A instabilidade cromossômica e a aneuploidia são características associadas às células malignas. Sabe-se que essas alterações podem ser resultantes de erros em eventos durante a mitose. Com o objetivo de gerar uma população com ganho de ploidia, utilizamos dois inibidores de fases distintas da mitose. Resultando no aumento da frequência celular em G2/M, ou seja, células com 4 vezes o número de cromossomos (4C) e de células com DNA acima de 4, hipertetraploide. Quantificamos a quantidade de núcleos e demonstramos que o tratamento, especificamente, levou a uma NCI, e não a multinucleação. Ambas linhagens celulares submetidas ao tratamento apresentaram alterações morfológicas, como protrusões de membrana, indicando alterações no citoesquelto. Nas análises de mRNA e da expressão proteica, observamos alterações na regulação da actina, coincidindo com a elevação dos mRNAs de YAP/TAZ, efetores co-transcricionais da via Hippo, regulada por alterações no citoesqueleto de actina. Desde modo, propomos, que o tratamento utilizado é um método eficiente para o estudo de células aneuploides e da NCI, que o citoesqueleto de actina é modulado por esse fenótipo e requer YAP/TAZ, provavelmente para manter a sobrevivência e favorecer a proliferação celular observada após o tratamento. / Chromosomal instability and aneuploidy are characteristics associated with malignant cells. It is known that these changes may be due to errors in events during mitosis. In order to generate a population with gain of ploidy, we used two inhibitors of distinct phases of mitosis. Resulting in increasing cell frequency in G2/M, cells with 4 times the number of chromosomes (4C) and cells with DNA above 4, hypertetraploid. We quantified the number of nuclei and demonstrated that the treatment specifically led to NCI, not multinucleation. Both cell lines submitted to treatment presented morphological alterations, such as membrane protrusions, indicating changes in the cytoskeleton. In the analysis of mRNA and protein expression, we observed alterations in actin regulation, coinciding with the elevation of YAP / TAZ mRNAs, co-transcriptional effectors of the Hippo signaling pathway, regulated by changes in the actin cytoskeleton. We propose, that the treatment used is an efficient method for the study of aneuploid cells as well NCI. Also, the actin cytoskeleton is modulated by that phenotype which requires high YAP / TAZ, probably to maintain cell survival and promote cell proliferation observed.

Introdução: As células do músculo liso vascular (CMLV) são quiescentes nos vasos adultos, com baixa capacidade de migração e de secreção de matriz extracelular, caracterizando fenótipo contrátil. Evidências apontam para a heterogeneidade fenotípica das CMLV ao longo da árvore arterial: há distribuição heterogênea de doenças e de resposta a determinadas drogas nos diferentes vasos, além de variabilidade de expressão dos genes de proteínas contráteis de músculo liso entre eles. O papel das CMLV, em fase adulta, é classicamente descrito como restrito à regulação do tônus de pequenos vasos, sendo insignificante a contribuição da mecânica das CMLV para a complacência das artérias elásticas. Existe a hipótese de que a viscoelasticidade das CMLV contribua para a mecânica final das artérias, sendo o enrijecimento dessas células associado à rigidez arterial. Objetivo: Estudar a variabilidade das propriedades mecânicas e de expressão proteica das CMLV, ao longo da árvore arterial, buscando identificar moduladores regionais para esse fenótipo. Avaliar se situações clínicas sabidamente associadas à rigidez arterial (envelhecimento, sexo feminino pós-menopausa, ancestralidade genética africana, diabetes mellitus e tabagismo) cursam com enrijecimento de CMLV. Métodos: 1) Estudou-se a composição e a organização da camada média de diferentes artérias. As CMLV desses vasos foram avaliadas quanto à viscoelasticidade de citoplasma (G), por meio do ensaio de Citometria Magnético Ótica de Oscilação e, quanto à expressão proteica global, usando cromatografia multidimensional e espectrometria de massas em tandem de alta resolução (Proteômica Shotgun). Os dados mecânicos obtidos foram correlacionados com as características da matriz extracelular (MEC) dos vasos de origem (porcentagem de elastina e quantidade de MEC). Em paralelo, foi realizado experimento de estiramento cíclico (10%/1Hz) das CMLV das diferentes artérias por 24 e 48h, seguido pela mensuração de rigidez de citoplasma. 2) Foram isoladas as CMLV de fragmentos de artéria mamária de 80 pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio, células essas que foram avaliadas quanto à viscoelasticidade de citoplasma (G, G\' e G\'\'). Elaborou-se modelo estatístico para avaliar se as variáveis clínicas idade, sexo feminino, ancestralidade africana, tabagismo e diabetes mellitus estavam associadas a alterações de mecânica celular. Resultados: 1) A viscoelasticidade das CMLV variou significativamente entre as artérias. As CMLV provenientes de artérias distais (artérias femoral e renal) mostraram-se significativamente mais rígidas que as CMLV de aorta torácica (p < 0,001). Identificou-se correlação negativa entre rigidez de CMLV e quantidade de MEC / elastina na camada média vascular. O regime de estiramento cíclico por 48h reduziu globalmente a rigidez das CMLV. As CMLV provenientes da aorta torácica expressaram maior quantidade de proteínas relacionadas com a estrutura e a organização do citoesqueleto em relação às CMLV da artéria femoral. 2) Constatou-se variabilidade interindividual de viscoelasticidade de CMLV e associação entre tabagismo e sexo feminino com enrijecimento de CMLV. Conclusões: As CMLV são heterogêneas quanto às propriedades mecânicas, à organização do citoesqueleto e à expressão proteica ao longo da árvore arterial, reforçando o conceito de plasticidade fenotípica das CMLV. A mecânica das CMLV é modulada pelas características da MEC e pela tensão circunferencial cíclica aplicada às paredes vasculares pelo fluxo sanguíneo. Mulheres pós-menopausa e tabagistas exibem enrijecimento de CMLV, sendo esse fato um provável contribuinte para a rigidez arterial associada a essas condições e um possível alvo terapêutico a ser avaliado futuramente / Rational: Vascular smooth muscle cells (VSMC) lose their ability to migrate and secrete extracellular matrix (ECM) with the end of vascular development, condition known as contractile phenotype and reversible in the presence of vascular injury. There is evidence of heterogeneity of VSMC phenotype along arterial tree, as the distribution of diseases (atherosclerosis) and the response to drugs vary between different vessels, as well as the expression of smooth muscle-contractile protein genes. The role played by VSMC mechanics on determining large arteries\' compliance was always considered irrelevant. It has been hypothesized that the VSMC mechanical properties are important for vascular mechanics, especially in the pathological scenario, where VSMC stiffening may be associated with arterial rigidity. Goals: Study the variation of VSMC mechanics and protein expression along arterial tree, identifying regional modulators of this phenotype. Evaluate if clinical situations associated with arterial rigidity (ageing, post-menopausal women, African ancestry, diabetes mellitus and smoking) concur with VSMC stiffening. Methods: 1) Different arteries were studied in terms of composition and organization of their media layer. VSMC isolated from these arteries were evaluated regarding cytoplasm viscoelasticity, measured using Optical Magnetic Twisting Cytometry Assay (OMTC), and protein expression, using two-dimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry (Shotgun Proteomics). Mechanical data were correlated with ECM characteristics (percentage of elastin and ECM amount) of the vessels of origin. In parallel, VSMC of different arteries were subjected to cyclic stretching (10%/1Hz) during 24 and 48h, followed by the measurement of their cytoplasm rigidity. 2) VSMC were isolated from fragments of mammary artery of 80 patients subjected to coronary bypass surgery and evaluated regarding their viscoelasticity (G, G\' e G\'\'). A statistic model was elaborated to address if the clinical variables age, female sex, African ancestry, smoking and diabetes mellitus were associated with changes of VSMC mechanics. Results: 1) VSMC viscoelasticity varied significantly amongst the studied arteries. VSMC from heart-distant arteries (femoral and renal arteries) were stiffer than VSMC from thoracic aorta (p < 0,001). There was a negative correlation between VSMC rigidity and the amount of ECM / percentage of elastin within the media layer. 48h-cyclic stretching was associated with a global reduction of VSMC rigidity. VSMC of thoracic aorta expressed significantly more proteins associated with cytoskeleton structure and organization than VSMC of femoral artery. 2) There was a significant inter-individual variation of VSMC viscoelasticity. Smoking and female sex were associated with VSMC stiffening. Conclusion: VSMC mechanics, cytoskeleton organization and protein expression are heterogeneous along arterial tree. VSMC mechanical properties are modulated by ECM characteristics and by regional mechanical forces. This reinforces the concept of phenotypic heterogeneity of VSMC. Post-menopausal women and smokers exhibit stiffer VSMC, representing an important factor for the understanding of the arterial rigidity associated with these conditions and also a possible future therapeutic target

Introdução: As células do músculo liso vascular (CMLV) são quiescentes nos vasos adultos, com baixa capacidade de migração e de secreção de matriz extracelular, caracterizando fenótipo contrátil. Evidências apontam para a heterogeneidade fenotípica das CMLV ao longo da árvore arterial: há distribuição heterogênea de doenças e de resposta a determinadas drogas nos diferentes vasos, além de variabilidade de expressão dos genes de proteínas contráteis de músculo liso entre eles. O papel das CMLV, em fase adulta, é classicamente descrito como restrito à regulação do tônus de pequenos vasos, sendo insignificante a contribuição da mecânica das CMLV para a complacência das artérias elásticas. Existe a hipótese de que a viscoelasticidade das CMLV contribua para a mecânica final das artérias, sendo o enrijecimento dessas células associado à rigidez arterial. Objetivo: Estudar a variabilidade das propriedades mecânicas e de expressão proteica das CMLV, ao longo da árvore arterial, buscando identificar moduladores regionais para esse fenótipo. Avaliar se situações clínicas sabidamente associadas à rigidez arterial (envelhecimento, sexo feminino pós-menopausa, ancestralidade genética africana, diabetes mellitus e tabagismo) cursam com enrijecimento de CMLV. Métodos: 1) Estudou-se a composição e a organização da camada média de diferentes artérias. As CMLV desses vasos foram avaliadas quanto à viscoelasticidade de citoplasma (G), por meio do ensaio de Citometria Magnético Ótica de Oscilação e, quanto à expressão proteica global, usando cromatografia multidimensional e espectrometria de massas em tandem de alta resolução (Proteômica Shotgun). Os dados mecânicos obtidos foram correlacionados com as características da matriz extracelular (MEC) dos vasos de origem (porcentagem de elastina e quantidade de MEC). Em paralelo, foi realizado experimento de estiramento cíclico (10%/1Hz) das CMLV das diferentes artérias por 24 e 48h, seguido pela mensuração de rigidez de citoplasma. 2) Foram isoladas as CMLV de fragmentos de artéria mamária de 80 pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio, células essas que foram avaliadas quanto à viscoelasticidade de citoplasma (G, G\' e G\'\'). Elaborou-se modelo estatístico para avaliar se as variáveis clínicas idade, sexo feminino, ancestralidade africana, tabagismo e diabetes mellitus estavam associadas a alterações de mecânica celular. Resultados: 1) A viscoelasticidade das CMLV variou significativamente entre as artérias. As CMLV provenientes de artérias distais (artérias femoral e renal) mostraram-se significativamente mais rígidas que as CMLV de aorta torácica (p < 0,001). Identificou-se correlação negativa entre rigidez de CMLV e quantidade de MEC / elastina na camada média vascular. O regime de estiramento cíclico por 48h reduziu globalmente a rigidez das CMLV. As CMLV provenientes da aorta torácica expressaram maior quantidade de proteínas relacionadas com a estrutura e a organização do citoesqueleto em relação às CMLV da artéria femoral. 2) Constatou-se variabilidade interindividual de viscoelasticidade de CMLV e associação entre tabagismo e sexo feminino com enrijecimento de CMLV. Conclusões: As CMLV são heterogêneas quanto às propriedades mecânicas, à organização do citoesqueleto e à expressão proteica ao longo da árvore arterial, reforçando o conceito de plasticidade fenotípica das CMLV. A mecânica das CMLV é modulada pelas características da MEC e pela tensão circunferencial cíclica aplicada às paredes vasculares pelo fluxo sanguíneo. Mulheres pós-menopausa e tabagistas exibem enrijecimento de CMLV, sendo esse fato um provável contribuinte para a rigidez arterial associada a essas condições e um possível alvo terapêutico a ser avaliado futuramente / Rational: Vascular smooth muscle cells (VSMC) lose their ability to migrate and secrete extracellular matrix (ECM) with the end of vascular development, condition known as contractile phenotype and reversible in the presence of vascular injury. There is evidence of heterogeneity of VSMC phenotype along arterial tree, as the distribution of diseases (atherosclerosis) and the response to drugs vary between different vessels, as well as the expression of smooth muscle-contractile protein genes. The role played by VSMC mechanics on determining large arteries\' compliance was always considered irrelevant. It has been hypothesized that the VSMC mechanical properties are important for vascular mechanics, especially in the pathological scenario, where VSMC stiffening may be associated with arterial rigidity. Goals: Study the variation of VSMC mechanics and protein expression along arterial tree, identifying regional modulators of this phenotype. Evaluate if clinical situations associated with arterial rigidity (ageing, post-menopausal women, African ancestry, diabetes mellitus and smoking) concur with VSMC stiffening. Methods: 1) Different arteries were studied in terms of composition and organization of their media layer. VSMC isolated from these arteries were evaluated regarding cytoplasm viscoelasticity, measured using Optical Magnetic Twisting Cytometry Assay (OMTC), and protein expression, using two-dimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry (Shotgun Proteomics). Mechanical data were correlated with ECM characteristics (percentage of elastin and ECM amount) of the vessels of origin. In parallel, VSMC of different arteries were subjected to cyclic stretching (10%/1Hz) during 24 and 48h, followed by the measurement of their cytoplasm rigidity. 2) VSMC were isolated from fragments of mammary artery of 80 patients subjected to coronary bypass surgery and evaluated regarding their viscoelasticity (G, G\' e G\'\'). A statistic model was elaborated to address if the clinical variables age, female sex, African ancestry, smoking and diabetes mellitus were associated with changes of VSMC mechanics. Results: 1) VSMC viscoelasticity varied significantly amongst the studied arteries. VSMC from heart-distant arteries (femoral and renal arteries) were stiffer than VSMC from thoracic aorta (p < 0,001). There was a negative correlation between VSMC rigidity and the amount of ECM / percentage of elastin within the media layer. 48h-cyclic stretching was associated with a global reduction of VSMC rigidity. VSMC of thoracic aorta expressed significantly more proteins associated with cytoskeleton structure and organization than VSMC of femoral artery. 2) There was a significant inter-individual variation of VSMC viscoelasticity. Smoking and female sex were associated with VSMC stiffening. Conclusion: VSMC mechanics, cytoskeleton organization and protein expression are heterogeneous along arterial tree. VSMC mechanical properties are modulated by ECM characteristics and by regional mechanical forces. This reinforces the concept of phenotypic heterogeneity of VSMC. Post-menopausal women and smokers exhibit stiffer VSMC, representing an important factor for the understanding of the arterial rigidity associated with these conditions and also a possible future therapeutic target

O endotélio reveste a parede vascular e possui função essencial na manutenção da homeostase. A célula endotelial é capaz de perceber estímulos extracelulares, como fatores químicos e mecânicos, transmitir a informação para dentro da célula e regular sua função e fenótipo. Neste sentido, investigamos os mecanismos moleculares associados as células endoteliais em dois contextos importantes de intervenções vasculares 1) nos stents farmacológicos, onde a rapamicina exerce funções antiproliferativas e pró-trombogênicas, e 2) na revascularização cardíaca por ponte de safena, onde o alto estiramento mecânico exerce grande impacto no remodelamento vascular e no fenótipo da célula endotelial. A rapamicina pertence à classe de drogas limus, bastante utilizadas nos stents farmacológicos usados no procedimento de desobstrução vascular. Além de sua função antiproliferativa, exploramos os efeitos deletérios associados a pró-trombogênese. Os dados demonstraram que a rapamicina ativa o receptor de TGF independentemente de seu ligante TGFbeta, promovendo aumento na expressão da PAI-1 (pró-trombogênica), alteração no fenótipo endotelial (Transição endotélio-mesenquimal - EndMT) e na formação de fibras de estresse. Os efeitos observados são dependentes da ativação de Smad2 e independentes da via clássica antiproliferativa por mTOR. Experimentos in vivo mostraram que o tratamento com inibidor do receptor de TGF diminui os efeitos pró-trombogênicos e a expressão de PAI-1 induzidos pela rapamicina em artérias carótidas de camundongos. A ponte de safena é um procedimento bastante utilizado na cirurgia de revascularização cardíaca e a arterialização do segmento venoso submetido ao estresse hemodinâmico arterial resulta em remodelamento vascular, que influencia o sucesso do procedimento. Nossos dados demonstram que a célula endotelial humana de veia safena humana (hSVEC), susceptível as modificações do tipo EndMT induzido quimicamente (estímulo pró-fibrótico e pró-inflamatório), não expressou o mesmo comportamento em resposta ao aumento de estiramento mecânico que ocorre durante a arterialização venosa. Entretanto, detectamos uma pronunciada redução dos filamentos de actina, modulação no padrão de ativação da cofilina e na proporção de actina glomerular (G-actina) entre citoplasma e núcleo, com redução da biodisponibilidade de NO. De modo interessante, demonstramos que a redução no filamento de actina é específica para a célula endotelial venosa, não sendo observado em células endoteliais de origem arterial de aorta e coronária. Em conjunto, os dados mostram que 1) efeitos pró-trombogênicos associados a rapamicina são mediados por ativação do receptor de TGF independente do seu ligante e da atividade antiproliferativa da droga e 2) a adaptação da célula endotelial venosa ao estiramento mecânico envolve modulação da síntese/degradação de filamentos de actina e redução na biodisponibilidade de NO. Estes novos elementos sobre o mecanismo de transdução de estímulos químicos e físicos pelo endotélio poderão ser explorados terapeuticamente para modular a plasticidade endotelial em disfunções cardiovasculares / Endothelium is the inner layer in vascular wall and displays an essential role in the maintenance of cardiovascular homeostasis. Endothelial cell senses the extracellular stimuli, such as chemical and mechanical factors, transduce and process these signals to regulate cell function and phenotype. Here, we investigated molecular underpinning of the endothelial cells under two important scenarios: 1) in drug-eluting stents, where rapamycin exerts antiproliferative and undesirable prothrombogenic functions, and 2) in vein graft bypass surgery, where increased stretch modulates vascular remodeling and endothelial cell phenotype. Rapamycin belongs to the class of limus drugs and is widely used in drug eluting stents (DES) to vascular restenosis. In addition to its antiproliferative function, we explore the deleterious effects associated with prothrombogenesis. Our data demonstrated that rapamycin activates TGF receptor independent of its ligand TGFbeta, in concert with promotion of PAI-1 expression (prothrombogenic), changes in endothelial phenotype (Endothelial to Mesenchymal Transition - EndMT) and stress fibers induction. These effects are Smad2 dependent and independent of the classical antiproliferative mTOR pathway of rapamycin. Our in vivo experiments showed that TGF receptor inhibitor treatment decreases prothrombogenic effects and PAI-1 expression induced by rapamycin in mice carotid arteries. Saphenous vein is widely used in coronary artery bypass surgery (CABG) and the vein arterialization remodeling in response to the increased stress influences graft patency. Our data demonstrated that human saphenous vein endothelial cell (hSVEC) is susceptible to chemically induced endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) by pro-fibrotic and pro-inflammatory stimuli. On the other hand, physical stimulus associated with high stretch failed to induce EndMT. However, we detected a pronounced decrease of actin filaments, modulation of the cofilin activation, changes in the proportion of glomerular actin (G-actin) between cytoplasm and nucleus, and reduction of NO bioavailability. Interestingly, the reduction of actin fibers by high stretch is specific to venous endothelial cell since arterial endothelial cells from aorta, and coronary artery failed to display the response. Altogether, our data show that 1) the thrombogenic effects of rapamycin are mediated by TGF receptor activation independent of its ligand and independent of the antiproliferative pathway of the drug, and 2) the adaptation of venous endothelial cell to mechanical stretch involves synthesis/degradation of actin filaments and reduced NO bioavailability. These new elements on signal transduction of endothelial cells in response to chemical and physical stimuli may be therapeutically explored to modulate endothelial plasticity in cardiovascular disorders

INTRODUÇÃO: A prolactina é um hormônio polipeptídico que possui reconhecida ação sistêmica, principalmente no sistema reprodutor. O papel desse hormônio no desenvolvimento e na extensão do câncer da mama ainda é muito debatido. A progressão do câncer de mama em grande parte depende do movimento celular e da capacidade da célula em remodelar seu citoesqueleto de actina. Nesse processo, proteínas envolvidas na migração celular, como moesina, FAK e c-Src, são influenciadas por vários hormônios, incluindo a prolactina. O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos da PRL na migração de células T47D, MCF-7 e ZR75-1 de câncer de mama, bem como os mecanismos envolvidos. MÉTODOS: As células foram cultivadas em placas de cultura com meio suplementado e divididas em oito grupos diferentes de tratamento: Grupo I (veículo); Grupo II (PRL na concentração de 25 ng/mL); Grupo III (PRL na concentração de 50 ng/mL), Grupo IV (PRL na concentração de 100 ng / mL), Grupo V (RNAi + veículo); Grupo VI (RNAi + PRL na concentração de 25 ng/mL); Grupo VII (RNAi + PRL na concentração de 50 ng/mL) e Grupo VIII (RNAi + PRL na concentração de 100 ng / mL). Nos Grupos de I a IV, a reorganização da actina do citoesqueleto foi analisada por imunofluorescência após 30 minutos do tratamento. Em todos os grupos estudados foram realizadas análise da migração horizontal com auxílio de microscopia de luz e avaliadas as expressões de Moesina, p-Moesina, FAK, p-FAK, c-Src e p-c-Src por Western Blot após 48 horas do tratamento. RESULTADOS: As células de câncer de mama expostas à prolactina apresentaram um aumento da expressão de Moesina, p-Moesina, FAK, p-FAK, c-Src e p-c-Src. Essas alterações moleculares estão associadas à reorganização da actina do citoesqueleto e ao aumento da mobilidade das células. CONCLUSÕES: Nossos dados sugerem que a prolactina aumenta a migração das células T47D, MFC-7 e ZR75-1 de câncer de mama e remodela a actina do citoesqueleto pela via de sinalização intracelular das proteínas c-Src, FAK e moesina / INTRODUCTION: Prolactin is a polypeptide hormone with a recognized systemic action mainly on reproductive physiology. The role of this hormone on breast cancer development and progression has been debated a lot yet. Breast cancer invasion largely depends on cell movement and on the ability to remodel the actin cytoskeleton. In this process, proteins involved in cell migration, such as moesin, FAK and c-Src, are influenced by a large number of hormones, such as prolactin. The present study was aimed for evaluating the effects of PRL on migration of T47D, MCF-7 and ZR75-1 breast cancer cells as well as the molecular mechanisms in this process. METHODS: The cells were cultured in dishes with supplemented medium and were divided in eight different assays: Group I (control); Group II (25ng/ml of prolactin); Group III (50ng/ml of prolactin); Group IV (100ng/ml of prolactin); Group V (RNAi + control); Group VI (RNAi + 25ng/ml of prolactin); Group VII (RNAi + 50ng/ml of prolactin); Group VIII (RNAi + 100ng/ml of prolactin). In Groups I to IV, the actin cytoskeletal reorganization was analyzed by immunofluorescence 30 minutes after the treatment. In all groups, were performed the horizontal migration analysis with light microscopy and evaluated the expression of moesin, p-moesin, FAK, p-FAK, c-Src and p-c-Src by Western blot after 48 hours of treatment. RESULTS: Breast cancer cells exposed to prolactin display an elevated moesin, p-moesin, FAK, p-FAK, c-Src and p-c-Src expression. These molecular changes are associated with the reorganization of actin cytoskeleton and increased mobility of cells. CONCLUSION: Our data suggest that prolactin enhances the migration of T47D, MFC-7 and ZR75-1 breast cancer cells through the actin cytoskeleton remodeling by intracellular signaling pathway of c-Src, FAK and moesin proteins

Células de músculo liso vascular são capazes de perceber estímulos mecânicos do sistema cardiovascular, coordenando pressão sanguínea e perfusão tecidual por meio da modulação do tônus e do diâmetro vascular via resposta contrátil. O gatilho inicial à contração é um aumento na concentração intracelular de cálcio e diversas vias de sinalização têm sido descritas na sustentação deste sinal inicial. Evidências atuais indicam que adesões focais desempenham papel crucial na contração através da organização do citoesqueleto de actina e engajamento com o aparato contrátil. Nosso grupo demonstrou que a proteína rica em cisteína e glicina 3 (CRP3) interage com a quinase de adesão focal (FAK) em resposta a um aumento do estiramento mecânico e existem evidências de que CRP3 modula a dinâmica do citoesqueleto de actina. Neste trabalho testamos a hipótese de que a proteína CRP3 atua como uma proteína de adesão focal que regula a contração de células musculares lisas aórticas. Por meio de ensaios de imunoprecipitação e colocalização, verificou-se a presença de CRP3 nas adesões focais de células selvagens. Evidenciou-se que a ausência de CRP3 está associada a aumento no tamanho médio de adesões focais em células musculares lisas aórticas de forma independente do substrato. Entretanto, em resposta à angiotensina II, células nocaute para CRP3 apresentam incapacidade de maturação das adesões focais, um evento que está associado ao reduzido conteúdo proteico de FAK, paxilina e MLC2 (plataformas moleculares envolvidas na maturação de adesões focais) observada em células nocaute. Consistente com o maior tamanho médio das adesões focais, células nocaute são mais rígidas e, portanto, menos elásticas que células selvagens, sendo que a rigidez avaliada por citometria magnético-óptica de oscilação se reflete na reduzida capacidade contrátil, seja em condições basais, em resposta à angiotensina II ou ao inibidor de ROCK, como evidenciado no ensaio de contração em gel de colágeno. Em síntese, os dados deste trabalho mostram que CRP3 está presente nas adesões focais, regulando tamanho e sinalização, com reflexos na rigidez (viscoelasticidade) e capacidade contrátil, variáveis fundamentais ao correto funcionamento de células musculares lisas aórticas. Em conjunto, as evidências deste trabalho suportam a hipótese de que CRP3 é um modulador de contratilidade e mecanotransdução em células musculares lisas aórticas / Smooth muscle cells act also as mecanosensors of the cardiovascular system, coordinating blood pressure and tissue perfusion by means of vascular tone and diameter modulation via the contractile response. The trigger for contraction is a rise in the intracellular calcium concentration and several signaling pathways have been described to sustain the initial calcium signal. Recent evidences highlight the crucial role of focal adhesions to the contractile response, given its role in actin cytoskeleton assembly and engagement with the actomyosin contractile apparatus. We have demonstrated that the cysteine and glycine-rich protein-3 (CRP3) interacts with focal adhesion kinase (FAK) in response to increased hemodynamic stress. Additionally, it has also been shown that CRP3 modulates actin cytoskeleton dynamics. Here, we tested the hypothesis that CRP3 acts as a focal adhesion protein that regulates the contraction of aortic smooth muscle cells. Through colocalization and immunoprecipitation studies we found that CRP3 is a focal adhesion protein in aortic smooth muscle cells. Focal adhesion mean size evaluation showed that in the baseline, CRP3 KO smooth muscle cells display greater focal adhesion size. However, upon angiotensin II (a contraction-triggering molecule) stimulation, CRP3 KO cells fail to maturate focal adhesions, an event that might be related to the reduced protein levels of FAK, paxillin, and MLC2 (key signaling molecules involved in focal adhesion maturation) observed in KO cells. Consistent with the greater mean focal adhesion size, CRP3 KO cells exhibited increased stiffness and therefore, reduced viscoelasticity when compared to wild type cells. The reduced viscoelasticity of KO cells seems to influence cell contractility, as CRP3 KO cells also displayed reduced contractile response in the baseline and in response to angiotensin II. In summary, these data showed that CRP3 is present at focal adhesions, regulating their size and signaling. Thus, CRP3 at focal adhesions influences cell stiffness and contractile capacity, which are key features of smooth muscle cell physiology. Altogether, our findings support the idea that CRP3 is a key modifier of contractility and mechanotransduction in aortic smooth muscle cells

O endotélio reveste a parede vascular e possui função essencial na manutenção da homeostase. A célula endotelial é capaz de perceber estímulos extracelulares, como fatores químicos e mecânicos, transmitir a informação para dentro da célula e regular sua função e fenótipo. Neste sentido, investigamos os mecanismos moleculares associados as células endoteliais em dois contextos importantes de intervenções vasculares 1) nos stents farmacológicos, onde a rapamicina exerce funções antiproliferativas e pró-trombogênicas, e 2) na revascularização cardíaca por ponte de safena, onde o alto estiramento mecânico exerce grande impacto no remodelamento vascular e no fenótipo da célula endotelial. A rapamicina pertence à classe de drogas limus, bastante utilizadas nos stents farmacológicos usados no procedimento de desobstrução vascular. Além de sua função antiproliferativa, exploramos os efeitos deletérios associados a pró-trombogênese. Os dados demonstraram que a rapamicina ativa o receptor de TGF independentemente de seu ligante TGFbeta, promovendo aumento na expressão da PAI-1 (pró-trombogênica), alteração no fenótipo endotelial (Transição endotélio-mesenquimal - EndMT) e na formação de fibras de estresse. Os efeitos observados são dependentes da ativação de Smad2 e independentes da via clássica antiproliferativa por mTOR. Experimentos in vivo mostraram que o tratamento com inibidor do receptor de TGF diminui os efeitos pró-trombogênicos e a expressão de PAI-1 induzidos pela rapamicina em artérias carótidas de camundongos. A ponte de safena é um procedimento bastante utilizado na cirurgia de revascularização cardíaca e a arterialização do segmento venoso submetido ao estresse hemodinâmico arterial resulta em remodelamento vascular, que influencia o sucesso do procedimento. Nossos dados demonstram que a célula endotelial humana de veia safena humana (hSVEC), susceptível as modificações do tipo EndMT induzido quimicamente (estímulo pró-fibrótico e pró-inflamatório), não expressou o mesmo comportamento em resposta ao aumento de estiramento mecânico que ocorre durante a arterialização venosa. Entretanto, detectamos uma pronunciada redução dos filamentos de actina, modulação no padrão de ativação da cofilina e na proporção de actina glomerular (G-actina) entre citoplasma e núcleo, com redução da biodisponibilidade de NO. De modo interessante, demonstramos que a redução no filamento de actina é específica para a célula endotelial venosa, não sendo observado em células endoteliais de origem arterial de aorta e coronária. Em conjunto, os dados mostram que 1) efeitos pró-trombogênicos associados a rapamicina são mediados por ativação do receptor de TGF independente do seu ligante e da atividade antiproliferativa da droga e 2) a adaptação da célula endotelial venosa ao estiramento mecânico envolve modulação da síntese/degradação de filamentos de actina e redução na biodisponibilidade de NO. Estes novos elementos sobre o mecanismo de transdução de estímulos químicos e físicos pelo endotélio poderão ser explorados terapeuticamente para modular a plasticidade endotelial em disfunções cardiovasculares / Endothelium is the inner layer in vascular wall and displays an essential role in the maintenance of cardiovascular homeostasis. Endothelial cell senses the extracellular stimuli, such as chemical and mechanical factors, transduce and process these signals to regulate cell function and phenotype. Here, we investigated molecular underpinning of the endothelial cells under two important scenarios: 1) in drug-eluting stents, where rapamycin exerts antiproliferative and undesirable prothrombogenic functions, and 2) in vein graft bypass surgery, where increased stretch modulates vascular remodeling and endothelial cell phenotype. Rapamycin belongs to the class of limus drugs and is widely used in drug eluting stents (DES) to vascular restenosis. In addition to its antiproliferative function, we explore the deleterious effects associated with prothrombogenesis. Our data demonstrated that rapamycin activates TGF receptor independent of its ligand TGFbeta, in concert with promotion of PAI-1 expression (prothrombogenic), changes in endothelial phenotype (Endothelial to Mesenchymal Transition - EndMT) and stress fibers induction. These effects are Smad2 dependent and independent of the classical antiproliferative mTOR pathway of rapamycin. Our in vivo experiments showed that TGF receptor inhibitor treatment decreases prothrombogenic effects and PAI-1 expression induced by rapamycin in mice carotid arteries. Saphenous vein is widely used in coronary artery bypass surgery (CABG) and the vein arterialization remodeling in response to the increased stress influences graft patency. Our data demonstrated that human saphenous vein endothelial cell (hSVEC) is susceptible to chemically induced endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) by pro-fibrotic and pro-inflammatory stimuli. On the other hand, physical stimulus associated with high stretch failed to induce EndMT. However, we detected a pronounced decrease of actin filaments, modulation of the cofilin activation, changes in the proportion of glomerular actin (G-actin) between cytoplasm and nucleus, and reduction of NO bioavailability. Interestingly, the reduction of actin fibers by high stretch is specific to venous endothelial cell since arterial endothelial cells from aorta, and coronary artery failed to display the response. Altogether, our data show that 1) the thrombogenic effects of rapamycin are mediated by TGF receptor activation independent of its ligand and independent of the antiproliferative pathway of the drug, and 2) the adaptation of venous endothelial cell to mechanical stretch involves synthesis/degradation of actin filaments and reduced NO bioavailability. These new elements on signal transduction of endothelial cells in response to chemical and physical stimuli may be therapeutically explored to modulate endothelial plasticity in cardiovascular disorders

INTRODUÇÃO: A prolactina é um hormônio polipeptídico que possui reconhecida ação sistêmica, principalmente no sistema reprodutor. O papel desse hormônio no desenvolvimento e na extensão do câncer da mama ainda é muito debatido. A progressão do câncer de mama em grande parte depende do movimento celular e da capacidade da célula em remodelar seu citoesqueleto de actina. Nesse processo, proteínas envolvidas na migração celular, como moesina, FAK e c-Src, são influenciadas por vários hormônios, incluindo a prolactina. O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos da PRL na migração de células T47D, MCF-7 e ZR75-1 de câncer de mama, bem como os mecanismos envolvidos. MÉTODOS: As células foram cultivadas em placas de cultura com meio suplementado e divididas em oito grupos diferentes de tratamento: Grupo I (veículo); Grupo II (PRL na concentração de 25 ng/mL); Grupo III (PRL na concentração de 50 ng/mL), Grupo IV (PRL na concentração de 100 ng / mL), Grupo V (RNAi + veículo); Grupo VI (RNAi + PRL na concentração de 25 ng/mL); Grupo VII (RNAi + PRL na concentração de 50 ng/mL) e Grupo VIII (RNAi + PRL na concentração de 100 ng / mL). Nos Grupos de I a IV, a reorganização da actina do citoesqueleto foi analisada por imunofluorescência após 30 minutos do tratamento. Em todos os grupos estudados foram realizadas análise da migração horizontal com auxílio de microscopia de luz e avaliadas as expressões de Moesina, p-Moesina, FAK, p-FAK, c-Src e p-c-Src por Western Blot após 48 horas do tratamento. RESULTADOS: As células de câncer de mama expostas à prolactina apresentaram um aumento da expressão de Moesina, p-Moesina, FAK, p-FAK, c-Src e p-c-Src. Essas alterações moleculares estão associadas à reorganização da actina do citoesqueleto e ao aumento da mobilidade das células. CONCLUSÕES: Nossos dados sugerem que a prolactina aumenta a migração das células T47D, MFC-7 e ZR75-1 de câncer de mama e remodela a actina do citoesqueleto pela via de sinalização intracelular das proteínas c-Src, FAK e moesina / INTRODUCTION: Prolactin is a polypeptide hormone with a recognized systemic action mainly on reproductive physiology. The role of this hormone on breast cancer development and progression has been debated a lot yet. Breast cancer invasion largely depends on cell movement and on the ability to remodel the actin cytoskeleton. In this process, proteins involved in cell migration, such as moesin, FAK and c-Src, are influenced by a large number of hormones, such as prolactin. The present study was aimed for evaluating the effects of PRL on migration of T47D, MCF-7 and ZR75-1 breast cancer cells as well as the molecular mechanisms in this process. METHODS: The cells were cultured in dishes with supplemented medium and were divided in eight different assays: Group I (control); Group II (25ng/ml of prolactin); Group III (50ng/ml of prolactin); Group IV (100ng/ml of prolactin); Group V (RNAi + control); Group VI (RNAi + 25ng/ml of prolactin); Group VII (RNAi + 50ng/ml of prolactin); Group VIII (RNAi + 100ng/ml of prolactin). In Groups I to IV, the actin cytoskeletal reorganization was analyzed by immunofluorescence 30 minutes after the treatment. In all groups, were performed the horizontal migration analysis with light microscopy and evaluated the expression of moesin, p-moesin, FAK, p-FAK, c-Src and p-c-Src by Western blot after 48 hours of treatment. RESULTS: Breast cancer cells exposed to prolactin display an elevated moesin, p-moesin, FAK, p-FAK, c-Src and p-c-Src expression. These molecular changes are associated with the reorganization of actin cytoskeleton and increased mobility of cells. CONCLUSION: Our data suggest that prolactin enhances the migration of T47D, MFC-7 and ZR75-1 breast cancer cells through the actin cytoskeleton remodeling by intracellular signaling pathway of c-Src, FAK and moesin proteins

RESUMEN La hipusinación es una modificación post-traduccional dependiente de espermidina que activa al factor de traducción eIF5A, y que es esencial en todos los eucariotas. En los últimos años se ha sugerido un importante papel para eIF5A en los procesos de senescencia y respuesta a estrés ambiental en plantas, en el establecimiento de la polaridad celular en levadura y su implicación en enfermedades tales como diabetes, VIH-1 o cáncer en humanos. Con el objetivo de caracterizar a nivel molecular la actividad biológica de eIF5A en plantas, hemos establecido una metodología basada en técnicas bioquímicas e inmunológicas para determinar el patrón de hipusinación de eIF5A en A. thaliana. La puesta a punto de esta metodología nos ha permitido demostrar que el tratamiento con ácido abscísico inhibe la activación por hipusinación de la isoforma eIF5A1. Además, para tratar de estudiar la función de eIF5A durante el desarrollo de A. thaliana, hemos realizado estudios funcionales basados en la caracterización de plantas transgénicas capaces de desactivar genéticamente la ruta dependiente de eIF5A mediante ARN de interferencia, condicionado a la aplicación de dexametasona. La desactivación condicional de la enzima de hipusinación desoxihipusina sintasa, produjo alteraciones durante el desarrollo y en respuesta a condiciones adversas de crecimiento, tales como floración temprana, inhibición del crecimiento de la raíz, alteraciones en los pelos radiculares, ramificación exacerbada del tallo, presencia de elementos traqueales completamente lignificados en hipocotilos, niveles reducidos de óxido nítrico e hipersensibilidad al ácido abscísico, sal y glucosa. Recientemente se ha demostrado que eIF5A es necesario para la traducción de proteínas con más de 3 prolinas sucesivas en su secuencia. El análisis de ontología realizado reveló un enriquecimiento de proteínas con poli-prolinas entre las implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. La alteración de la actividad de eIF5A provocó defectos en la estructuración de los filamentos de actina en A. thaliana, S. cerevisiae y H. sapiens. El estudio de mutantes termosensibles de levadura demostró el requerimiento de eIF5A durante el proceso de reproducción sexual a través de la traducción de la formina Bni1. Los experimentos de regulación traduccional en células HeLa demostraron que el silenciamiento vía ARN de interferencia de eIF5A1 provocaba un defecto en la tasa de traducción de la formina FMNL1 y la proteína ezrina. Estos resultados confirman que la actividad esencial de eIF5A en el ribosoma parece conservada en organismos eucariotas, y afecta fundamentalmente a proteínas con poli-prolinas implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. / Belda Palazón, B. (2014). Hipusinación del factor de traducción eIF5A dependiente de poliaminas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48474 / TESIS