biológicas, cognitivas e comportamentais desenvolvida após o uso repetido e compulsivo da droga. Mesmo após longos períodos de abstinência ocorrem recaídas aos usuários, principalmente quando se deparam com situações que lembram o uso da mesma. O protocolo de preferência condicionada por lugar (PCL) tem sido um dos modelos experimentais mais utilizados para mensurar os efeitos reforçadores positivos (preferência condicionada por lugar) e os negativos (aversão condicionada por lugar) de diversas drogas, incluindo a morfina. Estudos mostram que antagonistas do receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA) bloqueiam a PCL induzida por morfina, sugerindo que este receptor está envolvido nos efeitos da morfina. Uma vez que as poliaminas atuam no receptor NMDA, a espermidina (SPD) modulando de forma alostérica positiva e a arcaína agindo como antagonista do sítio das poliaminas neste receptor, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das poliaminas sobre a preferência condicionada por lugar induzida por morfina. Camundongos Swiss machos foram pré-condicionados uma vez por dia, durante 15 minutos por dois dias consecutivos no aparelho de PCL, no dia seguinte, foram submetidos, duas vezes por dia às sessões de condicionamento, com diferentes drogas e protocolos durante quatro dias consecutivos. Vinte e quatro horas após a última sessão de condicionamento os animais foram submetidos ao teste. O escore de PCL foi calculado pelo tempo gasto no compartimento pareado com a droga no dia do teste, menos o tempo gasto no mesmo compartimento no segundo dia do pré-condicionamento. Os resultados deste estudo mostraram que a morfina (2,5-10 mg/kg, i.p.) induziu PCL, mas não aversão condicionada por lugar, a SPD (3-30 mg/kg, i.p.) e arcaína (0,3-3 mg/kg, i.p.) não induziram preferência e nem aversão condicionada por lugar. No entanto, a arcaína (3 mg/kg) administrada 15 minutos antes da morfina (5 mg/kg) no pré-treino atenuou a aquisição da PCL induzida por morfina. A arcaína (3 mg/kg) administrada imediatamente após o condicionamento com morfina (5 mg/kg) bloqueou PCL induzida por morfina. Ainda, arcaína (3 mg/kg) administrada 30 min pré-teste bloqueou a expressão PCL induzida por morfina. Além disso, o efeito da arcaína em atenuar o efeito da morfina foi prevenido pela administração de SPD antes do condicionamento, mas não foi revertido pela administração pós-condicionamento e pré-teste de SPD. Estes dados indicam que arcaína bloqueia o efeito de recompensa da morfina e sugere que a arcaína poderia ser um alvo terapêutico no desenvolvimento de drogas para tratar a adicção por morfina.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The memory may be studied according with memory's phases, which is acquisition, consolidation and recall. Memories once consolidated, are no more susceptible to interventions, but when reactivated, some of these memories again become labile and vulnerable, and to persist need to have a new stabilization process called reconsolidation. Previous studies described that endogenous polyamines, spermine and spermidine, which bind and modulate the activity of NMDA receptors are involved in memory acquisition and consolidation. However there are no studies showing the effect of these drugs on memory reconsolidation. Accordingly, the aim of this study was investigate the effect of polyamines on fear memory reconsolidation in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, SPD (1 30 mg/kg, i.p.), the antagonist of the polyamine binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.1 10 mg/kg, i.p.) or spermidine plus arcaine were injected, and the animals were tested in the same apparatus 24 h later. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While SPD (3 and 10 mg/kg) improved, arcaine (1 and 10 mg/kg) impaired memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation, or 6 h after reactivation session. Arcaine (0.1 mg/kg, i.p.) prevented SPD (3 mg/kg)-induced improvement of memory reconsolidation. Accordingly, SPD (1 mg/kg) prevented arcaine (10 mg/kg)-induced impairment of memory reconsolidation. The amnesic effect of arcaine was not reversed by arcaine administration prior to test, ruling out state dependence in this effect. These results suggest that systemic administration of polyamine binding site ligands modulate memory reconsolidation, however further studies are required to elucidate the mechanism by which polyamines modulate memory reconsolidation. / A memória pode ser estudada de acordo com as suas fases, que são a aquisição, a consolidação e a evocação. As memórias, uma vez consolidadas, não podem mais ser modificadas, porém quando reativadas, ou seja, quando recuperadas, muitas destas voltam a se tornar instáveis e vulneráveis e para que persistam precisam passar por um novo processo de estabilização, chamado reconsolidação. Têm sido descrito que as poliaminas endógenas, espermidina e espermina, que se ligam e modulam a atividade do receptor NMDA, estão envolvidas na aquisição e na consolidação da memória. Contudo, não há trabalhos mostrando o efeito destas substâncias na reconsolidação da memória. Desta forma, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito das poliaminas na reconsolidação da memória de medo em ratos. Para isso, ratos machos adultos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual, onde receberam três choque de 0,4 mA, com intervalo de 40 seg entre cada choque e, 24 horas após, os animais foram recolocados no aparelho do treino por um período de 3 min, na ausência de choque, para reativar a memória. Após a reativação foi administrado, pela via intraperitoneal, salina, espermidina (1-30 mg/kg), arcaína (0,1-10 mg/kg) ou espermidina mais arcaína e vinte e quatro horas após, os animais foram testados, onde foi avaliado a imobilidade destes durante 6 min. Foram realizados experimentos controles para avaliar a especificidade das drogas no processo de reconsolidação. Além disso, foi avaliado se o possível efeito da arcaína na reconsolidação poderia ser explicado por dependência de estado. Assim, enquanto a espermidina (3 e 10 mg/kg) melhorou, a arcaína (1 e 10 mg/kg) piorou a reconsolidação da memória. Estas drogas não tiveram efeito sobre a memória quando foram administradas na ausência da reativação ou 6 horas após. A arcaína (0,1 mg/kg) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida pela espermidina (3 mg/kg) e por sua vez, a espermidina (1 mg/kg) preveniu o prejuízo da reconsolidação da memória induzido pela arcaína (10 mg/kg). O efeito amnésico da arcaína não foi revertido pela administração da mesma dose de arcaína antes do teste, descartando a hipótese de dependência de estado para o efeito da arcaína na reconsolidação. Estes resultados sugerem que a administração sistêmica dos ligantes do sítio de ligação das poliaminas do receptor NMDA modulam a reconsolidação da memória, todavia são necessários mais estudos a fim de elucidar o mecanismo pelo qual as poliaminas modulam a reconsolidação da memória.

RESUMEN La hipusinación es una modificación post-traduccional dependiente de espermidina que activa al factor de traducción eIF5A, y que es esencial en todos los eucariotas. En los últimos años se ha sugerido un importante papel para eIF5A en los procesos de senescencia y respuesta a estrés ambiental en plantas, en el establecimiento de la polaridad celular en levadura y su implicación en enfermedades tales como diabetes, VIH-1 o cáncer en humanos. Con el objetivo de caracterizar a nivel molecular la actividad biológica de eIF5A en plantas, hemos establecido una metodología basada en técnicas bioquímicas e inmunológicas para determinar el patrón de hipusinación de eIF5A en A. thaliana. La puesta a punto de esta metodología nos ha permitido demostrar que el tratamiento con ácido abscísico inhibe la activación por hipusinación de la isoforma eIF5A1. Además, para tratar de estudiar la función de eIF5A durante el desarrollo de A. thaliana, hemos realizado estudios funcionales basados en la caracterización de plantas transgénicas capaces de desactivar genéticamente la ruta dependiente de eIF5A mediante ARN de interferencia, condicionado a la aplicación de dexametasona. La desactivación condicional de la enzima de hipusinación desoxihipusina sintasa, produjo alteraciones durante el desarrollo y en respuesta a condiciones adversas de crecimiento, tales como floración temprana, inhibición del crecimiento de la raíz, alteraciones en los pelos radiculares, ramificación exacerbada del tallo, presencia de elementos traqueales completamente lignificados en hipocotilos, niveles reducidos de óxido nítrico e hipersensibilidad al ácido abscísico, sal y glucosa. Recientemente se ha demostrado que eIF5A es necesario para la traducción de proteínas con más de 3 prolinas sucesivas en su secuencia. El análisis de ontología realizado reveló un enriquecimiento de proteínas con poli-prolinas entre las implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. La alteración de la actividad de eIF5A provocó defectos en la estructuración de los filamentos de actina en A. thaliana, S. cerevisiae y H. sapiens. El estudio de mutantes termosensibles de levadura demostró el requerimiento de eIF5A durante el proceso de reproducción sexual a través de la traducción de la formina Bni1. Los experimentos de regulación traduccional en células HeLa demostraron que el silenciamiento vía ARN de interferencia de eIF5A1 provocaba un defecto en la tasa de traducción de la formina FMNL1 y la proteína ezrina. Estos resultados confirman que la actividad esencial de eIF5A en el ribosoma parece conservada en organismos eucariotas, y afecta fundamentalmente a proteínas con poli-prolinas implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. / Belda Palazón, B. (2014). Hipusinación del factor de traducción eIF5A dependiente de poliaminas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48474