Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Resumo: eIF5A é um fator de elongação da tradução conservado em arqueias e eucariotos, que interage com a subunidade maior do ribossomo 80S. É a única proteína que possui o aminoácido hipusina, formado pós-traducionalmente, essencial para sua função. eIF5A auxilia na tradução de proteínas que contêm motifs ricos em prolina, pois sequência repetida deste aminoácido pode causar parada do ribossomo em tradução devido à rigidez estrutural que forma. Na ausência de eIF5A funcional ocorre parada do ciclo celular em G1, na transição de G1 para S, tanto em Saccharomyces cerevisiae quanto em mamíferos, sugerindo papel essencial desta na tradução de proteínas importantes para a progressão do ciclo celular. Neste trabalho foi proposta a identificação das proteínas relevantes para a fase G1 que se encontram diferencialmente presentes durante desativação de eIF5A em S. cerevisiae. Foram utilizados dados de larga escala de perfil proteômico diferencial entre linhagens selvagens e mutantes de eIF5A, previamente obtido por nosso grupo, como ponto de partida para identificação das proteínas relevantes. A confirmação de níveis diferenciais destas proteínas foi realizada utilizando metodologia de Western blot após indução da desativação de eIF5A, utilizando o mutante sensível a temperatura hyp2-3. A desativação foi feita através do cultivo da linhagem mutante em temperatura semi-permissiva, que induz perda da função de eIF5A, porém mantendo viabilidade celular. Foi observado que a proteína Cka2 está di... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: eIF5A is a translation elongation factor conserved in archaea and eukaryotes, that interacts with the major subunit of the 80S ribosome. It is the only protein to contain the amino acid hypusine, formed post-translationally, essential to its function. eIF5A helps the translation of proteins that contain proline enriched motifs, as repeated sequence of this amino acid can cause ribosome stall during translation due to the rigid structure that it forms. In the absence of functional eIF5A occurs cell cycle arrest in G1, on the transition of G1 to S, both in Saccharomyces cerevisiae and mammals, suggesting an essential role of it on the translation of important proteins to the progression of the cell cycle. In this work, it was proposed the identification of relevant proteins to the G1 phase that are present differentially during deactivation of eIF5A in S. cerevisiae. It was used data of high-throughput differential proteomic profile between wild type strains and eIF5A mutant strains, previously obtained by our group, as a starting point to the identification of the relevant proteins. The confirmation of the differential levels of these proteins was made using Western blot methodology after induction of eIF5A deactivation, using the temperature-sensitive mutant hyp2-3. The deactivation was performed through cultivation of the mutant strain in semipermissive temperature, that induces loss of function of eIF5A but maintain cell viability. It was observed that the protein Cka2 is d... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Resumo: eIF5A é um fator de tradução envolvido com vários processos celulares, como o controle da proliferação celular e inflamação. Esse fator sofre uma modificação pós- traducional totalmente conservada e específica para sua ativação. Essa modificação é chamada de hipusinação e consiste na modificação de uma lisina específica em duas etapas: primeiro, a porção aminobutil da poliamina espermidina é transferida para o grupamento amino da cadeia lateral da lisina, pela ação da enzima desoxi-hipusina sintase; e, em seguida, o radical transferido sofre uma hidroxilação na posição beta, pela ação da desoxi-hipusina hidroxilase. Assim como eIF5A, desoxi-hipusina sintase é altamente conservada em arquea e eucariotos e é essencial em Saccharomyces cerevisiae. A desoxi-hipusina sintase é inibida por N1-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7), um análogo estrutural da espermidina. No entanto, estudos mais recentes demonstraram que o composto GC7 apresenta efeitos celulares independentes de eIF5A, o que demonstra que este possui outros alvos. Além disso, não é conhecido como se dá o processo de transporte do GC7 para o meio intracelular ou se existem mecanismos de compartimentalização celular ou externalização do GC7. Por fim, também não são conhecidos mecanismos de metabolização celular do GC7. Desta forma, o presente projeto teve como objetivo a busca de novos alvos celulares para o composto GC7 utilizando rastreamento quimio-genético utilizando a c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

RESUMEN La hipusinación es una modificación post-traduccional dependiente de espermidina que activa al factor de traducción eIF5A, y que es esencial en todos los eucariotas. En los últimos años se ha sugerido un importante papel para eIF5A en los procesos de senescencia y respuesta a estrés ambiental en plantas, en el establecimiento de la polaridad celular en levadura y su implicación en enfermedades tales como diabetes, VIH-1 o cáncer en humanos. Con el objetivo de caracterizar a nivel molecular la actividad biológica de eIF5A en plantas, hemos establecido una metodología basada en técnicas bioquímicas e inmunológicas para determinar el patrón de hipusinación de eIF5A en A. thaliana. La puesta a punto de esta metodología nos ha permitido demostrar que el tratamiento con ácido abscísico inhibe la activación por hipusinación de la isoforma eIF5A1. Además, para tratar de estudiar la función de eIF5A durante el desarrollo de A. thaliana, hemos realizado estudios funcionales basados en la caracterización de plantas transgénicas capaces de desactivar genéticamente la ruta dependiente de eIF5A mediante ARN de interferencia, condicionado a la aplicación de dexametasona. La desactivación condicional de la enzima de hipusinación desoxihipusina sintasa, produjo alteraciones durante el desarrollo y en respuesta a condiciones adversas de crecimiento, tales como floración temprana, inhibición del crecimiento de la raíz, alteraciones en los pelos radiculares, ramificación exacerbada del tallo, presencia de elementos traqueales completamente lignificados en hipocotilos, niveles reducidos de óxido nítrico e hipersensibilidad al ácido abscísico, sal y glucosa. Recientemente se ha demostrado que eIF5A es necesario para la traducción de proteínas con más de 3 prolinas sucesivas en su secuencia. El análisis de ontología realizado reveló un enriquecimiento de proteínas con poli-prolinas entre las implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. La alteración de la actividad de eIF5A provocó defectos en la estructuración de los filamentos de actina en A. thaliana, S. cerevisiae y H. sapiens. El estudio de mutantes termosensibles de levadura demostró el requerimiento de eIF5A durante el proceso de reproducción sexual a través de la traducción de la formina Bni1. Los experimentos de regulación traduccional en células HeLa demostraron que el silenciamiento vía ARN de interferencia de eIF5A1 provocaba un defecto en la tasa de traducción de la formina FMNL1 y la proteína ezrina. Estos resultados confirman que la actividad esencial de eIF5A en el ribosoma parece conservada en organismos eucariotas, y afecta fundamentalmente a proteínas con poli-prolinas implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. / Belda Palazón, B. (2014). Hipusinación del factor de traducción eIF5A dependiente de poliaminas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48474 / TESIS