Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T12:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_Luciene_D.pdf: 3990737 bytes, checksum: 7c865de830ecbe5f830e992e6c69fb2c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Estímulo mecânico é um dos principais eventos envolvidos na hipertrofia cardíaca que afeta vários componentes de vias de sinalização do miocárdio. Recentemente, um novo transcrito altamente expresso em músculo cardíaco, denominado de ARHGAP21, foi descrito como um membro da família de proteínas Rho GAP, que demonstrou atividade catalítica sobre Cdc42 e interação com ARF1, ARF6 e a-catenina, proteínas importantes do remodelamento do citoesqueleto e junções aderentes. No presente estudo, tivemos como objetivo analisar a expressão da ARHGAP21 em resposta ao estresse mecânico agudo em corações de ratos adultos, e sua associação com FAK e PKC?. Utilizando-se fracionamento subcelular, microscopia confocal e eletrônica, demonstramos que ARHGAP21 relocaliza-se das regiões nucleares e miofilamentos para linhas Z, discos intercalares e costâmeros de cardiomiócitos submetidos à sobrecarga de pressão, sugerindo que esta roteína pode desenvolver uma importante função no remodelamento cardíaco. Além do mais, ensaio de imunoprecipitação mostrou que ARHGAP21 interage com PKC? e FAK em ratos controle, submetidos à coarctação da aorta e espontaneamente hipertensos (SHR). Três diferentes regiões de FAK, contendo cauda de GST acoplada, foram utilizadas em ensaio de ligação in vitro, demonstrando que ARHGAP21 se liga à porção carboxi terminal de FAK. Além disso, ARHGAP21 associa-se à PKC? fosforilada em Thr410 em o-imunoprecipitados de extratos protéicos de ratos controle e SHR. Entretanto, ARHGAP21 associa-se apenas à FAK fosforilada em Tyr925 em SHR. Também foi verificado que PKC? é fosforilada por estímulo mecânico. Estes resultados sugerem que ARHGAP21 pode atuar como uma molécula sinalizadora ou proteína adaptadora das vias de sinalização de FAK e PKC? em cardiomiócitos, provavelmente desempenhando importante função durante estresse cardíaco / Abstract: Mechanical stimulus is one of the major events involved in cardiac hypertrophy, and affects components of essential myocardium signaling pathways. Recently, we described a highly expressed mRNA in the cardiac muscle as a member of the RhoGAP family of proteins, ARHGAP21, which demonstrated GAP activity over Cdc42 and interacted with ARF1, ARF6 and a-catenin important proteins of the cytoskeleton assembly and adherent junctions. In the present work, we aimed to analyze the expression of ARHGAP21 in response to acute mechanical stress in the adult rat heart and its association with FAK and PKC? proteins. By subcellular fractionation, confocal and immunoelectron microscopy, we demonstrated that ARHGAP21 is relocated from the nucleus to the plasma membrane, Z-lines and costameres of cardiomyocytes submitted to pressure overload conditions, suggesting that this protein may develop a role in cardiac remodeling. Furthermore, immunoprecipitation assay showed that ARHGAP21 interacted with PKC? and FAK in control rats, rats submitted to aortic clamping and spontaneously hypertensive rats (SHR). Using three different GST-tagged regions of FAK, we found that ARHGAP21 binds to the carboxyl terminal portion of FAK. Moreover, ARHGAP21 binds to PKC? phosphorylated on Thr410 in co-immunoprecipitates of protein extracts from sham control rats and SHR. However, ARHGAP21 only binds to FAK phophorylated on Tyr925 of SHR. We have also shown that PKC? is phosphorylated by mechanical stimuli. Altogether, these results suggest that ARHGAP21 may act as a signaling molecule or scaffold protein of FAK and PKC? signaling pathways in cardiomyocytes, probably developing an important function during cardiac stress / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Marcia Queiroz Latorraca / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:35:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Veloso_RobertoVilela_D.pdf: 1133010 bytes, checksum: ae2bb8d027240ebc20854087fa364a1b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A restrição protéica materna reduz o crescimento e promove alterações permanentes na estrutura e função de órgãos da prole, contribuindo para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, obesidade e diabetes. O consumo de alimentos à base de soja está associado a um menor risco de desenvolver diabetes pelo seu conteúdo de isoflavonas e pela composição de aminoácidos de sua proteína que contribuem para uma melhora na secreção de insulina. Tem sido sugerido que a genisteína, uma isoflavona da soja, modula a secreção de insulina através das vias AMPc/PKA e PLC/PKC. Deste modo, nós avaliamos o valor biológico da dieta à base de farinha de soja e seus efeitos sobre o crescimento de órgãos, o perfil de aminoácidos, insulina e metabólitos séricos em ratos submetidos à restrição protéica na infância e recuperados com essa dieta após o desmame, bem como o efeito da dieta à base de soja sobre a secreção de insulina em resposta a glicose e a ativadores do adenilato ciclase e proteína quinase C, além da expressão da PKAa e PKCa em ilhotas pancreáticas de ratos adultos. Ratos de mães alimentadas com 17% ou 6% de proteína (caseína) durante a gestação e lactação foram mantidos com dieta contendo 17% de proteína à base de caseína (grupos CC e RC) ou dieta com 17% de proteína à base de farinha de soja (grupos CS e RS) e dieta com 6% de proteína (grupo HP). Após 90 dias de idade, proles de mães alimentadas com dieta hipoprotéica exibiram déficit permanente de peso corpóreo e de concentrações séricas de insulina, taurina, glutamina, fenilserina e lisina, porém apresentaram um aumento no peso relativo dos órgãos, exceto do fígado. A dieta à base de farinha de soja reduziu o peso relativo do fígado e aumentou as concentrações séricas de insulina, taurina, ornitina e fenilserina. Embora ratos recuperados com soja (RS) tenham ingerido mais dieta proporcionalmente ao peso corpóreo do que os ratos recuperados com caseína (RC) eles mostraram menor coeficiente de eficácia alimentar, e resultou em peso corpóreo final similar entre esses grupos. As concentrações séricas de albumina e proteínas totais não diferiram entre os grupos RS e RC. A dieta à base de soja melhorou a resposta de células beta de ratos controles em concentrações fisiológicas de glicose, enquanto em ilhotas de ratos recuperados isso ocorreu na presença de concentrações suprafisiológicas de glicose. A presença de PMA induziu uma resposta secretória com potência similar em ilhotas dos grupos RS e CS e a expressão de PKC foi similar em todos os grupos, exceto no grupo HP, que expressou menores concentrações dessa proteína. A adição de forskolin ao meio de incubação aumentou a secreção de insulina em ratos recuperados e naqueles mantidos com caseína e a expressão de PKAa foi maior no grupo RS em relação ao grupo CS. Esses resultados sugerem que dieta à base de farinha de soja é capaz de promover a recuperação nutricional em animais submetidos à restrição protéica em fases críticas de desenvolvimento, melhorando o perfil de aminoácidos séricos que estimulam a secreção de insulina. Além disso, a melhora na secreção de insulina parece não ser devido a ativação das vias AMPc/PKA e inositol fosfato/PKC / Abstract: Maternal protein restriction leads to reduction in the growth of organs, permanent changes in their structure and functions contributing to development of cardiovascular disease, obesity and diabetes. Consumption of soy-based foods is associated to lower risk of diabetes by its isoflavone content and amino acid composition of its protein that contribute to improve of insulin secretion. It has been suggested that genistein, soy isoflavone, modulates the insulin secretion through of cAMP/PKA and PLC/PKC pathways. Thus, we evaluated the biological value of soybean flour diet and its effects on organ growth, serum amino acids, insulin and metabolites profile in rats submitted to protein restriction in early life and recovered with those diet after weaning, as well as, the effect of soybean diet on insulin secretion in response to glucose and activators of adenylate cyclase and PKC, besides the expression of PKA and PKC in pancreatic islets from adult rats. Rats from mothers fed with 17% or 6% protein (casein) during pregnancy and lactation were maintained with 17% casein (CC and CR groups) or soybean (SC and SR groups) diet and with 6% casein (LP groups) diet. At 90d of age offspring of protein-restricted-mothers exhibited permanent deficit of body weight, serum insulin, taurine, glutamine, phenylserine and lysine concentrations, but increased relative organs¿ weight, except liver. Soybean flour diet reduced the relative liver weight and increased serum insulin, taurine, ornithine and phenylserine concentrations. Although SR rats had eaten proportionally to body weight more diet than CR rats they showed lower feed conversion efficiency which resulted in the final body weight similar between these groups. The SR and CR also exhibited similar serum albumin and protein concentrations. Soybean diet improved the response of ß-cells from control rats to a physiological concentration of glucose, whereas in islets from recovered rats this occurred in presence of a supra-physiological glucose concentration. PMA induced similar potent secretory response in islets from SR and SC groups and PKC expression was similar in all groups, except LP that expressed lower levels this protein. Forskolin increased the insulin secretion in recovered rats and in those maintained with casein diet and PKA expression was higher in SR than in SC rats. These results suggest that soybean flour diet is able to promote the nutritional recovery in animals submitted to protein restriction in critical phase of development improving serum amino acid levels that have the stimulatory effect on insulin release. Moreover the improve of insulin secretion seemed does not to be due the activation of the cAMP/PKA and inositol phosphate/PKC pathways / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de mau prognóstico caracterizada por disfunção cardíaca associada à intolerância aos esforços, retenção de fluído e redução da longevidade. Dentre as serina/treonina quinases associadas às alterações funcionais e estruturais cardíacas observadas na progressão da insuficiência cardíaca, a família das proteínas quinase C (PKC) composta por 12 diferentes isoformas parece modular a contratilidade miocárdica e o remodelamento cardíaco. No presente estudo, caracterizamos o fenótipo cardíaco e o perfil de ativação das diferentes isoformas de PKC na progressão da insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica em ratos. Além disso, estudamos o efeito da inibição sustentada da isoforma PKCβII sobre a sobrevida, o remodelamento cardíaco e a função ventricular em modelo de insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica. Conseguinte, identificamos possíveis substratos cardíacos da PKCβII envolvidos na progressão da insuficiência cardíaca. Para isso, avaliamos os efeitos agudo e crônico da inibição da PKCβII sobre o transiente de cálcio e a contratilidade de cardiomiócito isolados de ratos adultos com insuficiência cardíaca. Por fim, testamos as inibições específicas das PKCβII e PKCβI na progressão da hipertrofia cardíaca compensada para a insuficiência cardíaca em modelo animal de hipertensão arterial sustentada. Nossos resultados sugerem que a inibição sustentada da PKCβII reverte o quadro de insuficiência cardíaca, melhorando a função ventricular, o remodelamento cardíaco e a sobrevida dos diferentes modelos de insuficiência cardíaca estudados, constituindose em uma estratégia terapêutica celular promissora / Heart failure is a common endpoint for many forms of cardiovascular disease and a significant cause of morbidity and mortality worldwide. Protein kinase C isozymes emerge as important potential therapeutic targets in chronic cardiovascular disease. However, individual PKC isozymes play different roles in the pathogenesis of cardiac diseases. Here, we characterized the cardiac phenotype as well as the different PKC isozyme activation profile during myocardial-induced heart failure progression in rat. Furthermore, we evaluated the role of selective PKCβ II inhibition on survival, left ventricle remodeling and cardiac function in myocardial-induced heart failure. Moreover, we identified the cardiac PKCβII substrates related to heart failure. Finally, PKCβII and PKCβI specific inhibitors were chronically delivered to hypertensive-induced heart failure rats and the cardiac phenotype was evaluated. Our data suggest that 6-wks of PKCβII inhibition, but not PKCβI, improved animal survival by restoring cardiac function and promoting cardiac anti-remodeling effect in both myocardial infarctioninduced heart failure and hypertensive-induced heart failure rats. The improved cardiac function and anti-remodeling effect of PKCβII inhibition seems to be associated with increased contractility of cardiac myocytes, improved miofilaments/Ca2+ sensitivity and decreased cardiac inflammatory response. Altogether, the results provide evidence for beneficial effects of PKCβII specific intracellular inhibition on cardiac function and remodeling, which may be a promising cellular therapy for heart failure treatment

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The endogenous poliaminas, putrescine, spermidina and spermine are aliphatics amines that are present in high concentrations in the central nervous system (SNC). The action of the poliamines involves the modulation of several ionic channels, including the subtype of glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA). The processes mediated by NMDA receptor include synaptic plasticity and formation of neural circuitry. It is believed that these plasticities happening in some cerebral areas specifies, as the hippocampus, are critical for the learning and memory processes. It is described that spermidine (SPD), as well as the protein kinase are directly involved with processes of formation of the memory. Therefore, we investigated the involvement of the Ca2+ dependent (PKC) and cAMP-dependent (PKA) protein kinase in the facilitatory effect induced by SPD on the memory of males Wistar rats. For that, the rats were bilaterally cannulae in the hippocampus, after the surgical recovery, the animals were trained in the inhibitory avoidance task and injected (0.5 μL) bilaterally in the hippocampus. A subset of the animals was euthanized 30 or 180 min after injections and activity of PKC, PKA and cAMP response element-binding protein (CREB), in the hippocampus, was determined for Western blot. The other animals had a testing session, 24 h pos-training in the inhibitory avoidance apparatus. The post-training administration of the 3-[1-(Dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-4-(indol-3-yl)maleimide hydrochloride [GF 109203X, 2.5 ρmol intrahippocampal (ih)], inhibitor of PKC, N-[2-bromocinnamylamino ethyl]-(5-isoquinoline sulfonamide) [H-89, 0.5 ρmol intrahippocampal (ih)], PKA inhibitor or arcaine (0.02 nmol ih), the antagonist of the NMDA receptor polyamine-binding site prevented memory improvement induced by SPD (0.2 nmol ih). The SPD (0.2 nmol), in the hippocampus, facilitated PKC 30 min, PKA and CREB phosphorylation 180 min after administration, and increased translocation of the catalytic subunit of PKA into the nucleus. GF 109203X, (2.5 ρmol) prevented the stimulatory effect of SPD on PKC, PKA and CREB phosphorylation. Furthermore, arcaine (0.02 nmol) and H-89 (0.5 ρmol) prevented the stimulatory effect of SPD on PKA and CREB phosphorylation 180 min after administration. None of the drugs studies altered the locomotor activity of the animals. These results suggest that the facilitatory effect of the memory induced by the ih administration SPD involves the cross talk between PKC and PKA/CREB, with PKC activation follow by PKA/CREB pathways activation in rats. / As poliaminas endógenas, putrescina, espermidina e espermina, são aminas alifáticas que estão presentes em altas concentrações no sistema nervoso central (SNC). As poliaminas modulam diversos canais iônicos, incluindo o subtipo de receptor glutamatérgico N-metil D-aspartato (NMDA). Os processos mediados pelo receptor NMDA incluem plasticidade sináptica e formação de circuitos neurais. Acredita-se que estas plasticidades ocorrendo em algumas regiões cerebrais específicas, como o hipocampo, são críticas para os processos de aprendizado e memória. Está descrito que a espermidina (SPD), assim como as proteínas quinase, esta diretamente envolvida com os processos de formação da memória. Assim, investigamos o envolvimento das proteínas quinases dependente de AMPc (PKA) e dependente de Ca2+ (PKC) sobre a melhora da memória induzida por SPD em ratos. Para isso, ratos Wistar machos foram canulados bilateralmente no hipocampo e após a recuperação cirúrgica treinados na tarefa de esquiva inibitória. Imediatamente após o treino os animais receberam através das cânulas (0,5 μl/sítio) a administração de N-[2-bromocinamilamino etil]-(5-isoquinolina sulfonamida) [H-89, 0,5 ρmol intrahipocampal (ih)], inibidor da PKA, 3-[1-(Dimetilaminopropil)indol-3-il]-4-(indol-3-il)maleimida hidrochloride [GF 109203X, 2,5 ρmol (ih)], inibidor da PKC, arcaína (0,02 nmol, ih), antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA ou SPD (0,2 nmol, ih). Um grupo de animais foi eutanasiado 30 ou 180 minutos após a administração das drogas e a atividade da PKC, PKA e o elemento ligante responsivo ao AMPc (CREB), no hipocampo, foi determinada por Western blot. Os outros animais foram submetidos à sessão de teste, 24 horas depois do treino na esquiva inibitória. A administração de H-89, GF 109203X ou arcaína preveniu a melhora da memória induzida por SPD. A SPD (0,2 nmol) aumentou a fosforilação da PKC 30 min, da PKA e do CREB 180 min após a injeção e aumentou a translocação da subunidade catalítica da PKA do citosol para o núcleo. GF 109203X, (2,5 ρmol) preveniu o efeito estimulatório da SPD sobre a fosforilação da PKC, PKA e CREB. Além disso, arcaína (0,02 nmol) e H- 89 (0,5 ρmol) preveniram o efeito estimulatório da SPD sobre a fosforilação da PKA e CREB 180 min depois da injeção. Nenhuma das drogas alterou a atividade motora dos animais. Estes resultados sugerem que o efeito facilitatório da memória induzido pela administração ih de SPD envolve um cruzamento entre PKC e PKA/CREB, com a ativação inicial da PKC, seguida da ativação da cascata PKA/CREB em ratos. Assim, poderemos determinar um possível mecanismo de ação da espermidina nos processos de formação da memória, e desta forma, fornecer subsídios para o desenvolvimento de fármacos.

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de mau prognóstico caracterizada por disfunção cardíaca associada à intolerância aos esforços, retenção de fluído e redução da longevidade. Dentre as serina/treonina quinases associadas às alterações funcionais e estruturais cardíacas observadas na progressão da insuficiência cardíaca, a família das proteínas quinase C (PKC) composta por 12 diferentes isoformas parece modular a contratilidade miocárdica e o remodelamento cardíaco. No presente estudo, caracterizamos o fenótipo cardíaco e o perfil de ativação das diferentes isoformas de PKC na progressão da insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica em ratos. Além disso, estudamos o efeito da inibição sustentada da isoforma PKCβII sobre a sobrevida, o remodelamento cardíaco e a função ventricular em modelo de insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica. Conseguinte, identificamos possíveis substratos cardíacos da PKCβII envolvidos na progressão da insuficiência cardíaca. Para isso, avaliamos os efeitos agudo e crônico da inibição da PKCβII sobre o transiente de cálcio e a contratilidade de cardiomiócito isolados de ratos adultos com insuficiência cardíaca. Por fim, testamos as inibições específicas das PKCβII e PKCβI na progressão da hipertrofia cardíaca compensada para a insuficiência cardíaca em modelo animal de hipertensão arterial sustentada. Nossos resultados sugerem que a inibição sustentada da PKCβII reverte o quadro de insuficiência cardíaca, melhorando a função ventricular, o remodelamento cardíaco e a sobrevida dos diferentes modelos de insuficiência cardíaca estudados, constituindose em uma estratégia terapêutica celular promissora / Heart failure is a common endpoint for many forms of cardiovascular disease and a significant cause of morbidity and mortality worldwide. Protein kinase C isozymes emerge as important potential therapeutic targets in chronic cardiovascular disease. However, individual PKC isozymes play different roles in the pathogenesis of cardiac diseases. Here, we characterized the cardiac phenotype as well as the different PKC isozyme activation profile during myocardial-induced heart failure progression in rat. Furthermore, we evaluated the role of selective PKCβ II inhibition on survival, left ventricle remodeling and cardiac function in myocardial-induced heart failure. Moreover, we identified the cardiac PKCβII substrates related to heart failure. Finally, PKCβII and PKCβI specific inhibitors were chronically delivered to hypertensive-induced heart failure rats and the cardiac phenotype was evaluated. Our data suggest that 6-wks of PKCβII inhibition, but not PKCβI, improved animal survival by restoring cardiac function and promoting cardiac anti-remodeling effect in both myocardial infarctioninduced heart failure and hypertensive-induced heart failure rats. The improved cardiac function and anti-remodeling effect of PKCβII inhibition seems to be associated with increased contractility of cardiac myocytes, improved miofilaments/Ca2+ sensitivity and decreased cardiac inflammatory response. Altogether, the results provide evidence for beneficial effects of PKCβII specific intracellular inhibition on cardiac function and remodeling, which may be a promising cellular therapy for heart failure treatment

Orientador: Carlos Amílcar Parada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prado_FilipeCesardo_M.pdf: 428700 bytes, checksum: 1f8f2df5d5cae548c5b0d1a6a66947f7 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Enquanto a hiperalgesia inflamatória depende da liberação de prostaglandinas e/ou de aminas simpatomiméticas que sensibilizam os neurônios aferentes primários, nosso grupo demonstrou recentemente que o bloqueio do receptor P2X3 no tecido periférico previne a hiperalgesia induzida pela carragenina.. No entanto, o mecanismo pelo qual a ativação dos receptores P2X3 neuronais contribui para a hiperalgesia inflamatória não está completamente estabelecido. O presente estudo verifica se a ativação do receptor P2X3 dos neurônios aferentes primários contribui para a hiperalgesia mecânica induzida pela prostaglandina E2 ou pela dopamine no tecido periférico. A co-administração de A317491 (60 µg / paw), um antagonista seletivo do receptor P2X3, ou o prétratamento com dexametasona (1 mg / mL / kg), preveniu a hiperalgesia mecânica medida 3 horas depois da administraçao de carragenina (300 µg / paw) na pata posterior de ratos. A administração de ??meATP (50 µg /paw) induziu hiperalgesia mecânica 1 hora, mas não 3 horas, depois da sua administração, que foi prevenida pela dexametasona ou pelo A317491. Doses sublimiares de PGE2 (4 ng / paw) ou dopamina (0.4 µg / paw) que não induzem hiperalgesia por si só, induziram hiperalgesia, 3 horas depois, quando administradas logo depois de ??meATP ou carragenina em ratos tratados com dexametasona. Esses estados de hiperalgesia ("priming") revelados pelas doses sublimiares de PGE2 ou dopamine foram prevenidos pelo A317491 ou pelo tratamento com administração intraganglionar (DRG-L5) de ODN antisense, mas não pelo ODN mismatch, contra o receptor P2X3 (40 µg /5µL once a day for 4 days). ODN antisense, mas não o ODN mismatch, reduziu a expressão dos receptores P2X3 no nervo safeno e no DRG-L5. Para verificar se a PKC? media esse estado de hiperalgesia, inibidor de translocação de PKC? (1 µg/paw) foi administrado no tecido periférico 45 minutos antes do ??meATP ou PGE2 (100 ng/paw). O inibidor de PKC? preveniu o estado de hiperalgesia induzido pelo ??meATP ("priming"), mas não a hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 (100 ng/paw). Dessa maneira, os resultados desse estudo sugerem que a hiperalgesia inflamatória depended a ativação dos receptores P2X3 neuronais e da subsequente translocação da PKC? , que aumenta a susceptibilidade dos neurônios aferentes primários (priming) à ação de outros mediadores inflamatórios como a PGE2 e as aminas simpatomiméticas / Abstract: While inflammatory hyperalgesia depends on the release of prostaglandins and/or sympathetic amines that ultimately sensitize the primary afferent neurons, we have recently demonstrated that blockade of P2X3 receptor in the peripheral tissue completely prevents carrageenan-induced hyperalgesia. However, the mechanism by which the activation of neuronal P2X3 receptor contributes to the inflammatory hyperalgesia is not completely clear. The present study verifies whether the activation of P2X3 receptor on primary afferent neurons contributes to the mechanical hiperalgesia induced by prostaglandin E2 or dopamine in the peripheral tissue. Co-administration of A317491(60 µg / paw), a selective P2X3,2/3 receptor antagonist, or pre-treatment with dexamethasone (1 mg / mL / Kg), prevented the mechanical hyperalgesia measured 3 hours after the administration of carrageenan (300 µg / paw) in the rat's hind paw. The administration of ??meATP (50 µg /paw) induced mechanical hiperalgesia 1 hour, but not 3 hours, after its administration, which also was prevented by dexamethasone or A317491. Sub-threshold doses of PGE2 (4 ng / paw) or dopamine (0.4 µg / paw) that do not induce hyperalgesia by themselves, induced maximal hyperalgesia, 3 hours after, when administrated Just following ??meATP or carrageenan in rats treated with dexamethasone. These hyperalgesic states ("priming") revealed by sub-threshold doses of PGE2 or dopamine were prevented by A317491 or treatment with ganglionar administrations (DRG-L5) of ODN antisense, but not ODN mismatch, against P2X3 receptor (40 µg /5µL once a day for 4 days). ODN antisense, but not ODN mismatch reduced the expression of P2X3 receptors in the saphenous nerve and in DRG-L5. To verify whether PKC? mediates this hyperalgesic state, PKC? translocation inhibitor (1 µg/paw) was administrated in peripheral tissue 45 min. before ??meATP or PGE2 (100 ng/paw). PKC? inhibitor inhibited the hyperalgesic state induced by ??meATP ("priming"), but not the mechanical hyperalgesia induced by PGE2 (100 ng/paw). Briefly, the findings of this study suggest that the inflammatory hyperalgesia depends on neuronal activation of P2X3 receptor and the subsequent PKC? translocation, which increases the susceptibility of primary afferent neurons (priming) to others inflammatory mediators such as PGE2 and symphatetic amines / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Disertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T18:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_ElayneVieira_M.pdf: 1520883 bytes, checksum: 05673dcedfdc35b300eb07144edbd5bb (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O condicionamento clássico aversivo é utilizado para investigar os mecanismos celulares e moleculares na formação da memória em diferentes espécies de animais. Estes envolvem processos sinápticos que desencadeiam mecanismos de sinalização intracelular com ativação de diferentes quinases em momentos específicos. A ativação da PKC é um dos mecanismos moleculares da plasticidade sináptica subjacente à formação de memória. O presente trabalho investigou o envolvimento da PKCá/âIl no condicionamento clássico aversivo em pombos. No Experimento 1, o inibidor da PKC, calfostina C foi administrado i.c.v. em um grupo de pombos (GCdCa, n=6; 5ml de solução 60mg/ml, DMSO 2%), 1h antes do condicionamento. Outro grupo recebeu veículo (GCdVe, n=5; DMSO 2% em salina). A sessão de condicionamento teve 20 min de duração e 3 pareamentos som-choque (treino). O teste ao contexto ocorreu 24h após o treino. O Experimento 2 usou grupos de pombos expostos ao contexto experimental (GCC), som e choque não pareados (GCR) ou som-choque pareados (GCd) para investigar a ativação da PKCá/âII no hipocampo 2h após o treino, por meio de Western blot. No Experimento 3, grupos de pombos não treinados (GC, n=6) ou sacrificados em diferentes tempos após o treino - G1min (n=6), G1h (n=6), G2h (n=6) e G24h (n=6) - foram utilizados para investigar o curso temporal da ativação da PKCá/âII e da fosforilação do substrato da PKC, GAP-43, no hipocampo. Todas as sessões foram gravadas em vídeo para posterior análise dos dados comportamentais. No Experimento 1 o GCdCa teve menor expressão da resposta condicionada de congelamento (freezing) ao contexto em comparação ao GCdVe (p<0,05), indicando que a administração da calfostina C prejudicou a memória aversiva contextual. Não ocorreram diferenças significativas na ativação da PKC á/âII entre os diferentes grupos (Experimentos 2 e 3;p>0,05), mas houve maior imuno-marcação da GAP-43 fosforilada no G1min quando comparado ao GC (Experimento 3; p<0,05). Esses dados indicam o envolvimento da PKC em mecanismos de aprendizagem e memória aversiva em pombos, e sugerem que outras isoformas além da PKCá/âII podem participar desses processos. / Abstract: The classical aversive conditioning is used to investigate cellular and molecular mechanisms of memory formation in different animal species. Those mechanisms involve synaptic processes that trigger intracellular signaling with activation of different kinases at specific time points. The PKC activation is one of the molecular mechanisms of synaptic plasticity underlying memory. This study investigated the involvement of PKCá/âIl in classical aversive conditioning in pigeons. In Experiment 1, the PKC inhibitor, calphostin C was administered i.c.v. in one group of pigeons (GCdCa, n=6; 5ml solution 60mg/ml, DMSO 2%), 1h before the conditioning. Another group received vehicle (GCdVe, n=5; DMSO 2% in saline). The session of conditioning had 20 min duration and 3 tone-shock pairings (training). The test to the context occurred 24h after training. Experiment 2 investigated with Western blot analysis the PKCá/âII activation in the hippocampus 2h after the training in groups of pigeons that were exposed to unpaired (GCR) or paired (GCd) tone-shock presentations or to the experimental context only (GCC). In Experiment 3, groups of pigeons naive (GC, n=6) or sacrificed at different times after the training - G1min (n=6), G1h (n=6), G2h (n=6) and G24h (n=6) - were used to investigate the time course of the PKCá/âII activation and phosphorylation of PKC substrate, GAP-43, in the hippocampus. All sessions were video recorded for analysis of behavioral data. In Experiment 1 GcdCa had lower expression of conditioned freezing response to the context in comparison to GCdVe (p<0.05), indicating that calphostin C administration impaired contextual aversive memory. No significant differences in the PKCá/âII activation were observed among the groups (Experiments 2 and 3; p>0.05) but the immunolabeling of phosphorylated GAP-43 in G1min was higher as compared to GC (Experiment 3; p<0.05). These data indicate the involvement of PKC in mechanisms of aversive learning and memory in pigeons and suggest that other isoforms besides PKCá/âII may play a role in those processes. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T15:24:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nery_FlaviaCristina_D.pdf: 4972440 bytes, checksum: 86b749df91267d19e655449a4dfc3d0c (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Ki-1/57 é um antígeno humano de 57kDa reconhecido pelo anticorpo Ki-1, o qual também reconhece CD30. Ki-1/57 se encontra no núcleo e no citoplasma sendo fosforilado nos resíduos de serina e de treonina após a ativação das células. Quando Ki-1/57 foi isolado da linhagem L540 de células de linfoma de Hodgkin, ela co-imunoprecipitou com atividade quinase em resíduos de Ser/Thr. Além disso, foi relatado que Ki-1/57 interage com o ácido hialurônico e conseqüentemente foi denominada de ¿proteína intracelular que se liga a hialuronato 4¿ (IHABP4). Nós usamos o sistema de duplo híbrido em levedura e encontramos que Ki-1/57 interage especificamente com a proteína com domínios cromo-helicase e de ligação ao DNA 3 (CHD3), uma proteína nuclear envolvida em remodelagem da cromatina e regulação da transcrição, e com RACK1 (¿proteína adaptadora para quinase C ativada¿). A interação entre Ki-1/57 e seus ligantes foi confirmada por outros experimentos in vitro e in vivo. Interessantemente, a interação entre Ki-1/57 e RACK1 foi abolida após fosforilação da Ki-1/57 e observamos que o estímulo de células L540 e HeLa com 4 a -forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) resulta na saída de Ki-1/57 do núcleo. Ki-1/57 também demonstrou ser um substrato para proteína quinase C (PKC) quando ativada com PMA, e sua fosforilação foi confirmada in vitro e in vivo. Esses dados sugerem que Ki-1/57 está associada com a via de sinalização celular de RACK1/PKC e isto pode ser importante para a regulação de suas funções nucleares. Sua interação com CHD3 e com outras proteínas envolvidas na regulação transcricional, tais como: Topors, Daxx e Tip60, entre outras, sugere que Ki-1/57 pode ter uma função neste contexto funcional. RACK1 interage com p73, um parálogo de p53, inibindo sua ativação transcricional. Nós ainda encontramos que Ki-1/57 também interage com p53 não fosforilada e pode inibir sua ativação transcricional. A estrutura tridimensional da proteína Ki-1/57 é desconhecida, mas nossos estudos espectroscópicos mostraram que a proteína Ki-1/57 é predominantemente constituída por folhas b-pregueadas. Além disso, Ki-1/57(122-413) apagou o sinal do espectro de CD de RACK1 entre 229-300 nm, que é característico de proteínas ricas em triptofanos, e também diminuiu a intensidade de emissão de fluorescência de RACK1. Isso sugere que Ki-1/57 interage com os triptofanos na superfície de RACK1 / Abstract: Ki-1/57, the 57-kDa human protein antigen recognized by the CD30 antibody Ki-1, is a cytoplasmic and nuclear protein, which is phosphorylated on serine and threonine residues upon cell activation. When isolated from the Hodgkin¿s lymphoma analogous cell line L540 Ki-1/57 was co-immunoprecipitated with a Thr/Ser protein kinase activity. It has been also found to interact with hyaluronic acid and has therefore been termed intracellular hyaluronan binding protein 4 (IHABP4). We used the yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with Ki-1/57 and found that Ki-1/57 engages in specific interactions with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3), a nuclear protein involved in chromatin remodeling and transcription regulation, and with the adaptor protein Receptor of Activated Kinase-1 (RACK1). Next, we confirmed these interactions by in vitro and in vivo experiments. Interestingly, the interaction of Ki-1/57 with RACK1 is abolished upon activation of L540 cells with 4a-phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), which results in the phosphorylation of Ki-1/57 and its exit from the nucleus. We demonstrated that Ki-1/57 also co-precipitates with protein kinase C (PKC) when isolated from PMA activated L540 tumor cells and is a substrate for PKC phosphorylation in vitro and in vivo. These events associate Ki-1/57 with the RACK1/PKC pathway and may be important for the regulation of its nuclear functions. Its interaction with chromatin remodeling factors such as CHD3 and other proteins involved in transcriptional regulation including Topors, Daxx and Tip 60 may suggest that Ki-1/57 has also a function in this context and that this function is subject to regulatory events involving the PKC/RACK1 signaling pathway. RACK1 also interacts with the p53 paralogue p73. In that case, the physical binding of RACK1 to p73 can inhibit its transcription activation function. We found out that Ki-1/57 interacts with unphosphorylated p53 and that this binding inhibits p53 transcription activation function. The three-dimensional structure of Ki-1/57 is still unknown but our spectroscopic studies demonstrated that Ki-1/57 consists predominantly of b-sheets. Binding of Ki-1/57(122-413) to RACK1 abolishes its positive ellipticity at 229-300 nm, which is characteristic for tryptophan-rich proteins, and decreases its emission fluorescence. This suggests that surface tryptophans of RACK1 are involved in the interaction with Ki-1/57 / Doutorado / Genetica Humana e Medica / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKC&#948; induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKC&#948 que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKC&#948. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKC&#948; leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKC&#948; leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKC&#948, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKC&#948 na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKC&#948 na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKC&#948. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKC&#948 se da de modo transiente e que apesar da PKC&#948 não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKC&#948 induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKC&#948 é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKC&#948 induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKC&#948 that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKC&#948 targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKC&#948 activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKC&#948 activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKC&#948 that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKC&#948 activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKC&#948, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKC&#948 does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKC&#948 induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.

Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKC&#948; induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKC&#948 que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKC&#948. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKC&#948; leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKC&#948; leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKC&#948, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKC&#948 na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKC&#948 na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKC&#948. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKC&#948 se da de modo transiente e que apesar da PKC&#948 não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKC&#948 induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKC&#948 é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKC&#948 induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKC&#948 that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKC&#948 targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKC&#948 activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKC&#948 activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKC&#948 that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKC&#948 activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKC&#948, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKC&#948 does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKC&#948 induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.